Mrap2敲除的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 根据35U.S.C§119(e)，本申请要求2013年7月10日提交的美国临时申请号61/844， 666的权益，以引用的方式将其内容整体并入本文。
[0003] 政府支持
[0004] 本发明是在由国立卫生研究院授予的基金号NIHP30-HD18655和T32DK07699的联 邦基金的支持下完成。美国政府对本发明享有一定的权利。
[0005] 序列表
[0006] 本申请包含序列表，所述序列表已经以ASCII格式电子提交，并在此以引用的方式 将其整体并入。所述ASCII副本创建于2014年6月27日，命名为068570-078611-PCT_SL.txt， 大小为25,182字节。
技术领域
[0007] 本文所述的技术涉及敲除和转基因动物。
【背景技术】
[0008] 当为了例如食用或育种的目的饲养动物时，相关成本的显著贡献因素是使动物成 熟至所需大小和/或体重所花费的时间。动物越快达到所需的大小和/或体重，饲养动物的 相关成本就越低，并且生产功能性动物(functional animal)消耗的资源越少。畜牧业通常 通过以鼓励快速生长的方式控制饲料、环境和兽医护理，以寻求将这一时间最小化。此外， 动物饲料是使动物得以出售的主要成本，因此，力求提高的"饲料效率(动物生长的重量/所 消耗的食物重量)"，以降低家畜的成本。
【发明内容】
[0009] 如本文所述，本发明人发现，与野生型动物相比，通过抑制动物中的Mrap2的水平 和/或活性，动物以非常快的速率增重。事实上，动物能够比野生型动物更快多达50%到达 成熟成体大小。进而，当限制至较少的饮食时，缺少Mrap2活性的动物能够与野生型动物生 长的同样快。因此，本文描述的是具有Mrap2修饰的细胞、包含这些细胞的动物、以及利用此 类动物以提供动物产品的更高效生产的方法。
[0010] -方面，本文描述的为包含Mrap2基因修饰的非人哺乳动物细胞，其中，该细胞不 表达可检测水平的功能性Mrap2。在一些实施方式中，该修饰包括Mrap2编码序列的缺失。在 一些实施方式中，该修饰包括Mrap2基因外显子3的缺失。在一些实施方式中，该修饰包括 Mrap2跨膜结构域的缺失。在一些实施方式中，该修饰包括Mrap2胞内结构域的缺失。在一些 实施方式中，该修饰包括SEQ ID NO: 1的至少一个氨基酸的突变(或编码此氨基酸的至少一 个核苷酸的突变，例如点突变、SNP等）。
[0011]在一些实施方式中，对于修饰而言，细胞为杂合子。在一些实施方式中，对于修饰 而言，细胞为纯合子。在一些实施方式中，非人哺乳动物细胞属于选自于由猪、奶牛(cow)、 绵羊、兔和山羊所组成的组中的物种。
[0012] 在一些实施方式中，修饰通过CRISPR、TALEN或ZFN核酸酶的作用产生。在一些实施 方式中，修饰通过重组酶的作用产生。在一些实施方式中，重组酶为ere重组酶。在一些实施 方式中，重组酶处于组织特异性启动子的控制下。在一些实施方式中，启动子对神经元或脑 组织而言是特异性的。在一些实施方式中，启动子为Siml启动子。
[0013] 在一些实施方式中，修饰为工程化修饰，例如非天然存在的修饰。本文中使用的 "工程化的"是指人为操作的方面。例如，当通过人为操作将天然状态下未以该顺序连接在 一起的两个以上的序列直接彼此连接为工程化的多核苷酸时，可认为该多核苷酸是"工程 化的"。通过进一步的实例，当改变多核苷酸序列(例如通过缺失）以使该序列与天然发现的 不同时，可认为该多核苷酸为"工程化的"。如本领域技术人员所理解和惯常实践的，即使对 在先的本体(prior entity)进行实际操作，通常仍将工程化的多核苷酸的子代和拷贝称为 "工程化的"。
[0014] -方面，本文描述的为包含本文所述细胞的非人哺乳动物。一方面，本文描述的为 由本文所述细胞组成的非人哺乳动物。
[0015] 一方面，本文描述的为敲除的非人哺乳动物，所述哺乳动物包含Mrap2基因修饰， 其中，所述哺乳动物不表达可检测水平的功能性Mrap 2。
[0016] 在一些实施方式中，修饰包括Mrap2编码序列的缺失。在一些实施方式中，修饰包 括Mrap2基因外显子3的缺失。在一些实施方式中，修饰包括Mrap2跨膜结构域的缺失。在一 些实施方式中，修饰包含Mrap2胞内结构域的缺失。在一些实施方式中，修饰包括SEQ ID NO: 1的至少一个氨基酸的突变(或编码此氨基酸的至少一个核苷酸的突变，例如点突变、 SNP等）。在一些实施方式中，对于修饰而言，哺乳动物为杂合子。在一些实施方式中，对于修 饰而言，哺乳动物为纯合子。在一些实施方式中，非人哺乳动物为选自于由猪、奶牛、野牛 (bison)、马、绵羊、兔和山羊所组成的组中的物种。
[0017] 在一些实施方式中，修饰通过CRISPR、TALEN或ZFN核酸酶的作用产生。在一些实施 方式中，修饰通过重组酶的作用产生。在一些实施方式中，重组酶为ere重组酶。在一些实施 方式中，重组酶处于组织特异性启动子的控制下。在一些实施方式中，启动子对神经元或脑 组织而言是特异性的。在一些实施方式中，启动子为Siml启动子。
[0018] -方面，本文描述的为生产用于屠体(carcass)用途的哺乳动物的方法，所述方法 包括：向本文所述的哺乳动物提供适于物种的食物，以及当所述哺乳动物达到供使用的期 望大小时，将所述哺乳动物屠宰。在一些实施方式中，对哺乳动物进行的屠宰比起野生型的 哺乳动物更早多达80%。在一些实施方式中，对哺乳动物进行的屠宰比起野生型的哺乳动 物更早多达50%。在一些实施方式中，向哺乳动物提供实质上自由取食的饲料。在一些实施 方式中，哺乳动物为猪。用于本文所述方法的哺乳动物的其它非限制性实例包括奶牛、马、 绵羊、山羊、兔和野牛等。
[0019] 在一些实施方式中，对约75天龄至约125天龄的哺乳动物进行屠宰。在其它实施方 式中，对4月龄至8月龄(例如4个月、5个月、6个月、7个月、8个月或其间的任何时间）的哺乳 动物进行屠宰。在一些实施方式中，向哺乳动物提供限制水平的食物。在一些实施方式中， 食物的限制水平为提供至野生型的哺乳动物的水平的约60%至约95%。在一些实施方式 中，食物的限制水平为提供至野生型的哺乳动物的水平的约80%至约95%。在一些实施方 式中，哺乳动物为猪。在替代的实施方式中，哺乳动物为奶牛、马、绵羊、兔、山羊和野牛等。
【附图说明】
[0020] 图IA-图IB描绘了 Mrap2+小鼠的表型。图IA描绘了标准饲料(饲料，上侧面板:雄 性n = 9vs. 28vs. 15，雌性n= 12vs. 18vs. 10)或高脂饮食时(HFD，56天龄-95天龄，下侧面板， 与标准饲料曲线叠加：雄性n = IOvs. 8vs.10,雌性η = 7 vs . 12vs . 7)的Mrap+/+vs .Mrap+A vs.Mrap2+小鼠的体重曲线。对于两种性别而言，标准饲料和高脂饮食时的较大年龄（161 天-175天）与较小年龄（56天-95天）的Mrap +/+和Mrap+/-小鼠的体重曲线均显著不同。*p = 0.02，= 0.001，= 0.0003。图IB描绘了标准饲料饮食时的脂肪蓄积的图。上侧面板： Mrap+Avs.Mrap2-Λ中的白色脂肪组织(WAT)的重量(雄性和雌性，117天龄-122天龄，η分别 为5和4)。左下侧面板:MrapV+vs.Mrap〗+小鼠中的MT重量(雄性和雌性，117天龄-122天 龄，η为5vs. 4)。右下侧面板:MrapvVs.Mrap2+小鼠中的WAT细胞大小(雌性，对来自各小鼠 的50个细胞计量） D*p = 0.009，**p = 0.003，***p = 0.0003，****ρ〈0· 00001D
[0021] 图2Α-图2Β描绘了Mrap2-Λ小鼠中的能量平衡。图2Α描绘了自由取食饲喂的Mrapv+ ν8.ΜΓ&Ρ2_Λ雄性(n= IOvs. 11)和雌性(n = Ilvs. 8)中的累计食物摄入(上侧面板)和体重 (下侧面板）的图。图2Β描绘了自由取食饲喂的Mrap+Z+vs.Mrap2+小鼠的能量消耗的图。上 侦腼板，连续测量3天，雄性(n = 3vs. 4)，雌性(η = 4vs . 3)，30天龄-34天龄。下侧面板:体重 '^.能量消耗，在24小时内积分，雄性(11 = 18￥8.14,30天龄-45天龄），雌性(11 = 16￥8.11，30 天龄-42天龄）^NCOVA分析显示出基因型之间无差异(雄性p = 0.38,雌性p = 0.67)。
[0022] 图3A-图3C描绘了Mrap2和Mc4r之间的相互作用。图3A描绘了示出Siml神经元中的 Mrap2的条件性缺失的电泳凝胶。右上图，通过PCR进行的Cre DNA分析。来自SimlGl:eBAe:: Mrap2f/f小鼠的HT DNA含有Cre(374bp)，但来自Mrap2f/f小鼠的HT DNA不含。分子量标准(M) 在右侧（bp)。左上图，通过PCR进行的Siml&eBAC: :Mrap2f/f和Mrap2f/M、鼠中的Mrap2 DNA分 析。在CX、HT和BS中，两种基因型均含有floxed的完好的Mrap2 DNA(上侧电泳图中314bp，下 侧电泳图中1013bp，分子量标准在左侧）。仅Siml&eBAC: :Mrap2f/f小鼠包含Mrap2Del(400bp， 下侧电泳图），而且仅在HT和BS中，而不在CX中，这与荧光报告基因数据一致（图3A)。无加入 的DNA时（H 2O)，不存在PCR产物。下部，通过RT-PCR进行的SimlCreBAC: :Mrap2f/f和Mrap2f/f小 鼠中的Mrap2 mRNA表达。两种基因型均在CX、HT和BS中表达floxed的完好的Mrap2 mRNA (247bp)。仅Siml&eBAC: :Mrap2f/f小鼠表达Mrap2DelmRNA( 147bp)，并且仅在HT中表达。整体性 Mrap2Del/Del小鼠在全部三个位点均表达Mrap2DelmRNA。图3B描绘了 Mrap2+/+ (雄性η = 6，雌性 n=ll)、Mrap2-Λ (雄性11=11，雌性11 = 7)、]\^&口2"\雄性11 = 8，雌性11=12)和条件性 Siml&eBAG: :Mrap2f/f (雄性η = 8，雌性η = 7)小鼠（全部为133天龄）的体重的图。*p = 0 · 04，** ρ = 0 · 007，= 0 · 0002，##ρ〈0 · 0001。图 3C 描绘了 Mrap2对 Mc4r信号的作用的图。左侧面 板:在单独的CHO细胞、或者用或不用Mrap2或Mrap2敲除构建体Mrap2delE3与Mc4r共转染的 CHO细胞中，暴露至0-1OnMaMSH 5h后的cAMP报告基因活性(CRELuc)的水平(η = 3个/组）。右 侦腼板:这些相同的构建体的cAMP活性，以相对于OnMaMSH而言的0-1 OnMaMSH诱导后的百分 比示出。*p〈0.0001，在相同的[aMSH]下的Mc4r+Mrap2 vs.Mc4r，通过ANOVA得出。对于大部 分数据点，通过标识符(symbo I s)遮盖了误差棒。
[0023] 图4A-图4K示出了Mrap2 mRNA表达和Mrap2-Λ小鼠的生成。图4A描绘了通过RT-PCR 得到的雄性(M)和雌性(F)小鼠的脑和外周组织中的Mrap2(150个碱基对(bp)，上侧面板)和 Mc4r(171bp，下侧面板）的mRNA的凝胶图。图4B描绘了通过用于18s RNA的校正的qRT-PCR， 雄性小鼠组织中的Mrap2 mRNA和Mc4r mRNA相对于它们在下丘脑中的量而言的图形比较。 两种mRNA均主要在脑中表达。图4C描绘了通过原位杂交示出的小鼠脑的冠状缝切面中的 Mrap2 mRNA的表达的图，主要的表达位点位于下丘脑的室旁核(PVN)、视前内侧核(MPN)J^ 桥、外侧网状核大细胞区域(LRNm)，并扩散性地贯穿小脑。图4D描绘了野生型小鼠下丘脑中 的含145bp外显子Ia的次要的Mrap2 mRNA变体的检测。图4E描绘了生成Mrap2-Λ(剔除）小鼠 的策略的示意图。通过同源重组，将包含两侧有FRT位点（空心三角）的新霉素抗性(neo)基 因盒和胸苷激酶(TK)基因以及两侧有IoxP位点（实心三角）的Mrap2外显子3的靶载体并入 129Sv胚胎干细胞的基因组Mrap2基因座中。利用体外Cre介导的切除将外显子3和neo基因 盒移除，以生成Mrap2剔除ES细胞，利用体外Flpe介导的切除将neo基因盒单独移除，以生成 Mrap2 floxed的ES细胞。将ES细胞植入C56BL/6J假孕小鼠中，并将雄性后代与129S6/ SvEvTac雌性育种，以生成具有纯的129背景的Mrap2剔除小鼠或Mrap2 floxed的小鼠。图4F 描绘了Mrap2-Z-小鼠中的下丘脑Mrap2 mRNA。左上面板，Mrap+/+和Mrap2-Z-小鼠中的Mrap2基 因和mRNA的图示。在Mrap2 v-小鼠中，用LoxP位点（三角）替换100个碱基对(bp)的外显子3 (编码跨膜结构域），从而使Mrap2- ΛmRNA(Mrap2Del mRNA)比Mrap+/+mRNA短100个核苷酸。右 上面板:在存在(RT+)或不存在(RT-)逆转录酶的情况下，Mrap2 +A或Mrap2+小鼠中的下丘 脑Mrap2 mRNA或者无 RNA的对照（水）的RT-PCR。由Mrap2-Λ小鼠下丘脑RNA逆转录的cDNA的 RT-PCR为147bp(与247bp长比较）。下侧面板：下丘脑Mrap2 mRNA序列跨越Mrap2+/+小鼠的外 显子2-外显子3连接(左）、或者跨越Mrap2+小鼠（右）的外显子2-外显子4连接。在后者中， 外显子3的跨膜结构域被框外(out-of-frame)的外显子4(编码11个异常氨基酸及其后的终 止密码子）替换。按照出现的顺序，序列分别作为SEQ ID N0.67、SEQ ID N0.69、SEQ ID N0.66和SEQIDN0.68公开。图4G示出了Mrap2-/-小鼠表达正常量的突变的下丘脑Mrap2 mRNA。使用外显子1和外显子2内的引物(P1F、P1R)(不检测Mrap2v_mRNA中的外显子3缺失）， 半定量RT-PCR揭示了Mrap2 +/+和Mrap2-Λ小鼠下丘脑中的Mrap2 mRNA(包括主要的变体1和 次要的变体2的量相似）。图4H描绘了HEK293细胞中的Mrap2 RNA和蛋白的水平。不对细胞进 行转染[TF(-)]，或者利用空载体、Mrap2或Mrap2delE3表达构建体对细胞进行转染，随后分 别进行Mrap2 mRNA和18S rRNA的RT-PCR(左侧面板)或者Mrap2蛋白的western印迹（中间和 右侧面板）。訂Mrap2 cDNA为247bp，突变的Mrap2delE3 cDNA为147bp(如图1所示）。中间面 板的western印迹用针对氨基末端的Mrap2 mAb-NH2作为探针，右侧面板的western印迹用 针对羧基末端的Mrap2 rAb-C00H作为探针。Mrap2蛋白的预测大小为23.7kD，突变的 Mrap2delE3蛋白的预测大小为5.9kD。星号指示Mrap2的迀移位置，水平箭头指示突变的 Mrap2delE3的迀移位置。各印迹右侧为分子量标准(kD)。仅用它们各自的构建体的转染并 在逆转录酶的存在下[RT( + )]对转录自Mrap2和Mrap2delE3 mRNA的cDNA进行检测。通过两 种抗体均检测到Mrap2，但检测不到Mrap2delE3蛋白。图41描绘了幼小的Mrap2 + / + vs .Mrap2+雄性(n = 6vs · 3)和雌性(n = 3vs · 6)小鼠（在第21天断奶（向上的箭头））中的体 重（上侧面板，0天龄-32天龄）和累计食物摄入（下侧面板，23天龄-32天龄）的图。尽管 Mrap2+雄性小鼠具有随着年龄增长而增加重量和食物摄入的趋势，各性别的基因型之间 在体重或食物摄入方面无显著差异。图4J描绘了 Mrap+Z+vs.Mrap2-λ(84天龄，雄性η = 9vs.l5,雌性 n=12vs.l0)的体长的图。*口 = 0.015，**口 = 0.01。图41(描绘了]\^&卩+/+ vs.Mrap2+(雄性n = 35vs.33,雌性n = 34vs.40)小鼠的脂肪量百分比（上侧面板)和无脂肪 重量（lean mass)百分比（下侧面板）的图。*p = O.001，**p = O.0001。
[0024] 图5A-图5S示出了 Mrap2-Λ小鼠的表型。图5A描绘了雄性和雌性Mrap+/+和Mrap2一/一 小鼠的外观的图。左侧面板:标准饲料（175天龄)时的外观。右上图：雌性Mrapv+和Mrap2v- 小鼠（175天龄）的肠系膜脂肪。右下图：雌性Mrap+/+和Mrap2v-小鼠（175天龄）的棕色脂肪组 织(BAT)。图5B描绘了Mrap2 +A和Mrap2-Λ小鼠中的血清瘦素的水平。左侧面板：自由取食饲 喂的 Mrap2+/+vs .Mrap2-Z-雄性(n = 4vs · 6)和雌性(n = 8 vs. 4)小鼠（302天龄-349天龄）D右侧 面板：食物限制、体重匹配的Mrap2+/+vs . Mrap2-Z-雄性（n = 4vs .6,体重= 27.4±0.6g 乂8.24.8±0.28)和雌性(11 =如8.6，体重=21.5±0.68￥8.20.8±0.28)小鼠（135天龄-151 天龄）。邱=0 ·005，林p〈0 ·00001D 图50描绘了Mrap2+/+和Mrap2-Z-雄性(n = 4vs ·6)和雌性(η = 6vs.8)小鼠（88天龄-194天龄）的空腹血清胰岛素水平。各性别的基因型之间无显著差 异。图邪描绘了]\1從口2 +/+和]\^^口2-/-雄性(11 = 4￥8.6)和雌性(11 = 6 vs · 8)小鼠（88天龄-194天 龄）的葡萄糖耐量测试（腹膜内）的结果。各性别的基因型之间无显著差异。图5E描绘了 Mrap2+/+和Mrap2-Λ雄性(n = 4vs.3)和雌性(n = 6vs.7)小鼠（124天龄-178天龄）的早晨、晚 上以及束缚应激(restraint stress)30分钟后的血液皮质酮水平。在全部三种条件下，各 性别的基因型之间无显著差异。图5F描绘了Mrap2+/+vs .Mrap2-Z-雄性(n = 8vs · 8)和雌性(η = 9vs. 10)小鼠（90天龄）中的尿儿茶酚胺排泄。在雄性中，基因型之间的肾上腺素和去甲肾 上腺素显著不同，而在雌性中并不如此。吨=0.02，*吨〈0.006。图56描绘了在22°(3(雄性11 = 4vs · 4，雌性n = 6vs · 3)下和在4°C下18h后（雄性n = 8vs · 7，雌性n = 7vs · 5)，来自Mrap2+/+ vs ·Mrap2+小鼠（3月龄-9月龄）的BAT中的解偶联蛋白（Ucpl)的mRNA含量。*p = 0 · I，#p = 0 · 02，*#p = 0 · 003。图5H描绘了在1600h收集的自由取食的标准饲料饮食饲喂的Mrap2+/+ vs ·Mrap2-Z-雄性小鼠（40天龄，η = 5vs · 6)的下丘脑中的Agrp和Pome mRNA含量。基因型之间 的Agrp mRNA差异显著，而Pome mRNA并不如此。*p = 0·03。图51 描绘了Mrap2+/+vs.Mrap2一Z一 雄性(n = 9vs.7)和雌性(n = 13vs.n)小鼠（42天龄)在4天的期间内平均的食物摄入(上侧 面板)和体重（下侧面板）的图。对于两种性别而言，两种基因型之间的重量差异显著，而食 物摄入并不如此。*p = 〇 · 01，**p = 〇 · 004。图5J描绘了Mrap2+/+vs .Mrap2-Z-雄性（η = 14vs. 19)和雌性(n=18vs. 15)小鼠（84天龄)在4天的期间内平均的食物摄入(上侧面板)和 体重(下侧面板)的图。对于两种性别而言，两种基因型之间的重量差异显著，而食物摄入并 不如此。*p〈〇 · 〇〇〇〇 1。图5K描绘了 42天龄和84天龄的Mrap2+/+和Mrap2-Λ雄性(左侧面板，η = 5vs.4)和雌性(右侧面板，n = 7vs.5)小鼠中的排泄物能量含量的图。就两种年龄而言，各性 别的基因型之间无显著差异。图5L描绘了 34天龄-44天龄的自由取食饲喂的Mrap+/ + vs · Mrap2-Z-雄性(η = I Ovs · 11)和雌性(η = 11 vs · 8)中的小鼠的累计食物摄入(上侧面板)和 重量增加（下侧面板)的图。下侧面板的插图记录了与Mrap+/+小鼠相比，Mrap2 v_小鼠的重量 增加显著更大。图5M描绘了自由取食饲喂的Mrap+/+vs.配对饲喂（pair-fed)(PF)的Mrap2一Z一 雄性(n=10vs. 11)和雌性(n=llvs. 10)小鼠的累计食物摄入(上侧面板)和重量（下侧面 板）的图。图5N描绘了50天龄-72天龄的配对饲喂的Mrap+/+vs.Mrap2+雄性(n = IOvs · 11)和 雌性(n = llvs.10)小鼠的累计食物摄入(上侧面板)和重量增加(下侧面板)的图。下侧面板 的插图记录了与Mrap+/+小鼠相比，Mrap2+小鼠的重量增加显著更大。图50描绘了自由取食 饲喂的Mrap+/+vs · 限制饲喂(RF)的Mrap2+雄性(n = 16vs · 30)和雌性(n = 16vs · 21)小鼠的 累计食物摄入（上侧面板）和重量（下侧面板）的图。在69天龄时（向上的箭头），将10只RF Mrap2-Λ雄性小鼠和7只RF Mrap2-Λ雌性小鼠放出以自由取食饲喂，剩余的继续RF。图5P描 绘了 38天龄-45天龄的Mrap+/+vs.Mrap2-Λ雄性(n = 4vs.4)和雌性(n = 6vs.7)小鼠给予盐水 或MTII(2yg/g体重，i ·p·)后的食物摄入的图。*p = 0·056，**p = 0·019，***p = 0·016，****p 〈0.008。图5Q描绘了27天龄-31 天龄的MrapV+vs.MrapS-A雄性（n = 3vs.5)和雌性（η = 4vs.3)小鼠的呼吸交换率(RER)的图。上侧面板，连续测量3天。下侧面板，在12h的期间内经 积分的测量，日间vs .夜间。图5R描绘了