防控香蕉枯萎病的生物制剂和方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及生物技术领域，具体是涉及一种防控香蕉枯萎病的生物制剂和方法。
【背景技术】
[0002] 香(大)蕉是单子叶植物纲、姜目、芭蕉科、芭蕉属的植物，在世界范围内广为分布， 主要分布于南北炜20°之间的热带亚热带地区，共有130多个国家和地区种植香蕉。香蕉 (Musa spp.)既是重要的经济作物也是重要的粮食作物，是全球仅次于柑橘的第二大水果； 也是位于水稻、小麦、玉米之后的第四大粮食作物(Moffat，1999;黄永红，2011)。由尖孢镰 刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f.sp.cubense)真菌引起的枯萎病(Fusarium wilt)在全球的大面积爆发和流行，已严重威胁香蕉产业并成为制约其可持续发展的主要 因素。目前该病在南太平洋、亚洲、非洲、澳洲、美洲热带、亚热带地区的香蕉种植园中普遍 发生(Butler，2013;Hwang et al.，2004)。在中国广东、广西、福建、云南、台湾和海南等省 (区）等香蕉主产区发生日趋严重。香蕉枯萎病在蕉园的发病率为10%_40%，严重的可达 90%以上，以致蕉园丢荒(刘景梅等，2006)。
[0003] 根据香蕉枯萎病菌系统进化演化分析与致病性实验证明，目前香蕉枯萎病菌分为 3个生理小种，24个营养体亲和群(￥068)(?1〇6以，2006)。其中，1号生理小种$〇〇1)侵染 "大密哈"Gros miche 1、Si lk、Taiwan Latundan、IC2和粉蕉，此小种呈世界性分布;2号生理 小种(Foe 2)侵染煮食蕉，如杂种三倍体Bluggoe，且仅局限在中美洲;4号生理小种(Foe 4) 侵染所有的Cavendish类香蕉、Taiwan Latundan、Gros Michel、Pisang Lilin和Bluggoe (Hwang et al ·，2004;Ploetz，2000 ;Ploetz，2005)。3个生理小种中，以4号生理小种危害性 最大，几乎可以侵染所有蕉种，导致植株枯萎死亡。4号生理小种根据温度的适应性不同可 分为两个生态型：热带4号小种（Tropical race 4, TR4)和亚热带4号生理小种 (Subtropical race 4，STR4)，其中最具有毁灭性的生态型是热带4号小种(Foe TR4)，侵染 当前的香蕉主栽品种Cavendish，其巨大的破坏力引起了广泛的关注(Ploetz，2006)。目前 我国存在1号生理小种和4号生理小种。前者侵染粉蕉，后者侵染粉蕉和香蕉，尤其是热带4 号生理小种，已经严重威胁到我国香蕉产业。
[0004] 香蕉枯萎病菌有三种孢子类型：大型分生孢子、小型分生孢子和厚垣孢子 (Pl〇etz，2000)。香蕉枯萎病是一种土传病害，其孢子通常在土壤中潜伏，适宜条件下从香 蕉的根系侵入球茎或假茎，进入植物维管束组织，通过阻塞水分及养分的供养，最终造成植 株整株枯死。而一旦土壤被香蕉枯萎病菌污染，在缺乏香蕉寄主的情况下，香蕉枯萎病菌也 可以在土壤中存活长达30年之久(Li et al.，2011)，这就为有效地防治香蕉枯萎病带来相 当的难度。而目前香蕉枯萎病的防治办法主要是选育抗病品种、化学防治、农业防治及生物 防治等。尽管做了很多的探索，但到目前为止仍无有效的防控香蕉枯萎病发生的化学药剂， 因此选育优质抗病新品种是最根本、最有效的解决办法(Nel et al.，2007)。然而，香蕉的 栽培品种多为三倍体，通过传统的香蕉杂交育种方法培育新品种十分困难。优良栽培品种 中缺乏高抗种质资源，目前生产上种植的的抗病品种主要是通过筛选体细胞突变体培育而 成，主要有"Formosana"（Hwang et al ·，2004)、"农科一号"（刘绍钦等，2007)和"抗枯5号" (黄秉智等，2009)，这些抗病品种均存在这样或那样的缺点，如"抗枯5号"的抗病性虽好，但 生产周期过长，果穗商品性不好，口感欠佳，经济效益差，不为广大消费者和蕉农所接受。因 此，加强香蕉分子育种工作意义重大。香蕉枯萎病菌自身的发育调控机理不明，制约了香蕉 抗枯萎病分子育种工作的开展。为解决香蕉枯萎病问题，需要对香蕉枯萎病菌的生长、发育 的分子机理进行研究，寻找新的靶标位点，筛选、合成有效的化学或生物防治药物。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一个目的是提供防控香蕉枯萎病的方法。
[0006] 具体的，实现该目的的技术方案如下。
[0007] 一种防控香蕉枯萎病的方法，包括针对香蕉枯萎病菌热带4号生理小种麦角甾醇 生物合成过程中相关蛋白的基因或其相似基因进行基因沉默调控。
[0008] 在其中一个实施例中，所述基因包括相关蛋白的编码基因、该编码基因前端 2000bp内的非编码区基因和/或该编码基因末端2000bp内的非编码区基因；所述相似基因 为在随机的50bp内，与对应的所述编码基因或所述非编码区基因的序列相似度2 80%的基 因。
[0009] 在其中一个实施例中，所述相关蛋白包括3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶 HMG1、C-24固醇还原酶ERG4、C-24固醇甲基转移酶ERG6、细胞色素 P450羊毛留醇C-14a-脱甲 基酶ERG11、羟甲基戊二酸-辅酶A合成酶ERG13、C-4固醇甲基氧化酶ERG25及C-3固醇脱氢酶 ERG26中的至少一种。
[0010] 在其中一个实施例中，所述相关蛋白为C-24固醇甲基转移酶ERG6和/或细胞色素 P450羊毛甾醇C-14a-脱甲基酶ERG11。
[0011] 在其中一个实施例中，所述C-24固醇甲基转移酶ERG6的编码基因序列为SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2。
[0012] 在其中一个实施例中，所述细胞色素 P450羊毛留醇C-14a-脱甲基酶ERG11的编码 基因序列为SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4或SEQ ID N0.5。
[0013] 在其中一个实施例中，所述基因沉默调控包括双链RNA干扰、反义RNA干扰及小分 子RNA干扰中的至少一种。
[0014] 在其中一个实施例中，所述的防控香蕉枯萎病的方法包括如下步骤：
[0015] 从至少一种所述相关蛋白的基因或其相似基因中选取特异性核苷酸序列片段进 行自由串联组合，构建表达载体，所述表达载体为双链RNA干扰载体、反义RNA干扰载体及小 分子RNA干扰载体中的至少一种；
[0016] 将含有所述表达框的表达载体转化香蕉植株，在香蕉植株内组成性的表达双链 RNA、反义RNA或小分子RNA;或者
[0017] 将含有所述表达框的表达载体转化香蕉内生菌或生防菌，再通过所述香蕉内生菌 或生防菌对香蕉植株进行生物防治。
[0018] 本发明利用最新的定量蛋白质组学技术和香蕉遗传转化技术，鉴定和验证了香蕉 枯萎病菌热带4号生理小种早期发育的关键蛋白和重要的代谢途径，研究结果可作为新杀 菌剂的开发和寄主植物诱导基因沉默培育抗病新种质的靶标位点。研究发现麦角留醇生物 合成途径中的相关蛋白的表达与香蕉枯萎病菌热带4号生理小种的发育具有重要的影响， 从而对该相关蛋白的基因或其相似基因进彳丁基因沉默调控，可以有效抑制香焦枯委病菌热 带4号生理小种的发育，从而对香蕉枯萎病防控具有良好的效果。
[0019] 本发明的另一目的是提供防控香蕉枯萎病生物制剂。根据多靶标位点自由组合， 可从上述香蕉枯萎病菌热带4号生理小种的靶标基因所表达的蛋白中，选择单个或多个蛋 白质，设计药物组合，用于香蕉枯萎病的化学防治。也可从上述香蕉枯萎病菌热带4号生理 小种的靶标蛋白的编码基因中，选择单个或多个基因的特异性片段进行自由组合，构建寄 主植物诱导基因沉默的双链RNA干涉载体、反义RNA干扰载体和小分子RNA干扰载体，进行香 蕉遗传转化培育抗香蕉枯萎病新品系，或构建产生双链RNA、反义RNA或小分子RNA的表达载 体，转入香蕉内生菌或生防菌中，用此遗传重组的香蕉内生菌或生防菌进行香蕉枯萎病的 生物防治。应当理解，考虑到编码基因前端的5'非编码区域和末端3'非编码区域都能调节 基因的表达，在上述编码基因前端和末端2000bp内的非编码区域进行基因调控，也属于本 发明的保护范围内。
[0020] 具体的，实现上述目的的技术方案如下。
[0021] -种防控香蕉枯萎病的生物制剂，其活性成分包括针对香蕉枯萎病菌热带4号生 理小种麦角留醇生物合成过程中相关蛋白的基因或其相似基因所构建的双链RNA干涉载 体、反义RNA干扰载体或小分子RNA干扰载体，所述双链RNA干涉载体、反义RNA干扰载体或小 分子RNA干扰载体能导致靶标编码基因沉默。
[0022] 在其中一个实施例中，所述基因包括相关蛋白的编码基因、该编码基因前端 2000bp内的非编码区基因和/或该编码基因末端2000bp内的非编码区基因；所述相似基因 为在随机的50bp内，与对应的所述编码基因或非编码区基因的序列相似度2 80%的基因； 所述编码基因包括序列如SEQ ID NO. 1-SEQ ID N0.5所示的基因中的至少一种。
[0023] 根据上述防控香蕉枯萎病的生物制剂，可进行香蕉遗传转化培育抗香蕉枯萎病新 品系，或进行香蕉内生菌和生防菌遗传转化获取防治香蕉枯萎病的新生防菌，其核苷酸序 列，属于本发明的保护范围内。应当理解，考虑到高度相似的核苷酸序列也能引发基因沉 默，若针对干扰上述基因表达的相似核苷酸序列，即与上述基因的开放阅读框、前端或末端 非编码区核苷酸序列，在随机的50bp内，相似度2 80%的核苷酸序列，也属于本发明的保护 范围内。
【附图说明】
[0024]图1:本发明的实验设计和原理流程图；
[0025]图2:Foc TR4早期生长发育的形态观