具有改变含量的甾体糖苷生物碱的植物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及留体生物碱的生物合成中的关键基因以及具有改变含量的留体生物 碱的遗传修饰植物，特别是具有降低含量的抗营养留体糖苷生物碱的茄果类作物。
【背景技术】
[0002] 植物王国产生通常具有属或科特异性的无数种不同的小化合物。这些分子(称为 次级代谢产物)对于产生其的细胞不是至关重要的，但促进生物体的整体健康。生物碱是次 级代谢产物的一个实例。它们是通常具有杂环结构的低分子量含氮有机化合物。植物中的 生物碱生物合成在发育期间以及响应于应力和病原体而受到严格控制。
[0003] -组广泛的三萜类-生物碱化合物普遍存在于植物中并且源自细胞质甲羟戊酸类 异戊二烯生物合成途径。留体皂苷和留体生物碱是由植物产生的三萜类化合物的两大类 另IJ。甾体生物碱(SA)(也称为"茄属生物碱"）是属于茄科、特别是茄属的众多植物的常见成 分。百合科中的大量物种也产生留体生物碱。
[0004] 据估计在大约1350个物种中，茄属是开花植物的最大属之一，约占茄科中的物种 的一半。不同的结构组成和生物活性以及在包括番前（Solanum lycopersicum)、马铃薯 (Solanum tuberosum)和前子（Solanum melongena)的食用植物中的出现使得SA成为广泛 研究的主题(Eich E.2008.茄科和旋花科-次级代谢产物:生物合成、化学分类学、生物学和 经济意义：手册（Solanaceae and Convolvulaceae-secondary metabolites: biosynthesis,chemotaxonomy,biological and economic significance:a handbook) .Berlin:Springer)〇
[0005] SA由C-27胆甾烷骨架和杂环氮组分组成，它被认为是在细胞质中由胆固醇合成 的。胆固醇转化成氨基醇SA应该需要若干羟基化、氧化和氨基转移反应(Eich 2008,同上）， 并且在大多数情况下进一步糖基化以形成留体糖苷生物碱(SGA)(Arnqvist L.等,2003.植 物生理学(Plant Physiol)131:1792-1799) AGA的低聚糖部分组分直接结合至在氨基醇甾 体骨架的C-30处的羟基(糖苷配基）。所述低聚糖部分包括D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、 D-木糖和L-阿拉伯糖，前两种单糖是主要单元。
[0006] SGA生物合成取决于编码UDP-糖基转移酶(UGT)的基因，其用各种糖部分装饰糖苷 配基(McCue K F等，20054直物科学(Plant Sci.)168:267-273;Itkin Μ等，20114直物细胞 (Plant Cell )23:4507-4525)。番茄糖苷生物碱代谢 1(GLYC0ALKAL0ID METABOLISM 1/ GAME1)糖基转移酶(马铃薯SGT1的同源物）(McCue等，2005,同上)催化氨基醇番茄碱的半乳 糖基化（Itkin等，2011，同上）。
[0007] 留体生物碱在保护植物抵抗广泛多种病原体中起作用，并且因此被称为植物抗菌 素(口1^1:〇&111:;[(^?;[11)(抗微生物化合物）。许多364对包括哺乳动物和人类的生物体是有害 的。当存在于可食用植物部分中时，这些有害的SGA被称为抗营养物质。SGAa-茄碱和α-查茄 碱是马铃薯中的主要有毒物质。这些SGA造成胃肠道和神经系统紊乱，并且在高浓度下可能 对人类是致命的。毒性机制包括细胞膜的破坏和乙酰胆碱酯酶活性的抑制（Roddick J 6.1989.植物化学(？1^丨0(^61^8杜7)28:2631-2634)。为此，超过20011^/1^食用块茎鲜重的 总SGA水平被认为对于人类食用是不安全的。
[0008] 正在尝试阐明留体生物碱的生物合成途径和控制其产生。美国专利No. 5，959，180 公开了编码酶茄啶UDP-葡萄糖葡糖基转移酶(SGT)的来自马铃薯的DNA序列。此外公开了用 于抑制SGT产生并从而降低茄果类植物例如马铃薯中的糖苷生物碱水平的手段和方法。
[0009] 类似地，美国专利No. 7，375，259和7，439，419公开了分别编码酶UDP-葡萄糖:茄啶 葡糖基转移酶（SGT2)和β-茄碱/β-查茄碱鼠李糖基转移酶（SGT3)的来自马铃薯的核酸序 列。此外描述了含有所述序列的重组DNA分子和其用途，特别是，使用所述序列和反义构建 体来抑制SGT2/SGT3的产生并从而降低茄果类植物如马铃薯中的主要留体糖苷生物碱α-查 前碱和α-前碱的水平。
[0010] 本发明的发明人最近鉴定了据推定参与番茄留体生物碱（糖苷生物碱代谢1-3 (GAME 1-3))代谢的三种糖基转移酶。更具体地，GAME 1表达的改变更改了番茄植物中的生殖 和营养部分中的SA分布。表明这些基因部分地通过产生番前四糖部分而参与番前碱(α-番 茄素前体)的代谢(Itkin等，2011，同上）。
[0011]国际专利申请公开No.W0 00/66716公开了用于制造包含编码甾醇糖基转移酶的 DNA序列的转基因生物体或细胞的方法。所述转基因生物体包括细菌、真菌、植物和动物，其 相比于野生型生物体或细胞展现类固醇糖苷、类固醇生物碱和/或留醇糖苷的产生增加。所 合成的化合物可用于制药和食品工业中以及用于保护植物。
[0012] 美国专利申请公开No. 2012/0159676公开了源自属于茄科的植物例如马铃薯 (Solanum tuberosum)的编码糖苷生物碱生物合成酶的基因。此外公开了使用编码所述蛋 白质的基因来制造/检测新颖生物体的方法。
[0013] 美国专利申请公开No. 2013/0167271和国际申请公开No.W0 2012/095843涉及在 甾体皂苷和留体生物碱的生物合成中的关键基因以及用于改变留体皂苷和留体生物碱的 基因表达和产生的手段和方法。
[0014] 在本发明的优先权日期后公布的本发明的发明人的论文描述了参与SGA生物合成 的一系列10种基因。发现所述基因中的5-7种以簇形式存在于7号染色体上，而另外两种相 邻位于重复的基因组区域中的12号染色体上。遵循系统功能分析，已提出了从胆固醇起始 直至连接到番茄SGA糖苷配基的四糖部分的新颖SGA生物合成途径（Itkin M.等，2013科学 (Science)341(6142):175-179)。
[0015] 对于更高食品数量和食品品质提高的需求不断增加。非常需要改善营养品质以及 除去抗营养特性。在作物驯化的过程中，通过育种降低抗营养素的水平。然而，茄果类作物 仍含有显著量的抗营养物质，特别是留体糖苷生物碱。
[0016]因此，需要用于控制茄果类植物中的留体生物碱的产生，用于获得高品质无毒食 品以及用于产生具有有益的、特别是治疗性作用的留体生物碱的手段和方法，并且其将是 非常有利的。
【发明内容】
[0017]本发明涉及在将胆固醇转化成留体糖苷生物碱(SGA)的生物合成途径中的关键基 因和酶，其可用于调节留体生物碱的表达和可用于植物中。特别地，本发明涉及具有降低含 量的抗营养生物碱的转基因茄果类植物。
[0018] 本发明是部分地基于如下出乎意料的发现:SGA在茄果类植物中的生物合成涉及 一系列基因，其中所述基因中的5-7种(取决于植物物种)簇集在7号染色体上并且另外两种 基因相邻位于重复基因组区域中的12号染色体上。发现若干调苄基因（包括转录因子)与成 簇基因共表达。调节阵列内的特定基因的表达能够严格控制留体生物碱和其糖基化衍生物 的产生。出乎意料的是，调节单一基因或转录因子的表达导致番茄植物中的茄碱和/或查茄 碱以及番茄植物中的番茄素的含量显著升高/降低。特别是，本发明现在表明，调节单一转 录因子(本文称为GAME9转录因子)导致对于马铃薯块茎皮中的留体糖苷生物碱的产生的严 格控制。抑制编码2_酮戊二酸依赖性双加氧酶的基因(GAME11)的表达导致番茄植物中α-番 茄素水平的显著降低和若干胆留烷醇型皂苷的累积。
[0019] 根据一个方面，本发明提供一种遗传修饰植物，其包含具有至少一种基因的改变 的表达的至少一个细胞，所述至少一种基因选自编码GAME9转录因子的基因、编码2-酮戊二 酸依赖性双加氧酶(GAME11)的基因、编码碱性螺旋-环-螺旋(BHLH)转录因子的基因或其组 合，其中所述遗传修饰植物相比于相应的未被修饰的植物具有改变含量的至少一种留体生 物碱或其糖基化衍生物。
[0020] 根据某些实施方案，所述遗传修饰植物相比于相应的未被修饰的植物具有编码 GAME9转录因子的基因的改变的表达。根据示例性实施方案，所述GAME9转录因子包含与SEQ ID NO: 1具有至少80%同源性的氨基酸序列。根据一些实施方案，所述GAME9转录因子包含 以SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列。根据其他实施方案，所述GAME9转录因子包含以SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列。
[0021 ] 根据其他实施方案，所述编码GAME9转录因子的基因（本文称为GAME9)包含以SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6中的任一个所示的核酸序列。
[0022]根据其他实施方案，所述遗传修饰植物具有编码2-酮戊二酸依赖性双加氧酶 (GAME11)的基因的改变的表达。根据示例性实施方案，所述2-酮戊二酸依赖性双加氧酶包 含与SEQ ID N0:7具有至少80%同源性的氨基酸序列。根据一些实施方案，所述2-酮戊二酸 依赖性双加氧酶包含以SEQ ID N0:7所示的氨基酸序列。根据其他实施方案，所述2-酮戊二 酸依赖性双加氧酶包含以SEQ ID N0:8所示的氨基酸序列。
[0023]根据其他实施方案，所述编码2-酮戊二酸依赖性双加氧酶的基因（本文称为 GAME11)包含以SEQIDN0:9、SEQIDN0:10、SEQIDN0:11和SEQIDN0:12中的任一个所 示的核酸序列。
[0024]根据其他实施方案，所述遗传修饰植物相比于相应的未被修饰的植物具有编码 BHLH转录因子的基因的改变的表达。根据示例性实施方案，所述BHLH转录因子包含与SEQ ID N0:13具有至少80%同源性的氨基酸序列。根据一些实施方案，所述BHLH转录因子包含 以SEQ ID N0:13所示的氨基酸序列。
[0025] 根据其他实施方案，所述编码BHLH转录因子的基因（本文称为BHLH)包含以SEQ ID N0:14、SEQIDN0:15、SEQIDN0:16和SEQIDN0:17中的任一个所示的核酸序列。
[0026]根据其他实施方案，所述遗传修饰植物相比于相应的未被修饰的植物包含具有编 码GAME9转录因子的基因、编码2-酮戊二酸依赖性双加氧酶的基因和编码(BHLH)转录因子 的基因的改变的表达的至少一个细胞。
[0027] 根据某些实施方案，所述植物是茄果类植物。根据某些示例性实施方案，所述茄果 类植物选自马铃薯、番茄和茄子。
[0028] 根据某些实施方案，至少一种基因或其任何组合在遗传修饰植物中的表达相比于 其在相应的未被修饰的植物中的表达得到抑制，从而所述遗传修饰植物相比于所述相应的 未被修饰的植物包含降低含量的至少一种留体生物碱或其糖基化衍生物。根据某些示例性 实施方案，所述遗传修饰植物包含无毒量的抗营养留体生物碱或其糖基化衍生物。
[0029] 应理解，可通过各种手段来抑制至少一种基因或其组合的表达，所有手段都明确 涵盖于本发明的范围内。根据某些实施方案，可以使用干扰转录和/或翻译的多种分子在基 因组和/或转录物水平下抑制GAME9、GAME 11或BHLH的表达，所述分子包括(但不限于)反义、 siRNA、核糖酶或脱氧核酶分子。还可以使用向至少一种基因中插入突变，包括缺失、插入、 位点特异性突变、锌指核酸酶等，只要所述突变导致基因表达的下调即可。根据其他实施方 案，使用拮抗剂、裂解多肽的酶在蛋白质水平下抑制表达。
[0030] 根据某些示例性实施方案，所述遗传修饰植物是一种转基因植物，其包含含有靶 向选自GAME9、GAME 11、BHLH或其组合的基因的至少一种沉默分子的至少一个细胞。每种可 能性代表着本发明的另一个实施方案。根据一些实施方案，所述至少一种沉默分子选自RNA 干扰分子和反义分子。根据这些实施方案，所述转基因植物相比于非转基因植物包含降低 含量的至少一种留体生物碱或其糖基化衍生物。根据某些实施方案，所述至少一种留体生 物碱是留体糖苷生物碱。根据某些示例性实施方案，所述留体糖苷生物碱选自α-茄碱、α-查 前碱、澳洲前边碱(solmargine)、澳洲前碱(solasonine)、番前素、番前碱和其衍生物。
[0031] 根据一些实施方案，所述转基因植物包含多个细胞，所述细胞包含靶向选自 GAME9、GAME11和BHLH的至少一种基因的沉默分子。根据其他实施方案，大多数植物细胞包 含沉默分子。
[0032] 根据某些实施方案，包含至少一种沉默分子的转基因植物是具有降低含量的选自 茄碱、澳洲茄边碱、澳洲茄碱和查茄碱的至少一种留体糖苷生物碱的茄果类作物。根据某些 实施方案，所述茄果类作物是马铃薯。根据其他实施方案，所述茄果类作物是茄子。
[0033] 根据其他实施方案，包含至少一种沉默分子的转基因植物是具有降低含量的番前 素、番茄碱或其衍生物的番茄植物。
[0034] 可以设计作为GAME9、GAME11和BHLH中的至少一种的靶标的沉默分子是本领域技 术人员已知的。根据某些实施方案，所述沉默分子包含具有与GAME9基因或