具有人源化信号调节蛋白基因的非人动物的制作方法
【专利说明】具有人源化信号调节蛋白基因的非人动物
[0001]对相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年9月23日提交的美国临时申请No. 61 /881261的利益，在此通过 引用将它们的全部公开内容合并入本文。
[0003] 背景
[0004] 免疫系统由几种不同的细胞类型组成，它们涉及多个高度调节的过程，并且它们 一起产生免疫反应，所述免疫反应有效消除外来蛋白。进一步，发现这些相同的免疫细胞具 有自我意识的属性，其，特别是通过调节膜蛋白，调节细胞间相互作用。这种通讯对于这种 生物体的存活是非常重要的，因为这些相同的蛋白被认为是移入物移植的重要决定因素。 但是，还没有体内系统来研究清楚人免疫细胞间相互作用及其调节的分子方面。这种系统 为人造血和免疫系统相关功能的体内测定、新的疗法和疫苗的鉴别提供了来源。
[0005] 发明简述
[0006] 本发明包括认识到构建非人动物以允许改进人造血干细胞的移入是合乎需要的。 本发明还包括认识到具有人源化SIRPa基因和/或另外表达、含有、或产生人或人源化SIRPa 的非人动物是合乎需要的，例如用于人造血干细胞的移入。
[0007] 在一些实施方案中，本发明的非人动物表达SIRPa多肽，所述SIRPa多肽包含人 SIRPa蛋白的胞外部分和小鼠 SIRPa蛋白的胞内部分。
[0008] 在一些实施方案中，人SIRPa蛋白的胞外部分包含相应于SEQ ID N0:4所示的人 SIRPa蛋白的残基28-362的氨基酸。
[0009] 在一些实施方案中，人SIRPa蛋白的胞外部分与表3中所示的人SIRPa蛋白的相应 胞外部分具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至 少85%、至少90%、至少95%或至少98%的同一性百分比。在一些实施方案中，人SIRPa蛋白 的胞外部分与表3中所示的人SIRPa蛋白的相应胞外部分具有100%的同一性(或相同）。
[0010] 在一些实施方案中，本发明的非人动物也不表达内源非人SIRPa蛋白。在一些实施 方案中，非人动物是啮齿动物并且也不表达内源啮齿动物SIRPa蛋白。在一些实施方案中， 非人动物是小鼠并且也不表达具有表3所示序列的内源小鼠 SIRPa蛋白。
[0011]在一些实施方案中，本发明提供包含SIRPa基因的非人动物，所述SIRPa基因包含 与非人SIRPa启动子可操作连接的人SIRPa基因的外显子2、3和4。
[0012] 在一些实施方案中，本发明的非人动物的SIRPa基因包含非人SIRPa基因的外显子 1、5、6、7和8〇
[0013] 在不同的实施方案中，本发明的非人动物是啮齿动物。在一些特定的实施方案中， 本发明的啮齿动物选自小鼠或大鼠。
[0014] 在一些实施方案中，本发明提供由本文所述的非人动物的基因编码的SIRPa多肽。
[0015] 在一些实施方案中，本发明提供从本文所述的非人动物分离的细胞或组织。在一 些实施方案中，细胞选自淋巴细胞(例如B细胞或T细胞）、骨髓细胞(例如巨噬细胞、嗜中性 粒细胞、粒细胞、骨髓树突细胞和肥大细胞)和神经元。在一些实施方案中，组织选自脂肪、 膀胱、脑、乳房、骨髓、眼、心、肠、肾、肝、肺、淋巴结、肌肉、胰腺、血衆、血清、皮肤、脾、胃、胸 腺、睾丸、卵和/或它们的组合。
[0016] 在一些实施方案中，本发明提供分离的小鼠细胞或组织，其基因组包括SIRPa基 因，所述SIRPa基因编码与小鼠 SIRPa蛋白的胞内部分连接的人SIRPa蛋白的的胞外部分。在 一些实施方案中，本发明的SIRPa基因与小鼠 SIRPa启动子可操作地连接。在一些实施方案 中，本发明的SIRPa基因包含人SIRPa基因的外显子2、3和4。
[0017] 在一些实施方案中，本发明提供非人胚胎干(ES)细胞，其基因组包含本文所述的 SIRPa基因。在一些实施方案中，ES细胞包含与非人SIRPa启动子可操作连接的人SIRPa基因 的外显子2、3和4。在一些特定的实施方案中，ES细胞是啮齿动物ES细胞。在一些实施方案 中，本发明的非人胚胎干细胞是小鼠或大鼠胚胎干细胞。
[0018] 在一些实施方案中，本发明提供非人胚胎，所述非人胚胎含有包含本文所述的 SIRPa基因的非人胚胎干细胞，由包含本文所述的SIRPa基因的非人胚胎干细胞制备，由其 获得或由其产生。在一些实施方案中，本发明的非人胚胎是啮齿动物胚胎。在一些实施方案 中，本文所述的啮齿动物胚胎是小鼠或大鼠胚胎。
[0019] 在一些实施方案中，本发明提供制备表达来自内源SIRPa基因座的SIRPa蛋白的非 人动物的方法，其中SIRPa蛋白包含人序列，所述方法包括用包含编码全部或部分人SIRPa 蛋白的核苷酸序列的基因组片段靶向非人ES细胞中的内源SIRPa基因座；获得包含内源 SIRPa基因座的改造的非人ES细胞，所述内源SIRPa基因座包含所述人序列；以及，使用所述 改造的ES细胞产生非人动物。
[0020] 在一些实施方案中，所述核苷酸序列包含人SIRPa基因的外显子2、3和4。在一些实 施方案中，所述核苷酸序列包含人SIRPa基因的外显子2、3和4,所述人SIRPa基因具有与表3 中所示的人SIRPa基因至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少 80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%相同的序列。
[0021 ]在一些实施方案中，所述核苷酸序列编码人SIRPa蛋白的氨基酸残基28-362。在一 些实施方案中，所述核苷酸序列编码人SIRPa蛋白的氨基酸残基28-362,所述人SIRPa蛋白 具有与表3中所示的人SIRPa蛋白至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少 75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%相同的序列。
[0022] 在一些实施方案中，本发明提供了提供小鼠的方法，该小鼠的基因组包括编码与 小鼠 SIRPa蛋白的胞内部分连接的人SIRPa蛋白的胞外部分的SIRPa基因，所述方法包括改 造小鼠的基因组，使其包含编码与小鼠 SIRPa蛋白的胞内部分连接的人SIRPa蛋白的胞外部 分的SIRPa基因，由此提供所述小鼠。在一些实施方案中，SIRPa基因是本文所述的SIRPa基 因。在一些实施方案中，SIRPa基因包含人SIRPa基因的外显子2、3和4。
[0023] 在一些实施方案中，本发明提供将人细胞移入到小鼠中的方法，所述方法包括以 下步骤:提供小鼠，该小鼠的基因组包含编码与小鼠 SIRPa蛋白的胞内部分连接的人SIRPa 蛋白的胞外部分的SIRPa基因；并将一个或多个人细胞移入到小鼠中。在一些特定的实施方 案中，所述方法进一步包括测定一个或多个人细胞在小鼠中的移入的步骤。在一些特定的 实施方案中，测定步骤包括将一个或多个人细胞的移入与在一个或多个野生型小鼠中的移 入相比较。在一些特定的实施方案中，测定的步骤包括将一个或多个人细胞的移入与在一 个或多个其基因组不包含SIRPa基因的小鼠中的移入相比较，所述SIRPa基因编码与小鼠 SIRPa蛋白的胞内部分连接的人SIRPa蛋白的胞外部分。
[0024] 在一些实施方案中，人细胞是造血干细胞。在一些实施方案中，人细胞被静脉内移 植。在一些实施方案中，人细胞被腹膜内移植。在一些实施方案中，人细胞被皮下移植。
[0025] 在一些实施方案中，本发明提供一种方法，其包括以下步骤:提供一个或多个细 胞，所述细胞的基因组包括编码与小鼠 SI RPa蛋白的胞内部分连接的人SI RPa蛋白的胞外部 分的SIRPa基因；将所述一个或多个细胞与标记的底物温育;并测量所述一个或多个细胞对 标记的底物的吞噬作用。在一些实施方案中，细胞是小鼠细胞。
[0026] 在一些实施方案中，底物是荧光标记的。在一些实施方案中，底物用抗体标记。在 一些实施方案中，底物是一个或多个红细胞。在一些实施方案中，底物是一个或多个细菌细 胞。
[0027] 在一些实施方案中，本发明提供一种方法，其包括以下步骤:提供小鼠，该小鼠的 基因组包括编码与小鼠 SIRPa蛋白的胞内部分连接的人SIRPa蛋白的胞外部分的SIRPa基 因；将该小鼠暴露于抗原;并测量小鼠的一个或多个细胞对抗原的吞噬作用。在一些实施方 案中，暴露的步骤包括将小鼠暴露于荧光标记的抗原。在一些实施方案中，暴露的步骤包括 将小鼠暴露于一个或多个包含抗原的细胞。在一些实施方案中，暴露的步骤包括将小鼠暴 露于一个或多个包含抗原的人细胞。在一些实施方案中，暴露的步骤包括将小鼠暴露于一 个或多个包含抗原的细菌细胞。
[0028]在不同的实施方案中，本发明的SIRPa基因包含人SIRPa基因的外显子2、3和4。在 不同的实施方案中，本发明的人SIRPa蛋白的胞外部分包含相应于表3所示的人SIRPa蛋白 的残基28-362的氨基酸。在不同的实施方案中，本发明的SIRPa基因与小鼠 SIRPa启动子可 操作地连接。
[0029] 在一些实施方案中，本发明提供由本发明所述的方法可获得的非人动物。在一些 特定的实施方案中，本发明的非人动物不以可检测到的水平表达内源SIRPa蛋白的胞外部 分。
[0030] 在一些实施方案中，本发明提供鉴别或验证药物或疫苗的方法，所述方法包括将 药物或疫苗递送到本文所述的非人动物中，并监测对该药物或疫苗的一种或多种免疫反 应、该药物或疫苗的安全性状况或它们对疾病或病况的效果的步骤。在一些实施方案中，监 测安全性状况包括确定非人动物是否由于递送该药物或疫苗而表现出副作用或不良反应。 在一些实施方案中，副作用或不良反应选自发病、死亡、体重改变，一种或多种酶的水平(例 如肝)的改变、一个或多个器官的重量的改变、功能丧失(例如感觉、运动、器官等）、对一种 或多种疾病的易感性增加、对非人动物基因组的改变、食物消耗的增加或减少以及一种或 多种疾病的并发症。
[0031] 在一些实施方案中，本发明提供本发明的非人动物在开发用于医药(例如用作药 剂)的药物或疫苗中的用途，
[0032] 在一些实施方案中，本发明提供本文所述的非人动物用于评价靶向人细胞的治疗 药物的效力的用途。在不同的实施方案中，给本发明的非人动物移植人细胞，并给动物施用 靶向这种人细胞的候选药物。通过在施用药物之后监测非人动物中的人细胞，确定药物的 效力。
[0033] 在不同的实施方案中，本发明的非人动物是啮齿动物，优选是小鼠或大鼠。
[0034]如本申请中所使用的，术语"约（about)"和"大致(approximately)"等同使用。本 申请中使用的用或不用约/大致修饰的任何数值都覆盖了本领域普通技术人员所理解的任 何正常波动。
[0035] 在下述的详细描述中，本发明的其它特征、目的和优点是显而易见的。但是，应当 理解，虽然详细描述表明了本发明的实施方案，但它仅仅是以举例说明的方式给出的，并非 是限制。根据详细描述，本发明范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员来说将变得 显而易见。
[0036] 附图简述
[0037] 本文包括的附图仅仅是为了举例说明的目的，而非限制。
[0038]图1显示内源鼠 SIRPa基因（上部）的简图，但并非成比例的，其中每一个外显子被 编号。人源化内源SIRPa基因（下部）显示含有人SIRPa基因的外显子2-4和新霉素选择盒 (Ub-Neo)，其侧翼具有位点特异性重组酶识别位点（例如ΙοχΡ)。人SIRPa基因的外显子2-4 的靶向插入获得表达人源化SIRPa基因的内源基因，所述人源化SIRPa基因具有相应于人 SIRPa蛋白的胞外域。
[0039] 图2显示野生型和人源化SIRPa基因杂合小鼠的SIRPa表达的覆盖(overlay)。
[0040] 图3显示移入⑶34+细胞的不同小鼠株中⑶45+细胞的百分比。
[0041 ] 图4显示移入⑶34+细胞的不同小鼠株中⑶45+⑶3+细胞的百分比。
[0042] 图5显示移入⑶34+细胞的不同小鼠株中⑶45+⑶19+细胞的百分比。
[0043] 图6显示在移入hCD34+的SIRPaBRG小鼠中，Ab 1以剂量依赖的方式抑制Raji肿瘤 的生长。在肿瘤植入后第3、6、9、13、16、20、23、27、30和34天测量1^於肿瘤体积。给出了个体 动物的数据(A-D图）。在第0天给移入hCD34+的SIRPaBRG小鼠皮下施用2xl0 6个Raji肿瘤细 胞。对照组所接受的没有抗体(载体对照）(A图）。对于实验组，在第0天对小鼠通过腹膜内给 药进行治疗，给予0.4mg/kg的非结合性对照Ab(对照Ab5) (B图），或0.4mg/kg(C图）或 0.04mg/kg(D图）的Ab 1，然后在研究期限内每周两次给药。所有个体测试组的综合数据显 示在图7中。
[0044] 图7显示在移入hCD34+的SIRPaBRG小鼠中，与对照相比，Ab 1显著抑制Raji肿瘤的 生长。数据表示来自每组n = 4-5只小鼠的综合数据，如图6所示。数据用平均值(SEM)表示， 并使用方差分析(AN0VA)和事后检验进行分析，以检查显著效果（用于两因素方差分析的 Tukey's检验）。载体对照组、对照Ab 5组和Ab 1 0.4mg/kg组中的一只小鼠由于早期死亡而 被排除在该综合图之外，以通过双因素 AN0VA分析数据。
[0045] 图8显示在移入hCD34+的SIRPaBRG小鼠中，Ab 1不影响体重。在肿瘤植入后第3、6、 9、13、16、20、23、27、30和34天测量体重。测量个体动物的数据(4-0图）。在第0天给移入 hCD34+的SIRPaBRG小鼠皮下施用2x106个Raj i肿瘤细胞。对照组所接受的没有抗体(载体对 照）(A图）。对于实验组，在第0天对小鼠通过腹膜内给药(IP dose)进行处理，给予0.4mg/kg 的IgGl非结合性对照Ab 5(B图），或0.4mg/kg(C图）的Ab 1或0.04mg/kg(D图）的Ab 1，然后 在研究期限内每周两次给药。
[0046] 定义
[0047] 本发明不限于所描述的具体方法和实验条件，因为这些方法和条件可以变化。还 应当理解，本文所使用的术语仅仅是为了描述具体实施方案，不是限制性的，因为本发明的 范围由权利要求定义。
[0048]除非另有定义，本文使用的所有术语和短语包括该术语和短语在本领域中所具有 的含义，除非明确给出相反说明或者从使用该术语和短语的上下文中明确表现出是相反含 义。虽然在实施或测试本发明时可以使用与本文所述类似或等同的任何方法和材料，现在 描述具体的方法和材料。提及的所有出版物在此通过引用的方式合并入本文。
[0049]在本文中应用在感兴趣的一个或多个值上的术语"大致"，指与所述参考值类似的 值。在特定的实施方案中，术语"大致"或"约"指落入所述参考值任一方向（大于或小于）的 25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、 5 %、4 %、3 %、2 %、1 %或更小的值的范围（除了这些数字会超过可能值的100 %的情况）。
[0050] 本文中所使用的术语"生物活性"指在体外或体内（例如在生物体中），在生物系统 中具有活性的任何试剂的特性。例如，当在生物体中时，在该生物体中具有生物学作用的试 剂被视为是有生物活性的。在特定的实施方案中，如果蛋白质或多肽具有生物学活性，该蛋 白或多肽的具有至少一种该蛋白或多肽的生物活性的部分通常被称为"生物活性"部分。
[0051] 术语"可比的"，如本文中所使用的，指两种或更多种试剂、实体、情况、条件设置 等，它们可以彼此不相同，但是足够相似，以允许在它们之间进行比较，以使得可以根据所 观察到的差异或相似性合理地得到结论。本领域技术人员应当理解，结合上下文，对于两种 或更多种试剂、实体、情况、条件设置等来说，在任何给定的环境中需要何种相同程度才能 被视为是可比的。
[0052] 本文中所使用的描述保