4-松油醇型互叶白千层组培继代增殖方法及其培养基的制作方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于互叶白千层组织培养育苗技术领域，尤其涉及一种4-松油醇型互叶白 千层组培继代增殖方法及其培养基。
【背景技术】
[0002] 互叶白千层(Melaleuca alternifolia Linn)系桃金娘科(Myrtaceae)白千层 (Melateuca)属植物，俗称茶树，常绿灌木至小乔木，原产于澳大利亚东部的昆士兰州和新 南威尔士北部。由于互叶白千层枝叶中含有α-松油烯、桉叶素、γ-松油烯、4-松油醇等挥发 性成分，长期以来作为香料植物在澳洲广为种植。不同生化类型的互叶白千层油价格差异 大，用途也不同；4-松油醇型互叶白千层油，就是常说的茶树油，价值最高;桉叶素型互叶白 千层油次之;其他两种类型利用价值不高，属淘汰产品。20世纪90年代初，由于认识到茶树 油的重要商业价值，我国开始引进互叶白千层，陆续在广东、广西、福建、海南、云南、贵州等 地大面积种植。
[0003] 茶树油为无色至淡黄色透明油状液体，具有令人愉快的豆蔻气味，是公认的优良 天然芳香剂、抗菌剂、防腐剂，2002年被收入欧洲和英国药典。当前，茶树油在农用杀菌剂、 日用卫生制品、皮肤保健品、化妆品、食品香料、药品等行业中已开始广泛试用或应用。目 前，国际上对茶树油的需要量极大，价格稳定，国内市场的需求量也在不断增长。种植和加 工4-松油醇型互叶白千层已成为一个新兴产业，做为一个短平快的项目可帮助林农脱贫致 富。此外，该树种还可用作绿化，因此其种植集经济效益、社会效益和生态效益于一身。
[0004] 为满足茶树油市场需求，4-松油醇型互叶白千层的种植面积不断扩大，对优良种 苗的迫切需求随之而来。互叶白千层种子小，发芽率仅10%，且产量低，难以满足生产的需 要。同时，种子苗个体间遗传分化大，单株生物量，精油含量和成分参差不齐，从而制约了精 油生广量的提尚。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种增殖周期短、繁殖效果好、生产成本低的4-松油醇型互叶白千层组培继代增殖方法及其培养基，所得4-松油醇型互叶白千层组培苗遗 传性状优良稳定。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案:4_松油醇型互叶白千层组培培 养基为初代诱导培养基，该培养基的配方为改良MS+6-BA 2.5mg · I/1-蔗糖30000mg · I/k 琼脂3000mg · L-1。
[0007] 4-松油醇型互叶白千层组培培养基为继代增殖培养基，该培养基的配方为改良MS +6-BA 1.5~2.0mg · L-hNAA 0.6~l.Omg · L-4蔗糖30000mg · L-4琼脂3500mg · L-、
[0008] 改良MS培养基的组成为：
[0010] 使用上述组培培养基的4-松油醇型互叶白千层组培继代增殖方法，选择4-松油醇 型互叶白千层优良单株进行伐粧或者环割促萌，采集萌芽条，先后经初代诱导培养基和继 代增殖培养基培养。
[0011] 上述4-松油醇型互叶白千层组培继代增殖方法，包括以下步骤：
[0012] 〈1>优良单株的选择；
[0013] 〈2>初始芽的获取；
[0014] 〈3>芽器官的继代增殖培养。
[0015] 步骤〈1>按以下操作进行:选择互叶白千层实生林内高生物量、高含油率的优良单 株，其精油指标达到"茶树油"国际标准IS04730-2004。
[0016] 步骤〈2>按以下操作进行:在前一年的11月~12月，对选择出的优良单株进行伐粧 或者环割促萌；当年采集萌芽条，去除叶片，剪切成3cm~6cm的小段，酒精、升汞消毒处理， 而后无菌水冲洗，接种到初代诱导培养基上。
[0017] 步骤〈3>按以下操作进行:待初代芽长度M.5cm时，转入继代增殖培养;芽体转入 继代增殖培养基后，平摊在培养基上，芽体部分压入培养基中。
[0018] 初代诱导培养或继代增殖培养的培养条件为28~30 °C，1500~2500LX，每天光照 12~14h〇
[0019] 为满足对4-松油醇型互叶白千层优良种苗的需求以供给大规模栽培，发明人在优 良单株选择的基础上，探索通过组培快繁生产大量遗传性状一致的4-松油醇型互叶白千层 优质苗，克服了组培技术的关键环节一一继代增殖，从而建立了一种4-松油醇型互叶白千 层组培继代增殖方法，并研制了相应的组培培养基。该法选择4-松油醇型互叶白千层优良 单株进行伐粧或者环割促萌，采集萌芽条，先后经特定设计的初代诱导培养基和继代增殖 培养基培养。实验表明，应用本发明可以提高芽器官繁殖系数(达5.7~7.4)，缩短芽器官继 代增殖周期(仅需30d)，增加有效芽数(5.2~6.8个），从而降低4-松油醇型互叶白千层组培 产业化育苗中的生产成本；由于外植体采自4-松油醇型互叶白千层优良单株，其组培苗保 持了母本优良的遗传性状，使白千层种苗达到良种化和无性系化，可增加单位面积的生物 量和产油量，提高白千层林分的经济效益和生态效益。
【具体实施方式】
[0020]以下各例中，初代诱导培养或继代增殖培养的培养条件为28~30°C，1500~ 2500LX，每天光照12~14h。改良MS培养基的组成为：
[0022] 实施例1
[0023] 〈1>优良单株的选择
[0024]选择互叶白千层实生林内高生物量、高含油率的优良单株，其精油指标达到"茶树 油"国际标准IS04730-2004,其4-松油醇含量>35%，1，8_桉叶素含量<5%。
[0025] 〈2>初始芽的获取
[0026] 2.1、外植体的采集
[0027]在优良单株选出的基础上，在前一年的11月~12月，对选择出的4-松油醇型互叶 白千层优良单株进行伐粧或者环割促萌(割树周长的1/2)，割伤至韧皮部。萌芽条生长至30 ~40cm时，于晴天午后采集接种。
[0028] 2.2、外植体消毒
[0029] 将采回的枝条去除叶片后，用清水将附着于枝条表面的泥土等污染物清洗干净， 再用沾有肥皂粉或洗洁精的软毛刷进行刷洗，后用去离子水清洗3次，剪切成3cm~6cm的小 段。用75%乙醇浸泡灭菌30s，蒸馏水冲洗3次后置于超净台，将0.1%HgCl 2倒入装有外植体 的瓶中，以浸泡的方式静置5min，用无菌水冲洗3次;然后再倒入0.1 %HgCl2，以振荡的方式 进行灭菌处理3min，最后用无菌水冲洗3次。
[0030] 2.3、茎段的初始培养
[0031]将消毒好的茎段接种到初代诱导培养基上进行诱导培养。培养lOd后腋芽开始萌 动，培养30d芽高3~5cm时，把茎段剪下进行丛生芽诱导。经过30d的培养，每个外植体形成 一个或多个无菌初始芽，用于互叶白千层芽器官继代增殖培养。
[0032]初代诱导培养基配方为改良MS+6-BA2.5mg · L-b蔗糖30000mg · L-b琼脂 3000mg · L-、
[0033] 〈3>芽器官的继代增殖培养
[0034] 待无菌初代芽长度2 1.5cm时，选取生长较健壮的转入继代增殖培养，初代芽长度 <1.5cm，则待其继续生长，待长度2 1.5cm再转入继代增殖培养;初代芽较长的，可剪切为 几段，每段长度2 1.5cm;分段或者不分段的芽体转入继代增殖培养基后，均平摊在培养基 上，芽体部分压入培养基中，以便其吸收营养;芽与芽之间不交叉，不重叠，以免先长起来的 芽将上面的芽顶起，导致其吸收不到营养而死亡。
[0035] 继代增殖培养基配方为改良MS+6-BA1.5mg · L-i+NAAO.emg · L-4蔗糖30000mg · L -工+琼脂3500mg · L-、
[0036] 经过30d培养，增殖系数达到5.7,有效芽5.2个(有效芽指高度2 1.0cm，生长健壮 的芽）。
[0037] 实施例2
[0038] 〈1>优良单株的选择
[0039] 选择互叶白千层实生林内高生物量、高含油率的优良单株，其精油指标达到"茶树 油"国际标准IS04730-2004,其4-松油醇含量>35%，1，8_桉叶素含量<5%。
[0040] 〈2>初始芽的获取
[00411 2.1、外植体的采集
[0042]在优良单株选出的基础上，在前一年的11月~12月，对选择出的4-松油醇型互叶 白千层优良单株进行伐粧或者环割促萌(割树周长的2/3 )，割伤至韧皮部。萌芽条生长至30 ~40cm时，于晴天午后采集接种。
[0043] 2.2、外植体消毒
[0044] 将采回的枝条去除叶片后，用清水将附着于枝条表面的泥土等污染物清洗干净， 再用沾有肥皂粉或洗洁精的软毛刷进行刷洗，后用去离子水清洗4次，剪切成3cm~6