微生物的受控生长的制作方法

微生物的受控生长的制作方法
【专利说明】微生物的受控生长
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求于2013年8月19日提交的美国临时申请序号61 /867，510的权益，在此 将其以引用的方式整体并入。
[0003] 序列表参考
[0004] 本申请与电子格式的序列表一同提交。所述序列表以创建的最后在2014年7月30 日保存的名为20140814SGU-001-PCT SEQLIST.TXT的文档提交，其大小为380，083字节。将 电子形式的序列表中的信息以引用的方式整体并入本文。
[0005] 背景
[0006] 从人类历史的开端起，人类已经使用微生物有机体来产生产品，例如在加工食物 如乳酪、啤酒和葡萄酒中使用微生物有机体。在过去的几个世纪里，通常通过控制发酵条件 或鉴定微生物有机体的表型特征，对微生物有机体介导的生产过程进行了研究并进行放 大。
[0007] 目前，许多产品都是利用涉及微生物有机体的生产过程生产的。在实验室，以及在 一些药物制造过程中，可以在无菌、受控的环境中培养微生物有机体，包括基因工程化的微 生物有机体。另一方面，用于涉及微生物的多种工业生产过程的给料不是无菌的，并且可能 含有多种微生物菌株和物种。由此，用于实验室和制药过程的基因工程化的微生物不一定 适用于如工业生产过程的生产过程，所述工业生产过程涉及利用给料或者在可能污染培养 物的环境中被暴露于其它微生物，以及还可能涉及改变环境条件。本文描述了这样的微生 物，其被工程化以控制它们自身的生长和其它微生物的生长和/或以响应它们环境中的改 变。此类微生物适合在未经灭菌的、较不严格的受控给料中生长。此类微生物可用于在一系 列不同的给料和环境中，稳定、一致地产生期望的产品。
[0008] 领域
[0009] 本文的实施方案一般地涉及微生物生长的控制。更具体而言，本文的一些实施方 案涉及被工程化以用于响应培养环境中其它微生物和/或条件的可调节生长的微生物以及 制备和利用此类工程化的微生物的方法。
[0010] 概述
[0011] 提供的本文公开的一个实施方案包括第一微生物细胞，其包含编码控制第二微生 物细胞生长的分泌的细菌素的核酸，以及赋予抗所述分泌的细菌素抗性的核酸，其中将所 述第一微生物细胞已被基因工程化以允许调节赋予抗细菌素抗性的核酸的表达或活性。根 据该实施方案的一些方面，将赋予抗细菌素抗性的核酸的表达或活性降低至引起所述第一 微生物细胞被所述细菌素中和的水平，如果第一微生物细胞从期望的生长环境中释放的 话。根据该实施方案的一些方面，将所述第一微生物细胞基因工程化以生产期望的产物。根 据该实施方案的一些方面，进一步选择分泌的细菌素以维持其中第一微生物细胞产生所期 望的产物的培养中的至少一项条件。根据该实施方案的一些方面，所述培养包含至少一种 入侵的微生物有机体。根据该实施方案的一些方面，所述培养的至少一项条件包括控制第 二微生物细胞的生长，其中所述第二微生物细胞是所述培养的常见污染。根据该实施方案 的一些方面，第二微生物细胞是与第一微生物细胞不同的菌株、物种或属。根据该实施方案 的一些方面，微生物细胞还包含编码控制第三微生物细胞生长的第二分泌的细菌素的核酸 以及赋予抗分泌的第二细菌素抗性的核酸，并且所述第一微生物细胞还已被基因工程化以 允许调节赋予抗细菌素的抗性的核酸的表达或活性。根据该实施方案的一些方面，所述细 菌素杀死第二微生物细胞。根据该实施方案的一些方面，所述细菌素降低了第二微生物细 胞的生长速率。根据该实施方案的一些方面，所述细菌素阻止了第二微生物细胞的生长。根 据该实施方案的一些方面，赋予抗细菌素抗性的核酸的转录受可调节的启动子的控制。根 据该实施方案的一些方面，由赋予抗细菌素抗性的核酸编码的多肽的活性是可调节的。根 据该实施方案的一些方面，编码细菌素的核酸位于微生物细胞的染色体上。根据该实施方 案的一些方面，赋予抗细菌素抗性的核酸位于质粒上。根据该实施方案的一些方面，编码细 菌素的核酸位于微生物细胞的染色体上，并且赋予抗细菌素抗性的核酸位于质粒上。根据 该实施方案的一些方面，编码细菌素的核酸和赋予抗细菌素抗性的核酸位于一个或多个质 粒上。根据该实施方案的一些方面，第一微生物细胞选自：细菌、酵母和藻类，例如光合微 藻。
[0012] 本文描述的另一实施方案包括控制培养基中的第二微生物细胞生长的方法，其中 所述方法包括在第一微生物细胞产生足以控制第二微生物细胞生长的水平的细菌素的条 件下，在包含第二微生物细胞的培养基中培养如本文所述的第一微生物细胞。根据该实施 方案的一些方面，将所述培养连续维持至少30天，例如至少30、35、40、45、50、55、60、65、70、 75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、 450或500天。根据该实施方案的一些方面，所述方法还包括检测培养基中的至少一种变化， 以及响应所述变化而将第一微生物细胞再工程化，从而产生足以控制第三微生物细胞生长 的水平的第二细菌素，所述变化包括第三微生物细胞的水平或活性的存在或增加。
[0013] 提供的本文公开的另一实施方案包括检测培养物中的分子的存在、不存在或其量 的方法。所述方法可以包括在受遗传上可调控的启动子控制的条件下，培养包含细菌素的 第一基因工程化微生物细胞。在一些实施方案中，所述可调节的启动子受上述分子调节，以 使(a)所述可调节的启动子在所述分子存在的情况下驱动转录，而在不存在所述分子的情 况下不驱动转录;或(b)所述可调节的启动子在所述分子不存在的情况下驱动转录，而在所 述分子存在的情况下不驱动转录。所述方法可以包括从培养物中分离一定量的第一微生物 细胞的基因组核酸。所述方法可以包括由所述一定量的基因组核酸检测第一微生物细胞特 有的核酸序列的存在、不存在或其量。根据该实施方案的一些方面，所述方法还包括将第一 微生物细胞特有的核酸序列的量与参考核酸序列的量进行比较。
[0014] 本文公开的另一实施方案包括基因工程载体，所述载体包含赋予针对细菌素的抗 性的核酸，其中所述核酸的表达或活性被配置为响应给料中组分的存在、水平或不存在而 改变。根据该实施方案的一些方面，所述载体还包含编码细菌素的核酸。根据该实施方案的 一些方面，所述载体还包含编码期望的产物的核酸。
[0015] 本文公开的另一实施方案包括试剂盒，其可以包含多种基因工程化微生物有机体 菌株，其中每一菌株已被基因工程化以允许调节赋予针对不同的细菌素的抗性的核酸的表 达或活性。
[0016] 本文公开的另一实施方案包括鉴定调节工业培养基中的至少一种微生物细胞生 长的至少一种细菌素的方法，其中所述方法包括将所述工业培养基与含有所述至少一种细 菌素的培养基或组合物接触；以及确定所述至少一种细菌素对至少一种微生物细胞的生长 是否有期望的作用。根据该实施方案的一些方面，所述方法包括将所述工业培养基与由如 本文所述的第一微生物细胞产生的至少一种细菌素接触。根据该实施方案的一些方面，所 述由第一微生物细胞产生的至少一种细菌素存在于从包含第一微生物细胞的培养物中获 得的上清液中。根据该实施方案的一些方面，所述方法还包括构建基因工程化微生物细胞 以产生已被确定对至少一种微生物细胞的生长具有期望的作用的至少一种细菌素。根据该 实施方案的一些方面，所述至少一种微生物细胞是为工业培养基的常见入侵者的有机体。 根据该实施方案的一些方面，所述至少一种微生物细胞是新近入侵已有工业培养物的有机 体。
[0017]本文公开的另一实施方案包括用于中和培养基中的非期望的微生物有机体的系 统。所述系统可以包含含有培养基的第一环境以及含有分泌两种或更多种不同的细菌素的 第二微生物有机体的第二环境，其中所述第二微生物有机体含有针对所述两种或更多种不 同的细菌素中每一种的免疫调节剂，其中所述第二环境与所述第一环境流体连通，其中所 述第二环境与所述第一环境物理上分离以使所述第二微生物有机体不能从第二环境移动 至第一环境，以及其中所述分泌的两种或更多种不同的细菌素进入第一环境的培养基中。 根据该实施方案的一些方面，所述系统在培养基中还包含第一微生物有机体，其中所述第 一微生物有机体不分泌所述两种或更多种不同的细菌素，以及其中所述第一微生物有机体 未被两种或更多种不同的细菌素中任一者所中和。根据该实施方案的一些方面，所述第一 微生物有机体是非-GM0。根据该实施方案的一些方面，所述第一微生物有机体使培养基中 的组分进行发酵。根据该实施方案的一些方面，所述第一微生物有机体消除培养基的污染。 根据该实施方案的一些方面，所述第一微生物有机体进行光合作用，并且所述光合作用包 含包含在所述培养基的底物。根据该实施方案的一些方面，所述第二环境与所述第一环境 通过可透过两种或更多种不同的细菌素而不可透过第二微生物有机体的下述中的至少一 种分离:膜、网、过滤器或者瓣膜。根据该实施方案的一些方面，所述第二微生物有机体分泌 至少3种细菌素，例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种细菌 素。根据该实施方案的一些方面，所述第二环境包含不同于所述第二微生物有机体且也分 泌细菌素的至少第三微生物有机体。根据该实施方案的一些方面，所述第三微生物有机体 分泌至少2 种细菌素，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种 细菌素。本文公开的另一实施方案包括储存给料的方法。所述方法可以包括提供给料，提供 第一微生物有机体，将所述给料与所述细菌素接触，以及将所述给料储存所需的时间段，其 中所述第一微生物有机体分泌两种或更多种不同的细菌素。根据该实施方案的一些方面， 将给料与细菌素接触包括将给料与微生物有机体接触。根据该实施方案的一些方面，将给 料与细菌素接触包括将微生物有机体置于与所述给料的流体连通中，同时维持微生物有机 体与给料的物理性分离，以使细菌素与给料接触，但所述微生物有机体不与给料直接接触。 根据该实施方案的一些方面，通过可透过两种或更多种不同的细菌素而不可透过第一微生 物有机体的下述中的至少一种或多种维持分离:膜、网、过滤器或者两种或更多种不同的细 菌素可透过而第一微生物有机体不可透过的瓣膜。根据该实施方案的一些方面，所述方法 还包括在将给料与细菌素接触之前或者同时，用第二微生物有机体发酵给料。根据该实施 方案的一些方面，所述发酵包括在给料中产生期望的组分或者从给料中移除非期望的组分 中的至少一项。根据该实施方案的一些方面，所述所需的时间包括至少1个月，例如至少1、 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。根据该实施方案的一些方面，所述所需的时间包括至少 6个月，例如6、7、8、9、10、11或12个月。根据该实施方案的一些方面，所述第一微生物有机体 分泌至少3 种细菌素，例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种细 菌素。
[0018] 附图简要说明
[0019] 图1为描述根据本文的一些实施方案，配置微生物细胞以控制第二微生物细胞生 长的选项的流程图。
[0020] 图2A为阐明根据本文的一些实施方案，第一微生物细胞控制其它微生物细胞的生 长的示意图。图2B为阐明根据本文的一些实施方案，当第一微生物细胞不再处于期望的生 长环境时，控制第一微生物细胞的生长的示意图。
[0021] 图3为阐明根据本文的一些实施方案，第一微生物细胞控制第二微生物细胞的生 长并中和期望的环境中的入侵细胞的示意图。
[0022] 图4为阐明根据本文的一些实施方案，在期望的环境中，第一微生物细胞用第一抗 菌素中和第一入侵细胞并用第二细菌素中和第二入侵细胞的示意图。
[0023] 图5为阐明根据本文的一些实施方案，控制培养物中的至少第二微生物细胞生长 的方法的流程图。
[0024] 图6为阐明根据本文的一些实施方案的包含遗传防护者的系统的示意图。
[0025] 图7为阐明根据本文的一些实施方案的可以用于光合生产的遗传防护系统的示意 图。
[0026] 图8为阐明根据本文的一些实施方案产生并利用细菌素的方法的流程图。
[0027] 详细描述
[0028] 根据本文的一些实施方案，提供了基因工程化的微生物有机体。在一些实施方案 中，将微生物有机体工程化以控制环境中微生物群体(如利用给料的那些）的生长。如本文 所使用的，细菌素的"中和"活性(和同一根词的变体)可以指微生物繁殖的阻止或细胞毒 性。可将微生物有机体工程化以产生细菌素，所述细菌素是能够中和微生物的分泌的多肽。 然而，产生细菌素免疫调节剂的微生物有机体能够抵抗某些细菌素。因此，在一些实施方案 中，将第一微生物有机体进行工程化以分泌细菌素。在一些实施方案中，基于下述选择特定 的细菌素：微生物细胞的类型、被调节的微生物细胞的类型、培养基的组成或者地理位置 (例如，以靶向与特定类型的培养基和/或地理位置相关的特定污染性微生物有机体）。具有 针对特定环境的期望特性的其它微生物有机体能够产生细菌素免疫调节剂（因此在细菌素 存在的情况下存活），而非期望的其它微生物有机体(例如污染物、丧失了期望的特性的微 生物有机体或者参与工业生产过程但是在主导条件下其生长或特定产物的生产是非期望 的有机体)不能产生细菌素免疫调节剂，并因此被所述细菌素中和。
[0029]微生物有机体
[0030]根据一些方面，提供了基因工程化微生物。本文使用的基因工程化"微生物有机 体"、"微生物"以及这些根词的变体(如其复数等)包含任何天然存在的物种或完全合成的 原核或真核单细胞生物以及古菌物种的遗传修饰。因此，该表述可以指细菌物种、真菌物种 以及藻类的细胞。
[0031] 根据本文的实施方方案，可以使用的示例性微生物包括但不限于:细菌、酵母和藻 类，例如光合微藻。此外，可以合成完全合成的微生物基因组，并将其移植进单个的微生物 细胞内，从而产生能够连续自我复制的合成微生物(参见Gibson et al. (2010) ,"Creation of a Bacterial Cell Controlled by a Chemically Synthesized Genome，'，Science 329:52-56,在此以引用的方式将其整体并入）。由此，在一些实施方案中，微生物是完全合 成的。可以在期望的框架上，将遗传组件(包括调苄基因表达的组件和编码基因产物（例如 细菌素、免疫调节剂、毒物、解毒剂以及工业上使用的分子)的组件)的期望组合组装进部分 或完全合成的微生物中。用于工业应用的基因工程化微生物有机体的描述还可以在 Wright,et al·(2013)"Building-in biosafety for synthetic bioIogy^Microbiology 159:1221-1235 中找到。
[0032] 根据本文的实施方案，可以使用多种细菌菌种和菌株，以及可以提供遗传修饰的 变体或基于已知菌种框架的合成的细菌。根据本文的实施方案，可以使用的具有工业应用 特性的示例性的细菌包括但不限于：芽孢杆菌属菌种（例如凝结芽孢杆菌（Baci Ilus coagulans)、枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis)和地衣芽抱杆菌（Bacillus Iicheniformis))、类芽孢杆菌属菌种、链霉菌属菌种、微球菌属菌种、棒状杆菌属菌种、醋 杆菌属菌种、蓝藻属、沙门氏菌属菌种、红球菌属菌种、假单胞菌属菌种、乳杆菌属菌种、肠 球菌属菌种、产碱菌属菌种、克雷伯氏菌属菌种，类芽孢杆菌属菌种、节杆菌属菌种、棒状杆 菌属菌种、短杆菌属菌种、水生栖热菌(Thermus aquaticus)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、热纤梭菌（Clostridium thermocellus)以及大肠杆菌(Escherichia coli) 〇
[0033] 根据本文的实施方案，可以使用多种酵母菌种和菌株，并且可以提供遗传修饰的 变体或基于已知菌种框架的合成的酵母。根据本文的实施方案可以使用的具有工业应用特 性的示例性的酵母包括但不限于：酵母属菌种（例如酿酒酵母（Saccharomy ce s cerevisiae)、贝酉孝母（Saccharomyces bayanus)、鲍氏酉孝母菌（Saccharomyces boulardii ))、假丝酵母属菌种（例如产肮假丝酵母(Candida utilis)、克鲁斯假丝酵母 (Candida krusei))、裂殖酵母属菌种(例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、 日本裂殖酵母(Schizosaccharomyces japonicas))、毕赤酵母属或汉逊酵母属菌种(例如 毕赤酵母(Pichia pastoris)或多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha))以及酒香酵母属 菌种(例如克劳森酒香酵母(Brettanomyces claussenii))。
[0034] 根据本文的实施方案，可以使用多种藻类菌种和菌株，并且可以产生遗传修饰的 变体或基于已知菌种框架合成的藻类。在一些实施方案中，所述藻类包括光合微藻。可以用 于生物燃料并且根据本文的实施方案可以使用的示例性的藻类菌种包括：布朗葡萄藻 (Botryococcus braunii)、小球藻属菌种、特氏杜氏藻(Dunaliella tertiolecta)、江蓠属 菌种、颗石藻(Pleurochrysis carterae)以及马尾藻属菌种。此外，许多藻类可以用于食物 产品、肥料产品、废物中和、环境修复和碳水化合物的生产(例如，生物燃料）。
[0035] 细菌素
[0036]本文使用的"细菌素"及该根词的变体指这样的多肽:其由宿主细胞分泌并且能够 中和除产生所述多肽的个体宿主细胞之外的至少一种细胞，所述至少一种细胞包括与宿主 细胞同源关联的细胞和其它微生物细胞。本文使用的"细菌素"还包含无细胞或化学合成形 式的此种多肽。表达特定的"免疫调节剂"的细胞(本文更加详细地进行了讨论)对于特定细 菌素或一类细菌素的中和作用是免疫的。由此，细菌素能够中和产生细菌素的细胞和/或其 它微生物细胞，只要这些细胞不产生适当的免疫调节剂。由此，宿主细胞可以通过分泌细菌 素而对多种其它微生物有机体发挥细胞毒性或生长抑制作用。在一些实施方案中，微生物 细胞通过翻译机构(例如核糖体等)产生细菌素。在一些实施方案中，通过化学方法合成细 菌素。一些细菌素可以来源于多肽前体。所述多肽前体可以经历剪切（例如蛋白酶处理）以 获得细菌素自身多肽。由此，在一些实施方案中，细菌素由前体多肽产生。在一些实施方案 中，细菌素包含经历翻译后修饰(例如剪切或添加一个或多个官能团）的多肽。
[0037] "抗生素"及该根词的变体指能够杀死至少一种微生物细胞或者阻止至少一种微 生物细胞的生长的代谢途径的代谢物或中间体。一些抗生素可由微生物细胞产生，例如细 菌。一些抗生素可以化学合成。应当理解，细菌素与抗生素的区别至少在于细菌素指基因产 物(在一些实施方案中，其经历另外的翻译后加工)或其合成类似物，而抗生素指代谢途径 的中间体或产物或者其合成的类似物。
[0038] 细菌素的中和活性可以包括阻止微生物繁殖或细胞毒性。一些细菌素具有细胞毒 活性(例如"杀菌剂"效应），因此能够杀死微生物有机体，例如细菌、酵母、藻类、合成的微生 物等。一些细菌素能够例如通过阻止细胞周期抑制微生物有机体的繁殖（例如"抑菌"效 应），例如细菌、酵母、藻类、合成的微生物等。
[0039]应当注意，已经提议将非细菌素方法靶向不同的微生物有机体。例如，已经提议将 KAM0RAN?化学制品革El向乳酸菌(LAB)家族的细菌（参见Union Nationale des Groupements de Distillateurs D'Alcool，（2005) "Kamoran"）。应当注意，还提议将·菌体革巴向LAB家族 的细菌（参见美国公开号2010/0330041)。应当注意，已经提议将杀虫剂靶向不同的污染性 微生物有机体（参见McBride et al·，"Contamination Management in Low Co