一种白及种苗的组织培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及药用植物组织培养技术领域，具体设及一种白及种苗的组织培养方 法。
【背景技术】
[0002] 白及(Bletillas化ia化(Thunb.)Reic^lb.f.)为兰科白及属多年生草本植物，亦称 "白巧"，其块茎是我国传统的名贵中草药，具有收敛止血，消肿生肌，清热利湿的功效，通常 用于肺结核、咯血、肝癌、胃癌、十二指肠溃瘍、内外出血等疾病的治疗;现代药理学研究表 明白巧对结核杆菌、炎症细胞等有明显的抑制作用，具有代血浆、骨髓造血、延缓衰老、增加 机体免疫力等保健作用，其合成的大量超氧化物(SOD)还具有抗菌镇痛和抗肿瘤活性(张永 为等，2012;王红英，2009;王光辉等，2007 ; Jiangetal. 2007)。此外，白及还被广泛用作饮 片、护肤美白化妆品、烟蒂胶、糊料、浆丝铜、浆纱、涂料等的工业原料和基因递送的载体材 料，且白及花色艳丽，也是一种很好的园林花弁。运些广泛用途，导致其市场需求急剧增加， 价格飞速上涨，前景十分广阔。
[0003] 然而，市场的巨大需求致使野生白及几乎被采挖殆尽，成为溯临灭绝的名贵中药 材，被国家列为重点保护的野生药用植物之一，还被国际贸易公约(CUES)附录二录入加 W 保护，如何保护白及种质资源和为人工驯化栽培提供大量种苗是亟待解决的现实问题。通 过建立人工繁育的方法来保护白及野生资源和为大田的规模化种植提供大量种苗是中药 材研究中被通常采用的行之有效的方法。由于白及的种子非常细小且无胚乳，在自然状况 下很难萌发和生长，因而传统繁育白及种苗的方法主要依靠分株繁殖，但分株繁殖周期长， 繁殖效率低，而且耗种量大，成本高，很难满足规模化种植的需要。采用组织培养技术提高 白及种子萌发率，进而进行生根和壮苗培养诱导再生苗，是解决白及种质资源保护和快速 繁殖大量种苗最经济、高效的方法。然而由于组培技术的操作繁琐，耗时繁多，不仅增加了 劳动力成本，也增加了经济成本，且在种苗的转移过程中，种苗极易受到细菌的感染而降低 组培苗的成活率。故本发明目的是建立一套省时、省力获取白及种苗的技术体系，为白及的 种质资源保护和种苗快繁奠定实验基础。
【发明内容】
[0004] 本发明针对上述存在的技术问题，本发明旨在建立一套效率高、省力的获取白及 种苗的技术体系。
[0005] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案:一种白及种苗的组织培养方法，包括 W下步骤： 步骤一、培养基的配置:萌发培养基：1/2MS+NAA0.2mg/L+薦糖30g/L+琼脂6gA;继代培 养基:MS+NAA0.2mg/L+6-BAlmg/L+薦糖30g/L+琼脂6g/L;生根培养基:MS+NAA0.2mg/L+6-BAlmg/L+1%。碳粉+8%香蕉+薦糖30g/L+琼脂6g/l;调节所述萌发培养基、继代培养基和生根 培养基的抑值为5.70~6.00，分别将S种培养基转移至湿热高压灭菌锅内，进行加热加压 灭菌，加热溫度为12rC，压力为O. I~1.0 MPa，灭菌20min后备用； 步骤二、准备纸膜或无纺布:将纸膜或无纺布剪切成<9X9cm的圆片或方块，12rC灭 菌后备用； 步骤=、白及葫果的准备:在无菌环境中将成熟、完整、无霉变的白及葫果用浓度75%的 酒精浸泡25~35s后，用无菌水清洗2~4次，再用浓度0.1 %的升隶浸泡15~25min，无菌水 清洗3~7次； 步骤四、准备培养皿:准备=个无菌的空培养皿，分别标注一号培养皿、二号培养皿和 =号培养皿;将步骤一的萌发培养基转移至一号培养皿中，在萌发培养基表面平铺步骤二 制备的纸膜或无纺布;将继代培养基转移至二号培养皿中；生根培养基转移至=号培养皿 中； 步骤五、接种:培养皿准备完成1~5min后，使用无菌处理后的剪刀，将步骤S的白及葫 果剪开获得白及种子，将白及种子均匀播种在步骤四的一号培养皿中，利用封口胶封住一 号培养皿，在24 ± rC的光照条件下培养25~35d; 步骤六、萌发培养:步骤五的培养期满后，白及种子萌发得到组培苗，使用无菌处理的 綴子夹持一号培养皿中的纸膜或无纺布，将组培苗连同纸膜或无纺布直接转移至二号培养 皿中，在24 ± rc的光照条件下培养； 步骤屯、继代培养:待二号培养皿中白及种子萌发至组培苗长度>2cm后，使用无菌处 理的綴子夹持二号培养皿中纸膜或无纺布，将组培苗连同纸膜或无纺布直接转移至=号培 养皿中，在24 ± rc的光照条件下培养； 步骤八、待组培苗生长至长度5~6cm后，进行炼苗后获得种苗，将种苗移栽即可。
[0006] 本发明的有益效果为：（1)本发明相对现有技术效率高、劳动量小。因为在培养皿 中培养基的表面添加纸膜或无纺布后，整个培养过程的转接中只需要将整个纸膜或无纺布 转入，所有的白及种子或组培苗也随之同时转入新培养基中，运省去了大量的转接时间，大 大的减少了劳动量，降低了生产成本，尤其是不需要复杂的仪器与技术，不需要改变一贯的 培养条件；（2)本方法培养的组培苗生长势态良好。与未添加纸膜或无纺布的培养基上的白 及相比:在萌发阶段，萌发时间和萌发率无显著性差异，均能达到100%;在继代阶段，在纸膜 或无纺布上的白及生长旺盛，根系更发达；同时转入生根培养基中，纸膜或无纺布上生长的 白及苗更加的粗壮。
[0007] 进一步，本发明方案步骤五中在24± TC的光照条件下培养30d，获得的组培苗根 系更发达健壮，成活率更高。
【附图说明】
[0008] 图1为实施例1中白及组培苗的繁育过程图； 图2为对比例1的白及组培苗的繁育过程图。
【具体实施方式】
[0009] 下面结合附图和实施例对本发明技术方案进一步说明： 附图标记:本发明接种状态曰1、本发明萌发状态曰2、本发明萌发培养状态曰3、本发明继 代培养状态曰4、本发明生根状态曰5、对比例接种状态bl、对比例萌发状态b2、对比例萌发培 养状态b3、对比例继代培养状态b4、对比例生根状态b5。
[0010] 实施例1: 一种白及种苗的组织培养方法，包括W下步骤： 步骤一、培养基的配置:萌发培养基：1/2MS+NAA0.2mg/L+薦糖30g/L+琼脂6gA;继代培 养基:MS+NAA0.2mg/L+6-BAlmg/L+薦糖30g/L+琼脂6g/L;生根培养基:MS+NAA0.2mg/L+6-BAlmg/L+1%。碳粉+8%香蕉+薦糖30g/L+琼脂6g/l;调节所述萌发培养基、继代培养基和生根 培养基的抑值为5.70~6.00，分别将S种培养基转移至湿热高压灭菌锅内，进行加热加压 灭菌，加热溫度为12rC，压力为0.1~1. OMPa，灭菌20min后备用； 步骤二、准备纸膜或无纺布:将无纺布剪切成<9X9cm的圆片或方块，12rC灭菌后备 用； 步骤=、白及葫果的准备:在无菌环境中将成熟、完整、无霉变的白及葫果用浓度75%的 酒精浸泡30s后，用无菌水清洗2次，再用浓度0.1 %的升隶浸泡20min，无菌水清洗5次； 步骤四、准备培养皿:准备=个空的培养皿，分别标注一号培养皿、二号培养皿和=号 培养皿;将步骤一的继代培养基转移至一号培养皿中，在继代培养基表面平铺步骤二制备 的纸膜或无纺布;将继代培养基转移至二号培养皿中；将生根培养基转移至=号培养皿中； 步骤五、接种:培养皿准备完成1~5min后，纸膜或无纺布吸满水分，使用无菌处理后的 剪刀，将步骤=的白及葫果剪开获得白及种子，将白及种子均匀播种在步骤四的一号培养 皿中，利用封口胶封住一号培养皿，在24 ± TC的光照条件下培养30d; 步骤六、萌发培养:步骤五的培养期满后，白及种子萌发得到组培苗，使用无菌处理的 綴子夹持一号培养皿中纸膜或无纺布，将组培苗连同纸膜或无纺布直接转移至二号培养皿 中，在24 ± rc的光照条件下培养； 步骤屯、继代培养:待二号培养皿中白及种子萌发至组培苗长度>2cm后，使用无菌处 理的綴子夹持二号培养皿中纸膜或无纺布，将组培苗连同纸膜或无纺布直接转移至=号培 养皿中，在24 ± rc的光照条件下培养； 步骤八、待组培苗生长至长度5~6cm后，进行炼苗后获得种苗，将种苗移栽即可。
[0011] 实施例2: -种白及种苗的组织培养方法，包括W下步骤： 步骤一、培养基的配置:萌发培养基：1/2MS+NAA0.2mg/L+薦糖30g/L+琼脂6gA;继代培 养基:MS+NAA0.2mg/L+6-BAlmg/L+薦糖30g/L+琼脂6g/