一种多年生黑麦草愈伤组织的诱导方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物组织培养领域，具体的，涉及一种多年生黑麦草愈伤组织的诱导 方法。
【背景技术】
[0002] 愈伤组织在草坪草的遗传转化中通常被用作受体材料，用于农杆菌、基因枪等介 导的遗传转化。同时愈伤组织也是细胞悬浮培养和原生质体培养的原材料。因此，愈伤组 织培养是很多植物科学研究的基础材料，也是植株再生体系建立和遗传转化体系建立的基 础。
[0003] 诱导愈伤组织的形成和形态发生，是使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的 细胞，通过脱分化最终形成愈伤组织的过程。愈伤组织由外植体脱分化产生，一些愈伤组织 为胚性的，另一些为非胚性的。它们可以通过形态和细胞结构加以区分，胚性愈伤通常具有 易脆、干燥、有序，颜色为白色或淡黄色。胚性愈伤组织具有全能性，经过进一步培养能分化 为再生植株，而非胚性愈伤要分化则非常困难。
[0004] 目前现有的诱导愈伤组织技术体系中仍然存在一些问题和局限，现有技术通常利 用成熟胚为外植体，需显微镜下取成熟胚置于培养基上，操作过程均较为繁琐和复杂、愈伤 组织诱导率不高，胚性愈伤获得率低；而利用种子做外植体的方案通常需经过种子划破和 切割处理才能够提高愈伤组织诱导率，同样具有操作过程繁琐的缺陷，而且诱导率普遍低 于50%。因此，需要继续摸索建立多年生黑麦草品种的愈伤组织诱导体系，简化诱导过程， 提高愈伤组织诱导率和胚性愈伤组织获得率。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术中存在的操作过程复杂、诱导效率低下的缺陷， 提供一种操作过程简单，愈伤组织诱导率和胚性愈伤组织获得率高的多年生黑麦草愈伤组 织的诱导方法。
[0006] 为了达到这一目的，本发明提供了一种多年生黑麦草愈伤组织的诱导方法，包括 以下步骤：将多年生黑麦草种子消毒处理并脱种皮，再在3-5°C的无菌水中浸泡7-9小时后 接种于诱导培养基中进行愈伤诱导；
[0007] 其中，所述诱导培养基是添加有植物生长调节剂的MS培养基，在所述诱导培养基 中含有按质量体积比计3. 8-6. 2mg/L的2, 4D、0. 18-0. 22mg/L的6-BA和0-0. 12g/L酸水解 酷蛋白。
[0008] 可选的，所述多年生黑麦草种子的品种为高帽，在所述诱导培养基中含有按质量 体积比计，6mg/L的2, 4D、0. 2mg/L的6-BA，不含有酸水解酪蛋白。
[0009] 可选的，所述多年生黑麦草种子的品种为蒙特利III或夜影，在所述诱导培养基 中含有按质量体积比计，5. 8-6. 2mg/L 的 2, 4D、0. 18-0. 22mg/L 的 6-BA、0. 08-0. 12g/L 的酸 水解酪蛋白。
[0010] 可选的，所述多年生黑麦草种子的品种为德比极品，在所述诱导培养基中含有按 质量体积比计，3. 8-4mg/L 的 2, 4D、0. 18-0. 22mg/L 的 6-BA、0. 08-0. 12g/L 的酸水解酪蛋白。
[0011] 可选的，所述愈伤诱导的步骤包括：在20-28°C下全黑暗培养67-77天，全黑暗培 养过程中每30-35天换一次培养基继代一次，共继代2次。
[0012] 可选的，全黑暗培养7天后将种子发出的芽拔除。
[0013] 可选的，所述消毒处理并脱种皮的步骤包括：将多年生黑麦草种子4-5g置于含有 浓度为1. 2-1. 8%的吐温-80和8. 5-9. 5%的次氯酸钠的溶液中搅拌40-50min脱去种皮， 再用无菌水清洗3-6遍。
[0014] 可选的，所述方法还包括在浸泡结束后用无菌水将种子清洗2-3遍，再用滤纸吸 干种子表面的水分。
[0015] 可选的，所述方法还包括在第一次继代时统计出愈率，在第二次继代时统计胚性 愈伤率。
[0016] 利用本发明所提供的方法，可以通过简单的操作步骤对多年生黑麦草愈伤组织进 行诱导，不需要对种子进行划开处理，而且具有显著提高的出愈率和胚性愈伤率。
【附图说明】
[0017] 图1是蒙特利III种子诱导60天后获得的胚性愈伤组织。
[0018] 图2是德比极品诱导60天后获得的胚性愈伤组织。
【具体实施方式】
[0019] 下面将通过【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0020] 本发明提供了一种多年生黑麦草愈伤组织的诱导方法，所述方法包括以下步骤： 将多年生黑麦草种子消毒处理并脱种皮，再在3_5°C环境下的无菌水中浸泡7-9小时后接 种于诱导培养基中进行愈伤诱导；
[0021] 其中，所述诱导培养基是添加有植物生长调节剂的MS培养基，在所述诱导培养基 中含有按质量体积比计 3. 8-6. 2mg/L 的 2, 4D、0. 18-0. 22mg/L 的 6-BA 和 0· 08-0. 12g/L 酸 水解酪蛋白。
[0022] 本发明所提供的方法选用多年生黑麦草种子作为外植体，所述多年生黑麦草种子 至少选自夜影、蒙特利III、高帽和德比极品中的一种。
[0023] 在本发明所提供的方法中，在进行消毒处理前，可以先对多年生黑麦草种子进行 筛选，去除不实种，具体的，可以将种子浸泡在水中，用清水冲洗掉漂浮的不实种，将筛选出 的种子进行消毒处理。
[0024] 本发明中，对于消毒处理并脱种皮的方法可以采用多种方式进行，为了获得更好 的消毒效果，本发明将多年生黑麦草种子置于含有1. 2-1. 8%吐温-80和8. 5-9. 5%次氯酸 钠的溶液中进行消毒，优选的，置于含有1 %吐温-80和9%次氯酸钠的溶液中对种子进行 消毒。为了在脱除种皮的过程中不对种子造成损伤，可以加入磁力转子对溶液进行搅拌，在 搅拌的过程中，观察草种种皮脱离的情况，直至大部分种子的种皮脱落漂离种子，搅拌的时 间可以为40-50min，优选的，搅拌的时间可以为45分钟。在脱皮结束后，在利用无菌水对脱 皮后的种子清洗3-6遍。在进行最后一遍清洗后，不需要将无菌水倒出，可以直接对脱皮后 的种子进行浸泡，具体的，可以将盛放种子的容器进行密封以避免污染，然后将密封后的容 器置于4°C的冰箱中超过8小时，进行浸泡步骤。
[0025] 本发明所提供的方法还包括在浸泡结束后用无菌水将种子清洗2-3遍，再用滤纸 吸干种子表面的水分。具体的，可以将清洗后的种子置于铺有4层无菌滤纸的培养皿中，待 滤纸将种子表面的水分吸干后，再将种子接种在诱导培养基中。
[0026] 值得注意的是，本发明所提供的方法在接种时不需要对种子进行划破处理，可以 直接将种子放置在诱导培养基上，一般的，可以按照每个平皿40粒种子的密度对种子进行 排布。
[0027] 在本发明所提供的方法中，所述诱导培养基的制备方法可以为在MS培养基中加 入一定总量的2, 4D、6-BA和酸水解酪蛋白（AHC)后调解pH值至6-7后在121°C下高压灭菌 15min。优选的，所述诱导培养基的pH值为6。
[0028] 在本发明的一种实施方式中，当所述多年生黑麦草种子的品种为高帽时，为了获 得更好的诱导效果，在所述诱导培养基中含有按质量体积比计，6mg/L的2, 4D、0. 2mg/L的 6-BA，不含有酸水解酪蛋白。
[0029] 在本发明的一种实施方式中，当所述多年生黑麦草种子的品种为蒙特利III或夜 影时，为了获得更好的诱导效果，在所述诱导培养基中含有按质量体积比计，5.8-6. 2mg/L 的 2, 4D、0. 18-0. 22mg/L 的 6-ΒΑ、0· 08-0. 12g/L 的酸水解酪蛋白。
[0030] 在本发明的一种实施方式中，当所述多年生黑麦草种子的品种为德比极品时，为 了获得更好的诱导效果，在所述诱导培养基中含有按质量体积比计，3. 8-4mg/L的2, 4D、 0· 18-0. 22mg/L 的 6-ΒΑ、0· 08-0. 12g/L 的酸水解酪蛋白。
[0031] 根据本发明，所述愈伤诱导的步骤包括：在20-28°C下全黑暗培养67-77天，其 中，每25-35天更换培养基继代一次，共继代2次。优选的，每30天继代一次，继代所更换 的诱导培养基的成分不变。为了及时了解愈伤组织诱导的情况，所述方法还包括在第一次 继代时统计出愈率，在第二次继代时统计胚性愈伤率。其中，出愈率=(出愈数/外植体 数）X 100% ;胚性愈伤率=(胚性愈伤数/外植体数）X 100%。
[0032] 在愈伤诱导过程中，由于种子作为外植体进行愈伤组织诱导时发芽非常迅速，需 要将种子发出的芽拔除，一般的，在全黑暗培养7天后开始将种子发出的芽拔除干净。
[0033] 利用本发明所提供的方法获得的愈伤组织为胚性愈伤组织。
[0034] 为衡量愈伤质量，根据李书平的标准（李书平等，1998)，依其形态特征，将愈伤组 织分为4种类型。
[0035] 类型1 :愈伤组织乳白色、淡黄色，新鲜，质地中等，易碎，生长旺盛；类型2 :愈伤组 织呈乳白色，质地较松散，生长较快；类型3 :愈伤组织呈青白色，透明水浸状，生长缓慢；类 型4 :愈伤组织呈白色，顶部生有气生根，生长迟缓。类型1和2可认为是胚性愈伤组织。
[0036] 本发明所提供的方法还包括在获得愈伤组织后的后续处理步骤，当将愈伤组织用 作多年生黑麦草农杆菌介导法的受体材料时，在利用农杆菌对愈伤组织进行侵染前，要对 愈伤组织进行预处理，将愈伤组织转入新鲜的诱导培养基中进行预培养，预培养的时间可 以为3-6天，通过预培养步骤可以显著提高胚性愈伤的活性。此处，胚性愈伤活性测试是通 过基因枪遗传转化成功率定义的。利用本发明所提供的方法培养出来的胚性愈伤组织进行 基因枪遗传转化，成功率较高。
[0037] 下面通过实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施 例的给出进是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术 人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本分发明进行各种修改和替换。
[0038] 以下实施例中：
[0039] MS培养基的配方如表1所示：
[0040] 衷 1
夜影种子、蒙特利III种子、高帽种子和德比极品种子均由北京绿冠种业发展有限 公司提供。
[0043] 实施例1
[0044] 本实施例用于说明本发明所提供的黑麦草愈伤组织的诱导方法。
[0045] 将4g蒙特利III种子装在50ml的离心管里，加入45ml的蒸馏水和5ml的次氯酸钠 溶液（9 % )，加入吐温-80 (终浓度为1 % )，放入磁力转子，在磁力搅拌器上，搅拌45分钟，