一种禾谷类作物单倍体群体的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种禾谷类作物单倍体植株快繁的方法及用 途。
【背景技术】
[0002] 单倍体技术是现代育种中一种非常重要的技术手段，它通过花药/小孢子培养可 以获得单倍体植株，但是由于单倍体植株的不育性，这些植株不能长期存活，通常是通过染 色体加倍成二倍体植株加以利用。单倍体植株由于本身只具备一套染色体，在诱变、转化、 细胞杂交等遗传改良研究上具有特殊优势：单倍体材料对外界刺激敏感，易于产生突变； 外源基因易于插入；单倍体水平上的突变或转基因经染色体加倍后可以获得目标基因以 等位纯合状态稳定遗传的加倍单倍体植株，隐性基因控制的性状也可以得到表现；单倍体 (N)细胞融合杂交，易于获得的杂交再生植株（2N)。
[0003] 对已获得的单倍体植株进行离体扩繁，快速构建单倍体群体是对单倍体资源进 行种质保存，开展有效利用的一个材料来源基础。目前利用组织培养技术对单倍体植 株进行离体繁殖，已在一些双子叶植物中取得成功，如利用油菜单倍体植株的节间茎段 诱导不定芽再生植株（刘成洪，王亦菲，孙月芳，等.甘蓝型油菜单倍体植株群体的 构建[J].上海农业学报，2006, 21 (4):23-25.),利用青花菜单倍体茎尖诱导再生植株 (陆瑞菊，王亦菲，孙月芳，等.利用青花菜单倍体茎尖筛选耐热变异体[J].核农学 报，2006, 20 (5) : 388-391.)，利用亚麻的单倍体叶片诱导再生植株等（康庆华，徐涵，吴广 文，等.利用亚麻多胚性状建立单倍体群体并实现离体扩繁[J].农业生物技术学报，2007， 15 (增刊）：249-252)，在单子叶植物玉米中通过胚芽鞘节诱导愈伤组织分化形成了再生植 株（杜何为，刘志鹏，严建兵，等.玉米单倍体胚芽鞘节组织培养特性研究[J].中国农 业科学，2010, 43 (15) : 3098-3105)。但对于禾谷类作物如大麦、小麦、水稻等，还未见在单倍 体植株的基础上建立系统有效的离体繁殖体系，也未见利用从单倍体植株分蘖节直接诱导 丛生芽的报道。
[0004] 因此，本领域仍需要一种禾谷类作物单倍体植株快繁的方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种禾谷类作物单倍体植株系统有效的离体繁殖方法，通 过利用禾谷类作物的分蘖苄基部分生组织，采用适宜的激素和添加物直接获得丛生芽，壮 苗和诱导生根，建立倍性稳定、生长迅速的单倍体离体繁殖群体。
[0006] 本发明方法可通过以下方式实现：通过游离小孢子（花药）培养技术，获得来源于 小孢子的再生植株，经倍性鉴定获得单倍体植株，单倍体植株利用培养基或水培形成多个 分蘖的植株，剥取分蘖苄基部，使用适宜的激素和其他添加物进行诱导培养，从分蘖苄基部 分生组织直接诱导丛生芽，丛生芽进一步增殖、壮苗和生根，获得完整的再生植株，经倍性 鉴定获得单倍性遗传稳定的单倍体群体。
[0007] 本发明建立的方法，可以用于禾谷类作物单倍体种质的保存，单倍体诱变，单倍体 的遗传转化，细胞融合杂交，以及单倍体发育遗传机制的研究，本发明的用途包含但不仅限 于上述应用。
[0008] 因此，本发明提供一种禾谷类作物单倍体植株的离体繁殖方法，所述方法包括： 使用禾谷类作物的分蘖苄基部分生组织产生丛生芽；和繁育丛生芽，获得单倍性遗传稳定 的单倍体植株。
[0009] 在一个具体实施例中，所述分蘖苄基部获自来源于小孢子的单倍体植株。
[0010] 在一个具体实施例中，用0. 2-0. 5M的甘露醇提取液收集禾谷类作物的小孢子。
[0011] 在一个具体实施例中，将提取获得的游离小孢子置于诱导培养基中进行诱导培 养。
[0012] 在一个具体实施例中，诱导培养基以N6培养基为基础，所不同的是含有0_2500mg/ L 的 KNO3 和 0-400mg/L 的（NH4) SO4，并添加有 400-2500mg/L 的水解干酪素和 400-2500mg/ L的谷氨酰胺。
[0013] 在一个具体实施例中，将诱导培养所得愈伤组织转移至分化培养基上。
[0014] 在一个具体实施例中，分化培养基以2/3MS为基本培养基，其中加有 6-BA0. 3-1. 2mg/L、KT 0· 5-2. Omg/L、NAA 0· 01-0. lmg/L、麦芽糖 10-50g/L 以及肌醇 95-105mg/L，pH 为 5. 5-6. 2。
[0015] 在一个具体实施例中，在25土1°C，每天10~12小时光照的条件下分化胁迫培养 25~30天，直至分化出绿色再生植株。
[0016] 在一个具体实施例中，将分化出的再生植株转入添加有ΝΑΑ0. 02-0. 08mg/L、多效 唑（MET) 2. 0-10.0 mg/L 和蔗糖 10-40g/L，pH5. 6-6. 0 的 1/2MS 生根壮苗培养基，在 25 土 1°C， 每天10~12小时光照的条件下进行25~30天的生根壮苗培养。
[0017] 在一个具体实施例中，将所获得的单倍体植株放置温室中漂浮培养1-2天，进行 炼苗。
[0018] 在一个具体实施例中，温室温度为白天20-25°C，晚上16-20°C，10-16小时光照。
[0019] 在一个具体实施例中，炼苗结束后，将所得植株转移到l/2Hoagland溶液中培养， 每3-4天更换一次培养液，培养约1个月，形成多个分蘖。
[0020] 在一个具体实施例中，获取再生植株分蘖节部位Icm左右，接种到含0. 3-0. 8mg/L TDZ的1/2MS的丛生芽诱导培养基直接诱导培养，培养温度为20-26°C，优选23土 1°C，光周 期约8_14h · d \优选约IOh · d \
[0021] 在一个具体实施例中，将所述再生植株分蘖节部位接种到含有0. 5mg/LTDZ的 1/2MS丛生芽诱导培养基中。
[0022] 在一个具体实施例中，将由分蘖苄基部长出的新芽转移到丛生芽增殖培养基上。
[0023] 在一个具体实施例中，丛生芽增殖培养基以1/2MS培养基配制，除含有1/2MS培养 基的成分外，还添加有300-500mg/L水解干酪素（CH)、10-30mg/L亚精胺（Spd)、0· 6-1. 2mg/ L TDZ (噻二唑苯基脲）和0· 8-1. 2mg/L多效唑（MET)。
[0024] 在一个具体实施例中，丛生芽增殖培养基中，CH为400mg/L，Spd为20mg/L，TDZ为 1.0 mg/L，MET 为 1.0 mg/L。
[0025] 在一个具体实施例中，将丛生芽增殖培养基上培养获得的丛生芽转移到1/2MS培 养基培养，以降低植株的内源激素，然后转到生根诱导培养基上诱导生根，形成完整再生植 株。
[0026] 在一个具体实施例中，丛生芽在1/2MS培养基培养中培养约3 - 6周，优选4周左 右。
[0027] 在一个具体实施例中，生根诱导培养基以1/2MS培养基配制，除含有1/2MS培养基 的成分外，还添加 NAA 0· 03-0. 08mg/L 和 MET 0· 8-1. 2mg/L。
[0028] 在一个具体实施例中，所述生根诱导培养基中，萘乙酸为0. 05mg/L，多效唑（MET) 为 1.0 mg/L。
[0029] 在一个具体实施例中，本发明的方法包括：
[0030] (1)由禾谷类作物小孢子获得单倍体植株；
[0031] (2)培养步骤（1)获得的单倍体植株，使其形成分蘖；
[0032] (3)由步骤（2)所得分蘖苄基部诱导产生丛生芽；以及
[0033] (4)繁育所述丛生芽，获得单倍体再生群体。
[0034] 本发明还包括用于上述各步骤的培养基及其任意组合，以及含有所述培养基及其 任意组合的试剂盒。
[0035] 本发明的试剂盒还包括指导如何使用所述培养基的说明书。
[0036] 本发明还包括采用本发明方法获得的禾谷类作物的单倍体群体。
[0037] 本发明利用分蘖苄基部的分生组织进行丛生芽诱导，可以避免中间愈伤组织生长 环节形成的无性变异，最大程度保持其原有遗传基础，使单倍体植株的扩繁群体保持单倍 体的稳定性。
【具体实施方式】
[0038] 本发明利用游离小孢子（花药）培养技术获得单倍体植株，对单倍体植株培养使 其形成多个分蘖，然后利用分蘖苄基部分生组织直接诱导丛生芽（这不同于其他报道单倍 体诱导再生方式），进行增殖、壮苗、生根获得单倍体再生群体。还可对群体的稳定性进行评 价。因此，本发明的方法具有系统性。
[0039] 具体而言，本发明提供一种禾谷类作物单倍体植株的离体繁殖方法，所述方法包 括使用诱导培养禾谷类作物的分蘖苄基部分生组织，产生丛生芽；和繁育丛生芽，获得单倍 性遗传稳定的单倍体植株。
[0040] 1、由禾谷类作物游离小孢子获得单倍体植株
[0041] 禾谷类作物的单倍体植株可通过花药或游离小孢子培养获得。由禾谷类作物小孢 子获得再生植株的方法可参见，例如陆瑞菊，《大麦游离小孢子培养技术的优化及单倍体耐 盐、耐低氮胁迫筛选体系的建立》，南京农业大学2012博士论文。
[0042] 具体而言，通常，可从大田或温室选取禾谷类作物中部小花，其小孢子发育处于单 核早期、中期的穗子，放入冰箱冷藏10-30天，通常是15-25天，例如15天左右。冷藏的温 度可以在〇-8°C范围之间，例如可以为3-8°C。通常可在约5°C冷藏。
[0043] 穗子先消毒，例如用饱和的漂白粉溶液消毒10_20min，无菌水冲洗2-4次。每个 离心管中接入10个穗子的花药，倒入15-20ml 0. 2-0. 5M的甘露醇提取液，用高速分散器超 速（例如3000-4000rpm)旋切，150目筛网过滤，滤液低速（例如800-1000rpm)离心，重复 2-3次，收集小孢子。
[0044] 提取获得的游离小孢子可置于本发明的诱导培养基中进行诱导培养。培养前可先 用该诱导培养基洗涤小孢子1到2次，然后用培养基将小孢子密度调节至I. 0~I. 2 X IO5 个/ml，取大约I. 5-3ml小孢子悬浮液接种于培养皿（30