一种基于不对称原生质体杂交技术的石斛种质的选育方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物细胞技术领域，具体涉及一种基于不对称原生质体杂交技术的石斛种质的选育方法。
【背景技术】
[0002]石斛属(Dendrobium)为兰科的大属之一，多数石斛植物，如铁皮石斛、霍山石斛、金钗石斛等是一类珍贵的中药材，同时也是一类具有观赏价值的花卉。然而，由于多数石斛属植物生境条件较为独特，自身繁殖能力较低，并且人们过度采挖，现在石斛的野生资源濒临灭绝。
[0003]—些珍稀石斛属植物，如霍山石斛、铁皮石斛的遗传育种已取得了很大成功，但由于其种质资源十分狭窄，抗病性、抗逆性逐渐下降，亟需引入新的抗病及其他优质基因。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种基于不对称原生质体杂交技术的石斛种质的选育方法，通过石斛双亲种胚非共生萌发、双亲类原球茎和悬浮细胞系的诱导及筛选、双亲原生质体的游离、双亲原生质体的处理、双亲原生质体的融合及培养、杂种细胞类原球茎培养及植株再生，杂种植株染色体小片段及DNA的鉴定等步骤，以聚乙二醇作为融合剂进行原生质体融合，简单易行，融合频率高，处理一次即可获得数量可观的杂交细胞，从而实现了本发明的目的。
[0005]本发明所采用的技术方案是，一种基于不对称原生质体杂交技术的石斛种质的选育方法，包括以下步骤:
[0006]I)人工授粉:按常规方法进行栽培管理，选定株系优良的石斛植株作为亲本，在石斛开花后进行异花授粉；
[0007]2)非共生萌发:在石斛蒴果发育基本成熟而果实未开裂时，消毒后，用无菌解剖刀沿蒴果纵轴方向将蒴果切开，将种胚接种到萌发培养基上在温度为25?28°C、光照强度为1500?20001x、光照时间为10小时/天的条件下培养，培养20?30天后种子萌发成原球茎；
[0008]3)悬浮培养:将非共生萌发形成的原球茎转入液体诱导培养基进行振荡悬浮培养得到悬浮细胞系；所述的液体诱导培养基为:MS+6-BA0.5?lmg/L+NAA0.3mg/L+土豆汁100ml/L+白糖 30g/L;
[0009]4)原生质体游离:将悬浮细胞接种到含有酶解液的原生质体液体培养基中，在25?28°C、黑暗条件下进行间歇振荡酶解处理10?20小时；
[0010]5)原生质体的的处理:将游离的石斛受体原生质体先用碘乙酰胺溶液避光处理10?20min，然后用原生质体洗涤液冲洗3?5次，再用原生质体液体培养基稀释至15?16个/mL;供体原生质体先用原生质体液体培养基稀释至15?16个/mL，然后铺在直径1.5cm的玻璃培养皿中形成薄层用γ -射线处理；
[0011]6)原生质体的不对称融合:将供体原生质体与受体原生质体按体积比1:1进行混合均匀，用聚乙二醇融合法进行融合；
[0012]7)类原球茎的诱导与植株再生:融合产物转入原生质体液体培养基进行振荡培养获得细胞团，然后转接到诱导培养基上进行培养即获得完整的体细胞杂种植株。
[0013]进一步地，步骤2)中的萌发培养基为:1/2MS+NAA0.5mg/L+土豆汁50ml/L+椰汁50ml/L+白糖 30g/L+琼脂粉 3.6 ?4.4g/L。
[0014]进一步地，步骤4)中酶解液为:4.0%纤维素酶R-10+1.5 %离析酶R-10+2 %果胶酶Y-23+5mmol/L MES+0.6mol/L甘露醇+5mmol/L CaCl2，pHS5.4?5.80
[0015]进一步地，步骤4)、5)和7)的原生质体液体培养基为:1/2MS+0.1?0.6mg/L NAA+5mmol/L MES+0.6mol/L甘露醇+5mmol/LCaCl2+50?80g/L葡萄糖+0.1?0.5g/L酸性水解酷蛋白，ρΗ*5.4?5.8。
[0016]进一步地，步骤5)的碘乙酰胺溶液为:I?4mmol/L碘乙酰胺+ 5mmol/L MES+
0.6mol/L 甘露醇+5mmol/LCaCl2，pH 为5.4 ?5.8。
[0017]进一步地，步骤5)中的原生质体洗涤液为:l/2MS+5mmol/L MES+0.6mol/L甘露醇+5mmol/LCaC12，pH为5.4?5.8。
[0018]进一步地，步骤5)中的γ-射线指的是剂量为80Gy，剂量率为4Gy/min的6qCo- γ -射线。
[0019]进一步地，步骤7)中的诱导培养基为:1/2MS+0.5?1.5mg/LNAA+0.2?2.0g/L蛋白胨+0.I?0.5g/L酸性水解酪蛋白+20?35g/L蔗糖+3.0?7.0g/L琼脂+0.3?I.0g/L活性炭。
[0020]本发明的有益效果是:原生质体融合可以克服远缘有性不亲和性，将异源物质转入受体，因此可以实现细胞核和细胞质基因的转移。通过不对称原生质体杂交技术，可大幅度地拓宽了石斛的遗传多样性，为石斛杂交育种、遗传改良和新种质创造开辟了一条新途径。
[0021]目前国内关于通过利用不对称原生质体杂交技术创造石斛新种质的报道很少，特别是以种胚作为起始材料进行原生质体融合尚未有文献报道，而本发明具有简单、易行、融合率高的特点，可大幅度地拓宽了石斛的遗传多样性，为石斛杂交育种、遗传改良和新种质创造开辟了一条新途径。
【具体实施方式】
[0022]下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0023]实施例1
[0024]1、品种来源
[0025]受体:铁皮石斛;供体:流苏石斛。
[0026]2、培育过程
[0027](I)人工授粉:按常规方法进行栽培管理，选定株系优良的石斛植株作为亲本，在石斛开花后进行异花授粉。
[0028](2)非共生萌发:在石斛蒴果发育基本成熟而果实未开裂时，消毒后，用无菌解剖刀沿蒴果纵轴方向将蒴果切开，将种胚接种到萌发培养基上在温度为27°C、光照强度为18001x、光照时间为10小时/天的条件下培养，培养25天后种子萌发成原球茎。所述萌发培养基为:1/2MS+NAA0.5mg/L+土豆汁 50ml/L+椰汁 50ml/L+白糖 30g/L+琼脂粉 4.4g/L。
[0029](3)悬浮培养:将非共生萌发形成的供体和受体原球茎分别转入液体诱导培养基进行振荡悬浮培养得到悬浮细胞系。所述的液体诱导培养基为:MS + 6-BA0.1mg/L+NAA0.3mg/L+土豆汁 1001111/1+白糖3(^/1。
[0030](4)原生质体游离:将供体和受体悬浮细胞分别接种到含有酶解液的原生质体液体培养基中，在27 0C、黑暗条件下进行间歇振荡酶解处理16小时。所述酶解液为:4.0 %纤维素酶R-10+1.5%离析酶R-10+2%果胶酶Y-23+5mmol/L MES+0.6mol/L甘露醇+5mmol/LCaCl2，pH为5.4。所述原生质体液体培养基为:1/2MS+0.5mg/L NAA+5mmol/L MES+0.6mol/L甘露醇+5mmol/LCaCl2+60g/L葡萄糖+0.lg/L酸性水解酪蛋白，pH为5.8。
[0031](5)原生质体的的处理:将游离的铁皮石斛原生质体先用碘乙酰胺溶液避光处理lOmin，然后用原生质体洗涤液冲洗3?5次，再用原生质体液体培养基稀释至15?16个/mL。流苏石斛原生质体先用原生质体液体培养基稀释至15?16个/mL，然后铺在直径1.5cm的玻璃培养皿中形成薄层用γ-射线处理。所述原生质体洗涤液为:l/2MS+5mmol/L MES+
0.6mol/L甘露醇+5mmol/LCaCl2，pH为5.4。所述的碘乙酰胺溶液为:3臟01/1碘乙酰胺(10八)+5mmol/L MES+0.6mol/L甘露醇+5mmol/LCaCl2，pH为5.4。所用的原生质体液体培养基为I/2MS+0.5mg/L NAA+5mmol/L MES+0.6mol/L甘露醇+5mmol/LCaCl2+60g/L葡萄糖+0.lg/L酸性水解酪蛋白，pH为5.4。所述γ -射线处理指的是80Gy，剂量率为4Gy/min的6t3Co- γ -射线。
[0032](6)原生质体的不对称融合:将铁皮石斛原生质体与流苏石斛原生质体按体积比1:1进行混合均匀，用聚乙二醇融合法进行融合。
[0033](7)类原球茎的诱导与植株再生:融合产物转入原生质体液体培养基进行振荡培养获得细胞团，然后转接到诱导培养基上进行培养即获得完整的体细胞杂种植株。所述的原生质体液体培养基为:1/2MS+0.5mg/L NAA+5mmol/L MES+0.6mol/L甘露醇+5mmol /LCaCl2+60g/L葡萄糖+0.lg/L酸性水解酪蛋白，pH为5.4。所述诱导培养基为:1/2MS+1.5mg/LNAA+0.2g/L蛋白胨+0.5g/L酸性水解酪蛋白+20g/L蔗糖+5.0g/L琼脂+0.5g/L活性炭。
[0034](8)体细胞杂种植株的鉴定:利用染色体核型、FISH和GISH及SSR技术相结合，对流苏石斛染色体小片段在体细胞杂种植株染色体及基因组中的分布进行定性和定量分析，从而达到鉴定体细胞杂种植株。
[0035]实施例2
[0036]1、品种来源
[0037]受体:铁皮石斛;供体:马鞭石斛。
[0038]2、培育过程
[0039](I)人工授粉:按常规方法进行栽培管理，选定株系优良的石斛植株作为亲本，在石斛开花后进行异花授粉。
[0040](2)非共生萌发:在石斛蒴果发育基本成熟而果实未开裂时，消毒后，用无菌解剖刀沿蒴果纵轴方向将蒴果切开，将种胚接种到萌发培养基上在温度为28°C、光照强度为20001x、光照时间为10小时/天的条件下培养，培养20天后种子萌发成原球茎。所述萌发培养基为:1/2MS+NAA0.5mg/L+土豆汁 50ml/L+椰汁 50ml/L+白糖 30g/L+琼脂粉 3.6g/L。
[0041](3)悬浮培养:将非共生萌发形成的供体和受体原球茎分别转入液体诱导培养基进行振荡悬浮培养得到悬浮细胞系。所述的液体诱导培养基为:MS + 6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L+土豆汁 1001111/1+白糖3(^/1。
[0042](4)原生质体游离:将供体和受体悬浮细胞分别接种到含有酶解液的原生质体液体培养基中，在28 0C、黑暗条件下进行间歇振荡酶解处理10小时。所述酶解液为:4.0 %纤维素酶R-10+1.5%离析酶R-10+2%果胶酶Y-23+5mmol/L MES+0.6mol/L甘露醇+5mmol/LCaCl2，pH为5.4。所述原生质体液体培养基为:1/2MS+0.3mg/L NAA+5mmol/L MES