细胞冻存保护组合物、该组合物的用途以及细胞冻存的方法
【技术领域】
[0001] 本申请属于细胞生物领域，具体涉及利用一种包含具有通式结构R1-N+(CH3) 2-(CH2)n-R2的两性分子、且无毒高效的细胞冷冻保护组合物。本申请还涉及该组合物的用途 以及对细胞进行冷冻保存的方法。
【背景技术】
[0002] 随着生物医学技术的发展，从活体组织或血液中分离提取出的细胞越来越广泛应 用于生物医学中的各个领域。活细胞不仅已经在高校、研究院等研究机构广泛的用于基础 研究。在医药开发领域，活细胞被用于考察药物疗效、剂量和毒性，为动物实验测试提供方 向引导，同时也减少实验了动物用量，降低风险。在医疗领域，一方面从人体获得的活细胞 样品可以用于检测和诊断，另一方面，具有治疗功能的细胞，如干细胞、免疫细胞等，已被用 于攻克危害人类健康的诸多疑难杂症，如癌症、白血病等。然而，活细胞离开动物体环境后， 在不适宜的条件下会迅速死亡;在细胞培养环境下（37°C培养箱，CO 2等）虽然可以存活，但 却会不断增殖、衰老，逐渐失去活性。因此，细胞的长效保存是各类细胞应用的必要前提和 一直以来的挑战。
[0003] 目前，细胞最有效的保存手段是在低温(_80°C或_196°C)下冻存，因为细胞可以在 低温的条件下减缓甚至暂停代谢，从而使细胞达到长期保存的目的。然而，细胞的冷冻保存 往往需要加入冻存保护剂来降低细胞内外液冰晶的产生，避免细胞遭受不可修复的机械损 伤和溶质损伤以致细胞死亡。二甲基亚砜(DMSO)、卵黄和甘油是目前最常用的传统冻存保 护剂，而由于不同种细胞渗透性以及结构的不同，因此两种细胞冻存保护剂适用于不同的 细胞类型。甘油常用作细菌类以及人畜类生殖细胞的冷冻保存剂，而DMSO则适合用作动物 体细胞类的冻存保护剂。但研究发现DMSO与甘油在非冷冻条件下具有细胞毒性。例如，DMSO 会抑制细胞繁殖，改变细胞的生物功能以及引发干细胞的分化等（具体参见K. Aita et al.Apoptosis in murine lymphoid organs following intraperitonea I administration of dimethyl sulfoxide(DMSO)·《Experimental and Molecular Pathology)),2005,79,265-271；R.Pal et al.Diverse effects of dimethyl sulfoxide (DMSO)on the differentiation potential of human embryonic stem cells. 《Archives of Toxicology》，2012,86,651_661;B.Hegner et al. Differential regulation of smooth muscle markers in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells.《Journal of Hypertension》2005,23，1191_1202.)D因此，如果使用DMSO作为 细胞冻存保护剂，必须要尽可能的缩短它在非冻结状态下与细胞的接触时间，而在细胞使 用之前，需要充分冲洗去除DMS0。然而，依然有大量研究表明，在细胞治疗领域中，使用DMSO 保存过的干细胞，无论如何冲洗，注入人体仍会对人体产生致命的副作用。一方面可能是因 为已进入细胞内的DMSO难以彻底清洗掉，另一方面可能是DMSO已经对细胞的生理功能和活 性产生了有害的影响（具体参见B.Calmels et al.Preclinical evaluation of an automated closed fluid management device:CytomateTM,for washing out DMSO from hematopoietic stem cell grafts after thawing . Bone Marrow Transplantation.2003，31，823_828.)D
[0004] 此外，卵黄的使用也具有以下不足：1)卵黄成分复杂，含有一些对细胞有害的成分 如大颗粒物质，高浓度的脂蛋白等;2)卵黄通常来源于家禽的蛋，可能携带一些潜在的传染 性病原体(病毒、细菌、支原体），增加疾病传播的风险;3)不同来源的卵黄质量参差不齐，冻 存保护效果存在差异，难以标准化。因此，传统冻存保护剂的毒性已经成为活细胞在各个领 域，尤其是细胞治疗、再生医学等临床领域成功应用的瓶颈问题。
[0005] 另外，使用传统保护剂需要进行梯度降温（"慢冻"）的冻存操作过程，通常需要约 一天的时间。这是因为DMSO进入细胞能力有限，而为了使DMSO能够慢慢渗入细胞减少降温 造成的细胞内机械和溶质损伤，它保存细胞的方法是需要梯度降温（如降温速率1°C每分 钟），即必须将加有DMSO的细胞悬液在4°C、_20°C、_80°C的条件下依次分别放置一定的时 间，以达到传统冻存技术中"慢冻"的要求。这种"慢冻"技术非常繁琐耗时，不仅加剧了有毒 冻存保护剂与细胞的接触时间，增加了细胞损伤的机会，还需要多种冷冻设备（如_80°C低 温冰箱，-20°C冰箱、4°C冰箱等），另外一旦稍许没有达到"慢冻"的降温速率要求，冻存效率 就会显著下降。因此，无毒、高效，并且不需要繁琐冻存步骤的冷冻保护剂对生物医学等领 域具有重大意义。
[0006] 此外，专利文献1(US4980277)公开了用于家畜的精子卵子运输储存的组合物，该 组合物包括甘油5ml(87%)和Merk溶液等组分，而Merk溶液中含有EDTA。本领域专业人士可 知，甘油是保护冻存细胞的主要物质，专利文献1用5ml (87%)的甘油保存动物精子，一方面 甘油才是在冻存精子中起到了决定性作用的冻存保护剂，具体请参见参考文献(Polge et al. Revival of spermatozoa after vitrification and dehydration at low temperature.Nature 164:666(1949));另一方面，甘油，EDTA有很大细胞毒性众所周知， EDTA是Ca2+离子螯合剂，会螯合细胞所必需的钙离子从而影响细胞，另外，EDTA对人体也有 显著的毒害作用，会刺激皮肤、黏膜，从而引起哮喘、皮肤发疹等症状，是一种可能引起过敏 的物质。它通过丙二醇等透皮吸收助剂被人体摄取后会引起钙缺乏症，血压降低，肾脏障 碍，染色体异常和原生变异等一系列有害作用（具体参见Singh K.et al. Interaction of EDTA with tributyltin induced cellular toxicity.Indian J Exp Biol.1989Sep；27 (9):833-4.，）；此外，甘油的毒性也有大量文献报道（具体参见J Witowski et al.Glycerol toxicity for human peritoneal mesothelial cells in culture: comparison with glucose·《International Journal of Artificial Organs》，1994，17 (5) :252-260),而且甘油的细胞渗透性较低，难以在冻存过程中进入细胞发挥保护作用，尤 其对于一些细胞膜渗透性较差的细胞系，甘油的冻存复苏效果极差。
【发明内容】
[0007] 发明要解决的问题
[0008] 本发明旨在针对现有细胞冻存技术中冻存保护剂毒性大、操作繁琐、冷冻保存（以 下简称为"冻存"）效率不稳定等不足，提供一种包含具有通式结构R 1-N+(CH3)2-(CH2) n-R2的 两性分子、无需任何对细胞有毒性的细胞冻存保护组分(如甘油或DMS0)辅助的细胞冻存保 护组合物，以及该组合物的用途和使用该组合物的对细胞进行冷冻保存的方法。本发明所 述细胞冻存保护组合物可以适用的冻存细胞浓度和细胞种类范围较广，能够实现细胞复苏 后存活率高。另外本方法提供的冻存保护组合物冻存步骤简单易行，不需要使用多种大型 冻存设备，能够有效降低细胞冻存成本，提高冻存效率。
[0009] 用于解决问题的方案
[0010] 本申请的第一方面提供一种细胞冻存保护组合物，其包含一种或多种具有通式结 构Ri-N+(Ofe) 2-(CH2)n-R2的两性分子、以及细胞用养料成分，
[0011]其中相对于100质量份的所述细胞用养料成分，所述两性分子为1〇~2530质量份；
[0012] 所述细胞冻存保护组合物不包含以下物质:甘油、二氨基乙烷四乙酸或其盐、二甲 基亚砜、或卵黄，
[0013] 在所述通式结构办-以强乃气强八，中，
[0014] 上述R1为碳数1至10的直链或支链的烷基，其任选被选自由（甲基）丙烯酰胺基、 (甲基)丙烯酰氧基、烯基、羟基、羟基烷基、烷氧基、和卤素组成的组中的取代基取代，
[0015] R2为选自由-C00_、_S〇4'-SO3
组成的组中的任一种带负电荷 的基团，所述R3为选自由（甲基)丙烯酰氧基烷基、烷基、和烯基组成的组中的基团，
[0016] 所述(CH3)2和(CH2) n可各自独立地任选被选自由烷基、烯基、羟基、羟基烷基、烷氧 基、聚环氧烷基、和卤素组成的组中的取代基取代，
[0017] η为1至10的整数。
[0018] 所述细胞冻存保护组合物中，所述通式结中，
[0019] 上述R1为碳数1至5的直链或支链的烷基，其任选被选自由（甲基）丙烯酰胺基、（甲 基)丙烯酰氧基、羟基、羟基烷基、烷氧基、和卤素组成的组中的取代基取代，
[0020] 上述R2为选自由-COO'-SO3'组成的组中的任一种基团，所述 R3为（甲基)丙烯酰氧基烷基，
[0021] 所述（CH3)2和（CH2) n中的氢原子可各自独立地任选被选自由烷基、羟基、羟基烷 基、烷氧基、聚环氧烷基、和卤素组成的组中的取代基取代，
[0022] η为1至5的整数。
[0023]所述细胞冻存保护组合物中，相对于100质量份的所述细胞用养料成分，所述两性 分子为420~1120份;和
[0024]所述通式结构 R1-N+(CH3 )2-(CH2)n-R2 中，
[0025]上述R1为碳数1至3的直链或支链的烷基，其任选被选自由（甲基）丙烯酰胺基、（甲 基)丙烯酰氧基、羟基、碳原子数1至5的羟基烷基、和碳原子数1至5的烷氧基组成的组中的 取代基取代，
[0026]所述（CH3)2和（CH2)n中的氢原子可各自独立地任选被选自由碳原子数1至5的烷 基、羟基、碳原子数1至5的羟基烷基、碳原子数1至5的烷氧基、和聚环氧烷基组成的组中的 取代基取代，
[0027