一种免疫细胞的储存方法及细胞冻存液的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞保存技术领域，具体涉及一种免疫细胞的储存方法及细胞冻存 液。
【背景技术】
[0002] 免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，包括淋巴细胞、树突状细 胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等。近年来肿瘤和病毒的免疫治疗技术应用于临床， 可通过自体的免疫细胞经体外刺激、培养、扩增然后回输来提高患者的免疫力。免疫细胞治 疗主要来自患者自身外周血，通过分离和收集得到外周血单个核细胞。但一般说来，接受免 疫细胞治疗的群体主要为肿瘤或病毒感染人群，此类人群其本身的免疫细胞机能已十分低 下，分离出免疫细胞活性较低。因此人们可在自身免疫细胞活性强时，提前将健康细胞储存 起来，以备将来治病之需。
[0003] 目前常用的做法是利用低温冻存技术保存外周血单个核细胞，在需要时复苏并诱 导培养为各种免疫细胞，但冻存过程会显著改变细胞化学及物理环境，同时伴随生物性损 伤的危险。现有技术使得复苏的细胞活性不高，细胞存活率低，且目前冻存细胞的细胞冻存 液，大都含有动物血清，即含有相对人体来说的异种蛋白，增加了传染病的风险;现有技术 对储存免疫细胞的细胞库进行管理和追踪，存在样本数据信息易丢失及混乱等弊端，容易 造成免疫细胞样本与数据信息不匹配，存在一定的安全隐患。
【发明内容】
[0004] 为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种简单有效、 安全可靠、细胞复苏活力高的免疫细胞的储存方法及细胞冻存液。本发明的目的通过下述 技术方案实现： 一种细胞冻存液，按照体积百分比，包含以下组分： 无血清液体培养基 0~62% 青霉素和链霉素双抗溶液 0.5~1.5% 二甲基亚砜 5~10% 自体血浆 30~92%， 上述体积百分比的总和为100%。
[0005] 进一步地，所述细胞冻存液，按照体积百分比，包括以下组分： 无血清液体培养基 7~55% 青霉素和链霉素双抗溶液 0.8~1.2% 二甲基亚砜 5~10% 自体血浆 35~85%， 上述体积百分比的总和为100%。
[0006] 进一步地，所述细胞冻存液，按照体积百分比，包括以下组分： 无血清液体培养基 52% 青霉素和链霉素双抗溶液 1% 二甲基亚砜 7% 自体血浆 40%。
[0007] 进一步地，所述无血清液体培养基为GIBCO的ABl-V培养基。
[0008] 进一步地，所述自体血浆的制备包括以下步骤:将人体外周血离心后，取出上层血 浆放入容器内，在55~60°C温度下灭活后，置于-18~-22°C温度下冻存;然后在3~5°C条件 下离心即得到细胞冻存液用的自体血浆。
[0009] 进一步地，所述青霉素和链霉素双抗溶液为GIBCO青霉素和链霉素双抗溶液。 GIBCO青霉素和链霉素双抗溶液每毫升包含10000单位青霉素(碱)和1000 OlIg链霉素(碱）， 利用0.85%盐液形式的青霉素 G(钠盐)和硫酸链霉素，其抗菌谱包括革兰氏阳性和革兰氏阴 性细菌。青霉素和链霉素双抗溶液可保证细胞储存过程中处于无菌状态，且对免疫细胞无 不良影响，安全可靠。
[0010] 进一步地，所述二甲基亚砜为SIGMA型号为472301的二甲基亚砜。二甲基亚砜能提 高细胞膜对水的通透性，降低溶液的冰点，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减 少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。
[0011] 本发明的细胞冻存液添加人自体血浆，人自体血浆与血清成分相似，亦含有免疫 细胞生长所需的各种细胞因子及营养物质，且属于免疫细胞分离的副产物，方便获取，不存 在异源性，避免了外源血清存在的安全隐患;细胞冻存液中加入青霉素和链霉素双抗溶液， 可保证免疫细胞储存过程的无菌状态，提高安全性。
[0012] -种免疫细胞的储存方法，包括以下步骤： (1) 外周血单个核细胞分离和收集:取Ficoll淋巴细胞分离液，然后将事先制备的细胞 悬液加入到Ficoll淋巴细胞分离液的上层进行离心处理；吸取白膜层细胞，加入PBS混匀 后，计算单个核细胞总数与细胞活力并进行离心处理;弃上清液，加入PBS混匀后再次离心， 弃上清液后，收集得外周血单个核细胞； (2) 加入细胞冻存液:根据所得外周血单个核细胞总数与细胞活力计算结果，在步骤 (1)收集得到的外周血单个核细胞中加入细胞冻存液后混匀，处理后得到细胞重悬液，取样 做微生物检测； (3) 细胞冻存:将细胞重悬液分装入冻存袋中，再将冻存袋装入冻存袋盒中，进行程序 降温至-78~-82°C后转至-196Γ液氮罐冻存。经检测合格后出具储存合格报告。
[0013] 进一步地，所述步骤⑶中，细胞重悬液的细胞密度为5 X IO6~2 X 107/mL。
[0014] 进一步地，所述免疫细胞的储存方法，还包括以下步骤： (4) 细胞库样本的监控和追踪:采用同体芯片智能系统记录细胞储存位置、温度及细胞 来源信息，建立细胞库，对细胞库样本进行实时监控和追踪。
[0015] 进一步地，所述步骤(4)具体为：当所述步骤(3)将细胞重悬液分装入冻存袋后，于 冻存袋上贴上记录细胞信息的标签，并置于已负载芯片的冻存袋盒中，应用芯片读取器读 取芯片并录入同体芯片智能系统，且对芯片负载的细胞样本在系统中进行信息编辑以确保 细胞样本与芯片信息正确对应，将冻存袋盒置于程序化冷冻仪内进行程序降温后，再将冻 存袋盒置于同样已负载芯片的冻存架，放入液氮罐中储存。采用该方法能对细胞库样本进 行实时监控及追踪。
[0016] 进一步地，所述免疫细胞的储存方法，还包括以下步骤： (5)复苏细胞的培养:将液氮冻存的细胞重悬液的单个核细胞复苏后，用CIK细胞培养 基重悬，加入到已预先用抗⑶3单抗和retronectin包被好的培养容器中，添加包裹有IFN-γ因子的缓释微囊;之后置于37°C，5%C02培养箱中培养，且培养过程中调整细胞密度为5X IO 5~2 X IO6AiLmL;视细胞生长情况补液，扩大培养，并计数;共培养16~18天。优选地，培养 时间为17天，有利于CIK细胞的扩增和成熟，以获得足够多的细胞，减少因不同受试者细胞 活性差异因起细胞扩增数目不足。
[0017] 进一步地，所述CIK细胞培养基为A頂-V培养基，含有浓度为1000IU/mL的IL-2,浓 度为160 IU/mL的硫酸庆大霉素。IL-2可刺激和维持T细胞的分化增殖，刺激自然杀伤(NK)细 胞的增殖和活化，诱导淋巴因子活化杀伤(LAK)细胞。硫酸庆大霉素为氨基糖苷类抗生素， 对各种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有良好的抗菌作用，可使诱导增殖的细胞符合微 生物检测指标符合要求且不影响细胞的生长。
[0018] 抗⑶3单抗和retronectin联合包被培养CIK细胞，retronectin可参与细胞的分增 殖化以及附着、伸展，抵抗淋巴细胞增殖过程中由于高度活化所诱发的的细胞凋亡，并进一 步促进了抗CD3单抗与CIK细胞的附着和接触，提高了 CIK细胞的培养效率。
[0019] 进一步地，所述缓释微囊的粒径为20-50μπι，可使IFN-γ因子的结构得到较好的保 护。
[0020] 进一步地，所述缓释微囊包括以下质量百分比的组分：IFN-γ因子9-11%、肝素 1-2%、海藻酸钠 14-16%、碳酸锌1-3%，余量为生物相容性聚合物。
[0021] 海藻酸钠