一种几丁质合成抑制类杀虫剂及其制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于昆虫控制领域，具体涉及一种几丁质合成抑制类杀虫剂，以及该杀虫 剂的制备方法及应用。
【背景技术】
[0002] 几丁质（chitin)，又称甲壳素，是N-乙酰氨基葡萄糖的多聚糖，广泛存在于真菌和 节肢动物中，是昆虫外骨豁、气管与中肠围食膜（peritrophic matrix，PM)的重要组分 (Cohen，2001 ;Merzendorfer ,2006)。目前也有研究表明几丁质也是部分昆虫虫卵的重要组 分，比如埃及伊蚊（Aedes aegypti)、赤拟谷盗（Tribolium castaneum)和长红猎蝽 (Rhodnius prolixus)(Arakane et al.,2008；Mansur et al.,2014；Moreira et al., 2007)。昆虫几丁质的生物合成通路始于海藻糖，终止于几丁质(Candy et al.，1962)，其中 涉及了8个酶的参与，最后一个酶为几丁质合成酶(Chitin synthase ,CHS)。在其作用下，几 丁质前体物尿苷二磷酸酯-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)合成为几丁质。昆虫生长中要 经历蜕皮和变态过程，而这些过程中涉及新几丁质的形成和旧几丁质的降解。同时几丁质 强化昆虫的外骨骼，起到良好的支持作用，并在昆虫及其虫卵应对外界环境压力和病原侵 害时具有重要的防护功能（Kramer and Koga, 1986;Merzendorfer and Zimoch, 2003; Moussian et al. ,2005)。因此几丁质合成酶CHS对于昆虫的生长发育和繁殖有着非常重要 的作用，下面主要就昆虫中CHSA的结构和功能作简要概述。
[0003]昆虫中存在2个几丁质合成酶基因，分别为几丁质合成酶A基因（CHSA)和几丁质合 成酶B基因（CHSB)。在铜绿果绳(Lucilia cuprina)中克隆得到了第一个昆虫几丁质合成酶 基因，后经分析为A基因 （Tellam et al.，2000)，而后几丁质合成酶基因在许多昆虫中克隆 并得以研究。通过对多个物种的几丁质合成酶基因的研究，发现几丁质合成酶A主要在表皮 和气管中表达，负责表皮和气管几丁质的合成;而几丁质合成酶B基因仅在中肠中表达，负 责中肠围食膜几丁质的合成（Arakane et al.，2004;Merzendorfer and Zimoch，2003;Qu &11(1￥&1^，2011)。在半翅目昆虫中，如褐飞風（附1&。&1'￥&七&1耶6118)、灰飞風（1^〇(16]^]1&叉 striatellus)、长红猎蝽仅克隆得到几丁质合成酶A，并且研究表明半翅目昆虫的中肠没有 围食膜的存在，仅有围微绒毛膜(perimicroviliar membrane)，是一类包围中肠微绒毛的 胞外脂蛋白膜(Mansur et al.，2014;Wang et al. ,2012)。这说明在褐飞虱这一类半翅目 昆虫中，CHSA是最重要的几丁质合成基因。
[0004]几丁质合成酶参与几丁质合成的最后一个环节，昆虫中对其功能已有大量研究。 Moussian等通过果绳krotzkopf verkehrt(kkv，即果绳的CHSA)突变体的研究和RNAi实验， 发现昆虫的发育是基于几丁质合成酶的精确表达(Moussian et al. ,2005)。通过RNAi技术 干涉赤拟谷盗几丁质合成酶基因的表达，显著降低了幼虫和成虫的表皮与中肠中的几丁质 含量。不同时期的虫体注射CHSA的dsRNA后，会导致赤拟谷盗在胚胎的孵化障碍和幼虫、化 蛹及羽化时的蜕皮障碍(Arakane et al.，2005);并且赤拟谷盗成虫在CHSA被干涉后，虫卵 的几丁质含量严重下降，导致其无法孵化(Arakane et al. ,2008)。被注射dsCHSA的长红猎 蝽，卵巢发育受到影响，同时卵粒出现大量干瘪和发暗的现象，成为死卵(Mansur et al.， 2014;Souza-Ferreira et al. ,2014)。甜菜夜蛾的CHSA基因被干涉后，存活率显著下降，并 且出现銳皮障碍、无法化蛹和表皮几丁质层无法形成(Chen et al. ,2008)。
[0005] 由于CHSA在昆虫生长发育中的重要性和几丁质存在的特殊性，许多几丁质合成酶 抑制剂被开发用于害虫控制。这些主要为核苷肽类化合物，如尼克霉素(nikkomycins)类化 合物。此外，还有一类几丁质合成抑制剂，如苯甲酰基脲类化合物（benzoylphenyIurea， BPU)，虽然其几丁质合成抑制的作用机制仍有待阐述，但是已经有成功商品化的 Diflubenzuron(DFB)和Lufenuron(LFN) (Gangishetti et al ·，2009)。这些杀虫剂的重要 优点是对环境安全友好。但由于昆虫抗药性的增加，以及新型结构研发难度大，这极大地限 制了此类杀虫剂的使用，对基于CHSA的昆虫生长发育的机理进行深入研究，将有助于我们 寻找到新的几丁质合成抑制类杀虫剂。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服现有技术的缺点和不足，提供一种针对褐飞虱防治效果显 著的几丁质合成抑制类杀虫剂。
[0007] 本发明的另一个目的是提供所述几丁质合成抑制类杀虫剂的制备方法。
[0008] 本发明的再一个目的是提供所述几丁质合成抑制类杀虫剂在制备用于防治褐飞 虱的药物中的应用。
[0009] 本发明的又一个目的是提供使用所述几丁质合成抑制类杀虫剂防治褐飞虱的方 法。
[0010] 本发明的又一个目的是提供含有所述几丁质合成抑制类杀虫剂的组合物。
[0011] 为了实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
[0012] -种几丁质合成抑制类杀虫剂，包括作为活性成分的双链RNA，所述双链RNA的转 录模板的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0013] 本发明还提供了所述几丁质合成抑制类杀虫剂的制备方法，包括以下步骤：
[0014] 1)提取褐飞虱总RNA:取若虫，于液氮中研磨，用TRIzoI法提取总RNA;
[0015] 2)合成CDNA第一链:将Iyg总RNA反转录为CDNA;
[0016] 3)制备褐飞虱几丁质合成酶A基因中间片段，以及含有该中间片段的载体；
[0017] 4)以所述步骤3)的含有褐飞虱几丁质合成酶A基因中间片段的载体为模板，扩增， 得到目的片段。
[0018] 具体地，步骤3)的具体操作如下：
[0019] 步骤1、聚合酶链式反应:试剂为模板cDNA 1μL、10μΜ的褐飞虱几丁质合成酶A基因 特异性上游引物NlCHSA-F 1μL、10μΜ的褐飞虱几丁质合成酶A基因特异性下游引物犯0^八-R lyL、2XHiFi Taq PCR mix 12.5yL、双蒸水9.5yL，总体积为25yL;上述聚合酶链式反应 的具体步骤如下:将上述混合液95°C预变性5min，然后进入下列循环:95°C变性30s，55°C退 火30s，72°C延伸60s，共35个循环，最后72°C再延伸IOmin;其中，扩增褐飞虱几丁质合成酶A 基因特异性片段的上游引物NICHSA-F的序列为:5 ' -GAAGACAAGGCTGAGAAGG-3 ' ；下游引物 NlCHSA-R的序列为：5' -GGAATCGITTGCGGAAGG-3' ；
[0020]步骤2、扩增产物纯化:使用Magen凝胶回收试剂盒纯化PCR扩增片段；
[0021 ]步骤3、中间载体获得:将纯化产物按照下列连接反应体系，克隆到pMD-18T载体， 转化大肠杆菌DH5a，在含有100微克/毫升氨节青霉素的LB平板上过夜培养；
[0022]连接反应体系： 纯化产物 3pL PMDl 8-T
[0023] 连接缓冲液5pL 双蒸水补足1〇μL
[0024] 步骤4、质粒纯化:将菌落接种于LB液体培养基，37 °C摇床过夜培养后收取菌液，抽 提质粒。
[0025] 具体地，所述步骤4)的具体操作如下：
[0026]步骤1、设计以下特异性引物：
[0027] dsCHSA-F:5 '-GAAGACAAGGCTGAGAAGG-3，
[0028] dsCHSA-R:5 '-GGAATCGTTTGCGGAAGG-3 '
[0029] dsCHSA-T7F:5 '-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAAGACAAGGCTGAGAAGG-3，
[0030] dsCHSA-T7R:5 '-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGGAATCGTTTGCGGAAGG-3 '
[0031]步骤2、含有褐飞虱几丁质合成酶A基因的质粒命名为pMDT-CHSA，以其为模板，使 用上述引物分别按照以下反应条件扩增，得到目的片段：
[0032] A反应体系如下： 2 X HiFi PCR mix 1.2.5pL， pMDT-CHSA 质粒 DNA IgL, ΙΟμΜ dsCHSA-F 引物 lpiL，
[0033] 1 ΟμΜ dsCHSA-T7R 引物 1 μι， 双蒸水 9:5μ：?， 总体积 25pL;
[0034] B反应体系如下： 2xHiFi PCR mix 12 5μΓ」， pM DT-CHSA ItiiIA DNA IgL, l_MdsCHSA-T7-F 引物 WL,
[0035] IC^M dsCHSA-R 引物 ΙμL， 双蒸水 9 5μΙ， 总:体积 25pL..,
[0036] PCR仪扩增程序：94°C预变性5min;94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸90s，30个 循环;72 °C再延伸IOmin;
[0037] 通过dsRNA合成试剂盒合成几丁质合成酶基因对应的双链RNA。
[0038] 本发明还提供了所述几丁质合成抑制类杀虫剂在制备用于防治褐飞虱的药物中 的应用。
[0039] 本发明还提供了使用所述几丁质合成抑制类杀虫剂防治褐飞虱的方法，其包括： 将所述几丁质合成抑制类杀虫剂单独混在饲料中，对褐飞虱进行饲喂。
[0040] 优选地，所述双链RNA在饲料中的终浓度为0.1 ygAiL至0.5yg/yL。
[0041] 本发明还提供了含有所述几丁质合成抑制类杀虫剂的组合物。
[0042] 目前防治褐飞虱的主要办法包括农业防治、化学防治和生物防治，由于化学药物 带来的抗性作用以及环境污染等问题，使得褐飞虱防治工作难以得到持续性发展。本发明 的几丁质合成抑制杀虫剂的主要活性成分为双链RNA(dsRNA)，该双链RNA的转录模板为褐 飞虱几丁质合成酶A基因（NlCHSA)。本发明通过利用褐飞虱几丁质合成通路上的重要基因， 筛选得到双链RNA，将其用以褐飞虱防治，可有效阻碍几丁质的合成，从而阻碍褐飞虱的正 常发育和繁殖，防治效果显著，而且不会产生抗药性和环境污染，不破坏生态环境，安全环 保。
【附图说明】
[0043]图1是饲喂dsCHSA后褐飞虱的存活率图。
[0044]图2是饲喂dsCHSA后褐飞虱的表型变化图。
[0045]图3是注射dsCHSA后褐飞虱的后代孵化率图。
[0046] 图4是饲喂dsCHSA后褐飞虱的mRNA表达量图。
[0047]图5是饲喂dsCHSA后褐飞虱的几丁质含量图。
【具体实施方式】
[0048] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0049] 实施例1
[0050] 按照以下步骤制备dsRNA:
[0051] 1.选取褐飞虱各龄期若虫
[0052] 2.总RNA的提取:取20头若虫，液氮中研磨，用TRI zol法提取总RNA。
[0053] 3.cDNA第一链的合成：按照使用Takara公司的PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒说明书，将Iyg总RNA反转录为cDNA。
[0054] 4.下面描述NlCHSA中间片段制备过程。
[0055] (1)聚合酶链式反应(PCR)试剂(GenestarTaq DNA聚合酶HiFi)和反应条件： 模板 cDNA I^L NlCHSA特异性上游弓丨物NlCHSA-F(K^m) I^iL NlCHSA 特异性下游引物 MCHSA-R(K^im)