一种Ogura型萝卜雄性不育细胞质及其选育方法
【专利摘要】本发明涉及作物育种技术领域，特别涉及一种Ogura型萝卜雄性不育细胞质及其选育方法。该Ogura型萝卜雄性不育细胞质，其特征在于：具有所述不育细胞质的雄性不育系雄蕊退化彻底，不能形成具有正常功能的花粉，而雌蕊发育正常，低温下花蕾不黄化，其育性的保持与恢复与原Ogura型雄性不育系有差异。本发明雄性不育细胞质的发现，既可以作为正常的雄性不育材料进行作物杂交育种，拓宽了保持系的选择范围，又可利用它进一步揭示orf138不育基因的作用机理，对萝卜细胞质雄性不育的深层次研究具有十分重要的意义。CCTCC NO：P20152020151120
【专利说明】一种Ogura型萝K隹性不育细胞质及其选育方法
[0001] ( - )技术领域 本发明涉及作物育种技术领域，特别涉及一种Ogura型萝卜雄性不育细胞质及其选育方法。
[0002] (二)【背景技术】 植物雄性不育是指植物在花器发育上，雌蕊发育正常，能够正常的接受花粉，形成胚， 最后发育成种子;而雄蕊的花粉、花粉囊等由于受基因型、环境条件等因素的影响，不能产 生具有功能作用的花粉的现象。
[0003] 由基因型造成的雄性不育，又分为两种类型：一种核基因控制的雄性不育，它又分 为显性核雄性不育和隐性核雄性不育，核基因控制的雄性不育系所选出的保持系，只有50% 的保持率，在其后代中有一半可育株和一半不育株，在生产中不结合其它措施很难直接应 用。另一种是细胞质基因控制的雄性不育，又称细胞质雄性不育，其本质是细胞核和细胞质 基因互作形成的雄性不育，就是雄性不育株必须带有具有雄性不育基因的细胞质，同时，在 核基因中不能含有该不育基因的恢复基因。这里所说的"恢复基因"是指能够恢复不育系育 性的基因，当雄性不育株含有该恢复基因后，不育株的雄性育性就恢复正常。当一个同类的 个体在细胞质中既不含有不育基因，在细胞核中又不含有恢复基因，该个体就是这个不育 系的保持系，它的保持率是100%。在作物的雄性不育系育种中绝大多数都利用细胞质雄性 不育的这个特性来进行品种选育的。如水稻、玉米、萝卜、甘蓝、油菜、菜花、洋葱等。
[0004] 萝卜雄性不育同样表现为花药退化，或不能形成具有正常功能的花粉，而雌蕊发育 正常。生产上使用的萝卜雄性不育系是由细胞质基因和细胞核基因共同互作，形成的一种雄 性不育现象。萝卜细胞质雄性不育基因存在于线粒体DNA上，主要是由于线粒体基因组分子 内或分子间频繁重组所形成的异常嵌合基因造成的。研究发现，萝卜雄性不育的主控基因为 〇rf!38与线粒体基因组中具有正常功能的基因共转录，产生异常转录本和翻译产物，从而 在花药发育的某个时期干扰线粒体的正常功能发挥，最终导致雄性不育现象的发生。线粒 体基因组的转录和翻译产物虽然只占整个细胞质基因组产物的很少部分，但其转录和翻译 情况比较复杂。
[0005] 至今为止，在萝卜雄性不育基因类型中，Ogura雄性不育是导入率和稳定性最佳的 不育材料，也是目前研究最为深入的一种雄性不育材料，日本学者Yamagishi通过对野生 种、栽培种等不育材料的〇rf!38基因进行测序分析，发现Ogura雄性不育基因 〇rf!38可以分 为九个变异类型（如下表），已经明确导致雄性不育的有A、B、D、F、H型，A型通称为Ogura型，F 型称为Kosena型，有人研究，A型和F型的保持和恢复关系是一致的。其它类型之间的育性恢 复和保持关系尚不确定，不同类型间除〇rf!38基因以外线粒体DNA变异对细胞质雄性不育 的影响也不明确。
[0006] Ogura雄性不育基因 orf 138的九个类型一览表
注:表中Δ a栏的"+"为基因中缺失39个碱基对。Orfl38类型中A为最早发现的测序的序 列。其它栏中为与A型没有变化。
[0007] 目前萝卜育种和生产中普遍使用的是Ogura型细胞质雄性不育系，由于有的材料因 含有纯合恢复基因选不出保持系，限制了不育系的使用，在萝卜育种和生产上迫切需要多种 类型的不育材料，拓展保持系的选择范围，提高雄性不育育种的成功率。
[0008] (三)
【发明内容】
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种Ogura型萝卜雄性不育细胞质及其选育方法。
[0009] 本发明是通过如下技术方案实现的： 一种Ogura型萝卜雄性不育细胞质，其特征在于:具有所述不育细胞质的雄性不育系雄 蕊退化彻底，不能形成具有正常功能的花粉，而雌蕊发育正常，低温下花蕾不黄化，其育性 的保持与恢复与原Ogura型雄性不育系有差异;其保藏号为CCTCC No:P201520，分类命名 为:萝卜雄性不育系R64A Raphanus sativus L.;保藏单位是中国典型培养物保藏中心，地 址湖北省武汉市武汉大学校内，保藏日期为20151120。
[0010]本发明所述的Ogura型萝卜雄性不育细胞质的选育方法，包括如下步骤： (1) 选择检测后的具有Ogura A型雄性不育细胞质的可育纯合植株作为父本，以其他非 Ogura A型细胞质的雄性不育材料作母本，进行杂交筛选； (2) 在杂交后代中表现为全部不育的，即表示该不育材料与Ogura A型细胞质雄性不育 存在育性的差别，经多代杂交验证之后，明确两者确实存在育性保持与恢复上的差异； (3) 将获得的具有新型萝卜雄性不育细胞质的材料进行orfl38基因的PCR分子标记与片 段测序，比较两者之间在〇rfl38基因上的序列差异； (4) 对新型不育系细胞质线粒体DNA进行测序、组装； (5) 比较新的不育细胞质与Ogura A型不育细胞质在线粒体DNA上的差异。
[0011]本发明的更优技术方案为： 步骤（1)中，用Ogura特异引物：0RF-F 5 ' -TTCAAATCCTGTCCCCGCACC-3 ' 和0RF-R 5 ' - GCCTTACACCATTGGGATACTTC-3 '，对新型萝卜细胞质雄性不育材料及可育纯合植株进行PCR分 子标记。
[0012] 本发明由于采用以上技术方案，具有以下优点： (1) 拓宽了Ogura型萝卜雄性不育保持系的选育范围，原来只是从具有非Ogura细胞质类 型的材料中选育保持系，通过该方法，同样可以从具有Ogura细胞质类型的材料中选育保持 系，有效解决了一些性状优良的具有Ogura细胞质材料的三系利用问题;特别是随着雄性不 育系制种的不断增加，该类型材料将会越来越多； (2) 本发明涉及的一种新型Ogura雄性不育细胞质，对进一步研究Ogura细胞质雄性不 育机理提供一个十分重要的材料； (3) 本发明涉及的雄性不育细胞质同样具有一般雄性不育系的功能，能够进行杂交种 的配制与选育。
[0013] 本发明打破了传统保持系的选育范围和方法，以新发现的雄性不育系为不育材 料，从具有〇gura-A细胞质类型的可育萝卜植株中选育出了雄性不育系的保持系。通过对两 个材料细胞质线粒体进行测序、组装，两者的线粒体DNA除在orfl38基因中的第165574和 165613处有两个碱基上的差异外，在整个线粒体DNA中还有53个碱基的变异和插入与缺失。 两者虽然同为Ogura细胞质雄性不育系，但它们的育性有着明显的差别，证明本发明所采用 的新雄性不育系与传统的Ogura-A型雄性不育系有所不同，是一个新的不育材料，具有新的 不育型细胞质。
[0014] 该雄性不育细胞质的发现，既可以作为正常的雄性不育进行作物杂交育种，拓宽 了保持系的选择范围，又可利用它进一步揭示〇rf!38不育基因的作用机理，对萝卜细胞质雄 性不育的深层次研究具有十分重要的意义。
[0015] (四）【附图说明】 下面结合附图对本发明作进一步的说明。
[0016]图1为本发明的选育技术路线图； 图2为对不育系和保持系各选取5株，用Ogura特异引物进行PCR分子标记，在1000bp处 出现一条一致的明亮条带，标明两者都含有〇rf!38基因的示意图；注：1，2,3，，4,5SR64A， 6,7,8,9，l〇SHF17-5-1-l;]\C%marker ; 图3为不育系R64A与保持系HF17-5-1-1测序结果比较示意图； 图4为R64A与日本测序的Ogura-Α型雄性不育材料线粒体DNA Blast比对结果示意图。 [0017](五)【具体实施方式】 下面结合附图和实施实例对本发明进行详细的描述。
[0018] 首先选择雄性不育材料和具有Ogura型雄性不育细胞质的纯合可育材料，本发明 选用的雄性不育材料有5个，5个不育材料均来自国内地方品种，具有Ogura型雄性不育细胞 质的纯合可育材料为山东地方品种枣庄大红袍，枣庄大红袍为红皮白心萝卜。
[0019] 先对纯合可育材料进行纯合性检测，将纯合可育材料进行自交，获得F1代种子，取 300粒F1代种子，用35 °C的温水浸泡3小时，然后放入纸基培养皿中，待种子萌动后，放入2-4 °(：的冰箱中进行春化处理25天(该过程称为种子春化处理），通过春化处理后的种子播种于 隔离网室中，待开花后，对杂交后代的育性情况进行观察统计。如果全部为可育株，说明该 材料是纯合的，如果出现一定比例的不育株，该可育材料则为杂合体，不能用于对不育材料 的筛选。
[0020] 以检测后的纯合可育材料为父本，分别与雄性不育材料进行杂交，取每个杂交组 合的F1代种子各100粒，进行春化处理，将通过春化处理的种子播种于隔离网室中，待开花 后，对杂交后代的育性情况进行观察统计。在5个不育材料的后代中，发现3号材料(R64A)后 代全部为不育，证明该可育材料能够保持R64A的不育性，即为R64A的保持系，同时也说明该 雄性不育材料与Ogura A型雄性不育存在育性上的差别。
[0021] 对R64A和Ogura A型纯合可育株进行细胞质类型的PCR分子标记与片段测序。用 Ogura 特异弓| 物：0RF-F 5 ' - T T C A A A T C C T G T C C C CG C A C C - 3 ' 和 0 RF - R 5 '-GCCTTACACCATTGGGATACTTC-3 '，对不育材料R64A及纯合可育材料进行PCR分子标记，为防止 出现取样错误，每份材料取5株，1、2、3、4、5为不育材料R64A，6、7、8、9、10为纯合可育材料 HF17-5-1-l，PCR标记结果如图2，10个样本都在大约100(^?处出现了一条明亮、清晰的条 带，说明两者皆为Ogura细胞质类型。对图2中的4、5、6、7四份样品，通过对PCR琼脂糖凝胶割 胶回收，进行分子测序。
[0023] 不育材料R64A和纯合可育材料HF17-5-1-1在orfl38区段的第61和第99个碱基上 出现差异（图3)，不育材料R64A在第61个碱基由A变为C(A-C)，第99个碱基由A变为G(A- G)〇
[0024] 进一步对不育材料R64A进行细胞质线粒体DNA序列测序、组装。
[0025]将R64A种植于课题组试验田，田间管理按常规方法进行，待植株发育至10片叶时， 取健康单株的顶部嫩叶l〇〇g。按5mL/g(鲜重)加入匀浆缓冲液，用预冷的高速组织捣碎器在 4°C下捣碎组织，四层纱布过滤，收集滤液。滤液经2000g离心15min后，取上清，17000g离心 lOmin，取沉淀，后两步重复两次，即为粗提线粒体和叶绿体。
[0026] 利用蔗糖衬垫法纯化线粒体和叶绿体，将粗提线粒体和叶绿体悬液小心铺在装 有Shelf缓冲液的离心管中，经17000g，离心15min，弃上清，此法重复两次，所得沉淀即为纯 化的线粒体叶绿体。
[0027] 在纯化后的线粒体和叶绿体沉淀中加入裂解缓冲液，混匀沉淀，再加入蛋白酶K 和10%的SDS溶液，37°C保温2h以上。裂解液经等体积酚-氯仿-异戊醇、氯仿各抽提1次后， 12000g离心取上清，再加入乙酸钠和等体积的预冷异丙醇，-20°C沉淀0.5h以上，12000g离 心lOmin，收集沉淀，70%乙醇洗涤1-2次，溶于适当体积的TE缓冲液中，于-20°C保存备用。 [0028] 测序采用11 lumina二代高通量测序，读长90bp，测序得到400M的读段数据。
[0029] 原始数据经去除测序重复，由Trimmomatic 3.0进行Clean处理后，用Fastqc对读 段进行质控检测、过滤。
[0030]对过滤的数据分别进行Kmer分析，确定适合组装的mer值，并预测测序深度及目标 基因组的大小。基因组大小的估测方法根据Marai的方法。
[0031]用Velvet软件对过滤后的各样品数据进行组装，选择mer值为21，Insert Size为 320,标准误sd为10,截止覆盖度参数则根据预计覆盖度进行设置。
[0032]根据组装得到的Contigs序列设计引物，以提取的DNA样品为模板进行PCR扩增，并 对扩增产物用Sanger法测序。
[0033] 根据Velvet组装得到的每个样品Contigs序列及扩增产物经Sanger测序后得到的 序列进行叠加，从而得到线粒体和叶绿体完整的全长基因组序列并用Mitofy软件进行基因 注释。
[0034] 将R64A线粒体DNA序列与日本公布的Ogura-Α型DNA序列（GeneBank AB694744.1) 进行Blast比较（见图4)，R64A的DNA全长为258462个碱基，AB694744.1为258426个碱基。两 者的一致性（Identities)为 258414/258471 (99%);插入与缺失（Gaps)为 54/258471。说明两 者除在orfl38基因内的两个碱基的差异外，在整个DNA序列中还存在其它的差异(见下表）， 在DNA水平和育性上两者都有明显差异的，R64A所具有的雄性不育细胞质是一个新的不育 类型。
[0035] R64A与Ogura-Α在线粒体DNA上的差异
【主权项】
1. 一种Ogura型萝卜雄性不育细胞质，其特征在于:具有所述不育细胞质的雄性不育系 雄蕊退化彻底，不能形成具有正常功能的花粉，而雌蕊发育正常，低温下花蕾不黄化，其育 性的保持与恢复与原Ogura型雄性不育系有差异；其保藏号为CCTCC P201520，保藏单位是 中国典型培养物保藏中心，地址湖北省武汉市武汉大学校内，保藏日期为20151120。2. 根据权利要求1所述的Ogura型萝卜雄性不育细胞质的选育方法，其特征为，包括如下 步骤：（1)选择检测后的具有Ogura A型雄性不育细胞质的可育纯合植株作为父本，以其他 非Ogura A型细胞质的雄性不育材料作母本，进行杂交筛选；（2)在杂交后代中表现为全部 不育的，即表示该不育材料与Ogura A型细胞质雄性不育存在育性的差别，经多代杂交验证 之后，明确两者确实存在育性保持与恢复上的差异；（3)将获得的新型萝卜细胞质雄性不育 材料进行〇rfl38基因的PCR分子标记与片段测序，比较两者之间在orfl38基因上的序列差 异；（4)对新型不育系细胞质线粒体DNA进行测序、组装；（5 )比较新的不育细胞质与Ogura A 型不育细胞质线粒体DNA序列的差异。3. 根据权利要求2所述的Ogura型萝卜雄性不育细胞质的选育方法，其特征在于：步骤 (1)中，用Ogura特异引物：0RF-F 5'-TTCAAATCCTGTCCCCGCACC-3'和0RF-R 5'-GCCTTACACCATTGGGATACTTC-3 '，对新型萝卜细胞质雄性不育材料及可育纯合植株进行PCR分 子标记。
【文档编号】A01H1/02GK105830906SQ201510934624
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2015年12月15日
【发明人】王效睦, 白静, 段乃彬, 王俊峰, 谢坤
【申请人】山东省农作物种质资源中心