一种提高蒺藜苜蓿抗盐害能力的方法
【专利摘要】本发明为一种提高蒺藜苜蓿抗盐害能力的方法，包括（1）印度梨形孢固体CM培养基的配制；（2）印度梨形孢培养及孢子悬浮液收集；（3）印度梨形孢接种蒺藜苜蓿；（4）蒺藜苜蓿幼苗的移栽和后期的管理。本发明采用印度梨形孢孢子悬浮液对种子预先浸泡，可使其寄生于蒺藜苜蓿种子的表面，促进种子提早萌发并显著提高种子的发芽率（由原来的80.0%提高到95.0%）；能显著地提高蒺藜苜蓿生物产量；利用印度梨形孢在蒺藜苜蓿根部寄生可降低蒺藜苜蓿根际中的钠离子积累，增加蒺藜苜蓿盐胁迫耐受力。
【专利说明】
一种提高蒺藜苜蓿抗盐害能力的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及微生物资源的利用和盐碱化土壤改良技术领域，尤其涉及一种提高蒺 藜苜蓿抗盐害能力的方法。
【背景技术】
[0002] 盐渍化土地是我国重要的土地类型之一。随着污水灌溉，化肥使用不当以及工业 污染等问题的不断加剧，次生盐渍化土壤面积日趋扩大，可耕地面积逐渐减少。因此，开展 盐渍化土地治理和土壤改良对于应对现阶段中国人口增长、耕地减少等问题具有重要意 义。治理土壤盐碱化的主要措施有工程措施、物理化学修复、植物修复和根际微生物修复 等。采用植物与根际微生物相结合的办法无疑是最环保的方法，不会带来二次污染。
[0003] 近年来的研究表明，一类丛枝菌根真菌与宿主植物可以形成特殊的菌根。它是自 然界广泛存在的一种由菌根真菌与高等植物根系形成的共生体。菌根真菌从植物体内获取 光合产物，同时将其从土壤中吸收的营养物质和水分传递给宿主植物，二者之间形成互利 互助、互通有无的共生关系。丛枝菌根真菌与宿主植物的共生体可以扩大宿主植物根系的 吸收面积，活化土壤养分，增加植物对矿质元素和水分的吸收，调节植物的生理生化代谢， 减缓盐胁迫对植物的影响，从而促进盐渍化生境下植物的生长，达到间接改良土壤的目的。
[0004] 中国专利申请201210273541公开了一种多手段联合修复盐碱地石油污染土壤的 方法，该发明方法利用在紫花苜蓿种子上包覆含有石油降解菌和苜蓿根瘤菌的菌剂，将包 衣的紫花苜蓿种子和低温处理后的羊草种子混合，将混合后的种子播种到盐碱地石油污染 土壤中；中国专利申请201210137704公开了一种利用丛枝菌根修复重金属污染土壤的方 法，菌种使用方法是将丛枝菌根接种于稗草根部。上述两项专利是用生物菌种来提高寄主 吸收土壤中污染物的能力，随后移除寄主植物，完成污染土壤的修复。这类方法能够降低土 壤中的有害污染物，但同时也降低了耕地的复种指数，且实际中如何处理寄主植物也是生 产的难题。中国专利申请20121007120公开了一种利用丛枝菌根真菌降低烟草重金属残留 的方法，丛枝菌根真菌和烟草形成丛枝菌根共生体，不但促进烟草生长，而且降低烟草重金 属残留。但是丛枝菌根真菌不能完成在合成培养基上的生长，不利于该菌的大规模推广应 用。
[0005] 印度梨形孢（Piriformospora indica)是一种根部内生真菌，宿主范围及其广泛， 不仅可显著促进植物生长，还可有效提高宿主抗生物和非生物胁迫能力。另外，该菌能在人 工合成培养基上生长，为其在农业和园艺业的大范围应用提供了可能。因此，通过开发利用 印度梨形孢，在不影响蒺藜苜蓿产量和品质的前提下，提高蒺藜苜蓿的抗盐害能力，为开辟 植物抗盐胁迫研究新途径，发展低投入、高效益的土地恢复措施及保护生态环境具有重要 意义。
[0006] 蒺藜苜蓿是重要的优良栽培牧草，具有很强的科研价值：如具有倍性小（2n = 16)、基因组小（全基因组470Mb)、自花授粉、植株再生时间较短、具有较高的遗传转化效率 等特点。该植物是豆科植物遗传学的模式生物，因其所具有的特点受到科研工作者的青睐。 蒺藜苜蓿在豆科牧草中的耐盐性相对较强，然而面对不断恶化的土壤环境，如何提高蒺藜 苜蓿等一类牧草在高盐度土壤中的适应性，是获得优良牧草，确保动物饲料品质、产量以及 进行盐碱地改良，合理开发利用盐渍化土地资源亟待解决课题。
[0007] 目前国内外针对盐碱地土壤改良利用根际微生物与有效植物互作的有效案例还 很少，尤其在植物种类选择、微生物种类选择及生物修复机制研究上还缺乏深入系统的研 究。蒺藜苜蓿的研发成果可扩展到其他豆科植物，为大规模利用印度梨形孢介导豆科植物 耐盐特性奠定前期基础，为我国盐碱地治理和利用开辟一条新的捷径。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于为解决上述现有技术存在的问题，提供一种提高蒺藜苜蓿抗盐 害能力的方法。本发明采用印度梨形孢孢子悬浮液对种子预先浸泡，可使其寄生于蒺藜 苜蓿种子的表面，促进种子提早萌发并显著提高种子的发芽率（由原来的80.0%提高到 95. 0% );能显著地提高蒺藜苜蓿生物产量；利用印度梨形孢在蒺藜苜蓿根部寄生可降低 蒺藜苜蓿根际中的钠离子积累，增加蒺藜苜蓿盐胁迫耐受力。
[0009] 本发明的技术方案为
[0010] 一种提高蒺藜苜蓿抗盐害能力的方法，包括以下步骤：
[0011] (1)印度梨形孢固体CM培养基的配制：
[0012] 将20g葡萄糖，2g蛋白胨，lg酵母提取物，lg水解酪蛋白，50ml 20X盐溶液和lml 微量元素，加水溶解至1升，再加15g琼脂粉，高温高压灭菌，冷却后倒入平板即为固体CM 培养基；
[0013] 其中 20X 盐溶液的制备方法为：将 12g NaN03,10. 4g KC1，10. 4g MgS04 ? 7H20， 30. 4g KH2P04放入容器内，加灭菌水至1升。
[0014] 微量元素的制备方法为：将 6g MnCl2 ? 4H20,1. 5g H3B03, 2. 65g ZnS04 ? 7H20, 750mg KI，2. 4mg Na2M04 ? 7H20,130mg CuS04 ? 5H20 放入容器内，加灭菌水至 1 升。
[0015] (2)印度梨形孢培养及孢子悬浮液收集：
[0016] 将活化后的印度梨形孢接种于步骤（1)所述的固体CM培养基中培养，培养条件为 23°C _30°C，黑暗培养箱避光培养，3周后收集孢子体，用0. 05% Tween-20 (v/v)配成浓度为 2~10X 105个/ml的孢子悬浮液。
[0017] (3)印度梨形孢接种蒺藜苜蓿：
[0018] 首先进行蒺藜苜蓿种子表面消毒：将蒺藜苜蓿种子浸泡到15% (v/v)次氯酸钠溶 液中，15~30min后，用灭菌水冲洗3~6遍；然后实施以下三种方法之一进行印度梨形孢 接种：方法一：将种子浸泡到步骤⑵中得到的印度梨形孢孢子悬浮液中，25°C，保持40~ 50min;或者，方法二：将步骤（2)中得到的印度梨形孢孢子悬浮液混合于FM培养基中，然 后将经过表面消毒的蒺藜苜蓿种子放到含有步骤（2)中得到的印度梨形孢孢子悬浮液的 FM培养基中萌发；或者，方法三：用步骤（2)中得到的印度梨形孢孢子悬浮液对预先萌发的 蒺藜苜蓿幼苗根部进行孢子液沾染处理，经印度梨形孢孢子悬浮液沾染后的蒺藜苜蓿幼苗 转移到FM无菌培养基的方形培养皿中进行幼苗培养。
[0019] (4)蒺藜苜蓿幼苗的移栽和后期的管理：
[0020] 将上一步得到的经印度梨形孢侵染后的种子或幼苗放入光照培养箱，培养条件为 24-26 °C，16h光期、8h暗期，湿度60% -70%，一周后将幼苗进行移栽，接下来实施常规的水 肥管理，使蒺藜苜蓿正常生长。
[0021] 本发明的有益效果为：
[0022] 1、本发明采用印度梨形孢孢子悬浮液对种子预先浸泡，印度梨形孢可寄生于蒺 藜苜蓿种子的表面，促进种子提早萌发并显著提高种子的发芽率（由原来的80.0%提高 到95. 0% );能显著地提高蒺藜苜蓿生物产量，促进蒺藜苜蓿的生长；降低钠离子从根系向 蒺藜苜蓿地上部分的迁移，从而缓解钠离子带来的盐害胁迫；提高植物体内脯氨酸含量达 37. 45%，显著提高蒺藜苜蓿在高盐度环境下的抵抗力。
[0023] 2、与现有技术中丛枝菌根真菌相比，本发明的印度梨形孢可在人工培养基上生 长，且能够改善蒺藜苜蓿的营养状况，促进蒺藜苜蓿的生物产量提高，适应盐浓度较高的土 壤，可间接起到盐碱地土壤改良的功效。
[0024] 3、本发明中印度梨形孢孢子悬浮液的使用方法多样，可以将蒺藜苜蓿种子浸泡在 印度梨形孢孢子悬浮液中，还可以将印度梨形孢孢子悬浮液混合于FM培养基中使种子在 其上萌发，还可以用印度梨形孢孢子悬浮液对蒺藜苜蓿幼苗进行沾染处理。
[0025] 4、本发明提高蒺藜苜蓿抗盐害能力的方法成本较低、方法简单、绿色环保，它不仅 适用于蒺藜苜蓿的耐盐性提高，对于其他牧草类植物及豆科植物也同样适用。同时，对于盐 渍化土壤的改良也起到积极的作用。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合具体实施例对本发明方案做进一步详细说明：
[0027] -种提高蒺藜苜蓿抗盐害能力的方法，利用在蒺藜苜蓿根部寄生印度梨形孢来提 高蒺藜苜蓿耐盐性的方法，本发明涉及的印度梨形孢由德国吉森李比希大学Karl-Heinz Kogel教授惠赠。
[0028] 实施例1
[0029] 利用印度梨形孢提高蒺藜苜蓿耐盐性，包括如下步骤：
[0030] (1)印度梨形孢固体CM培养基的配制：将20g葡萄糖，2g蛋白胨，lg酵母提取物， lg水解酪蛋白，50ml 20 X盐溶液和lml微量元素，加水溶解至1升，另加15g琼脂粉，高温 高压灭菌，冷却后倒入平板即为固体CM培养基。
[0031] 其中 20X 盐溶液的制备方法为：将 12g NaN03,10. 4g KC1，10. 4g MgS04 ? 7H20， 30. 4g KH2P04放入容器内，加灭菌水至1升。
[0032] 微量元素的制备方法为：将 6g MnCl2 ? 4H20,1. 5g H3B03, 2. 65g ZnS04 ? 7H20, 750mg KI，2. 4mg Na2M04 ? 7H20,130mg CuS04 ? 5H20 放入容器内，加灭菌水至 1 升。
[0033] (2)菌种的活化：将保存在冰箱里的印度梨形孢菌种接种于上面得到的固体CM培 养基上，置于25°C恒温箱里避光培养10天，待菌丝体覆盖CM固体培养基约三分之一半径， 即得到活化的印度梨形孢菌种。
[0034] (3)菌株的扩繁培养：再配制如步骤⑴的200ml固体CM培养基，灭菌备用。在 无菌条件下，将CM培养基倒入平板（每个平板大约25ml)，用打孔器将活化的菌种打成直径 5mm的圆块，放在CM培养平板中央，菌面朝下，贴附于培养基放到CM培养基的中央，置于恒 温培养箱中25 °C，避光培养3周。
[0035] (4)孢子体的收集：加入0? 05% (v/v) Tween-20溶液3ml，用无菌玻璃涂棒反复刮 取培养皿表面的菌体，获取孢子悬浮液。用25 y m的微孔膜过滤掉孢子悬浮液中的菌丝体， 3500r/min离心10min，0. 05% (v/v)Tween-20重悬菌体，并在超声波下打散孢子，显微镜下 计数，获得孢子浓度为5 X105个/ml的孢子悬浮液。
[0036] (5)印度梨形孢接种蒺藜苜蓿种子：首先对蒺藜苜蓿种子表面进行消毒处理：将 种子浸泡到15% (v/v)次氯酸钠溶液中，20min后，用灭菌水冲洗5遍，分别设计一个对照， 一个处理。处理例为用步骤（4)得到的浓度为5X10 5个/ml的孢子悬浮液浸泡，对照例为 同体积的〇. 05% (v/v) Tween-20水溶液处理。25°C，浸泡45min，得到接种有印度梨形孢的 蒺藜苜蓿种子（印度梨形孢孢子液浸泡蒺藜苜蓿种子以孢子液刚好没过蒺藜苜蓿种子为 宜）。
[0037] (6)将上步经过浸泡的种子转移到FM培养基中，无菌条件下培养，每个培养皿 (12X 12cm)中放置10个种子，放入光照培养箱，培养条件为26°C，16h光期、8h暗期，湿度 60% -70%。经过孢子液浸泡的蒺藜苜蓿种子1-2天后就萌芽，而对照处理则在3天后发 芽。经过印度梨形孢浸泡过的种子发芽率95%，而对照处理为80%。
[0038] (7)将蒺藜苜蓿幼苗移至蛭石：珍珠岩（2:1)的土壤中进行培养：挑选处理和对照 中长势一致的幼苗移栽至塑料盆（（底直径15cm，高25cm)中，2周后，在蒺藜苜蓿根部，每 天定时定量浇灌盐浓度分别为100、150、200、250mM的NaCl盐溶液200ml，每个盆中培养蒺 藜苜蓿幼苗2株，对照和处理各10盆。
[0039] a. 2周后测定蒺藜苜蓿地下部（根）中钠离子含量：根部盐处理2周后取样，测定 钠元素含量，结果显示在受到不同盐浓度处理后，印度梨形孢侵染组比非侵染组钠离子含 量分别降低了 31. 34%，34. 69%，38. 12%，45. 74% (表 1)。
[0040] 表1. NaCl处理2周接种与未接种印度梨形孢的蒺藜苜蓿地下部（根）钠离子含 量
[0041] mg/L
[0043] b. 2周后测定蒺藜苜蓿地上部（茎+叶）钠离子含量：盐处理2周后取样，测定钠 元素含量，结果显示在受到不同盐浓度处理后，印度梨形孢侵染组比非侵染组钠离子地上 部分（茎 + 叶）含量分别降低了 35. 94%，22. 91%，38. 86%，28. 36% (表 2)。
[0044] 表2. NaCl处理2周接种与未接种印度梨形孢的蒺藜苜蓿地上部（茎+叶）钠离 子含量
[0045] mg/L
[0046]
[0047] c. 2周后测定蒺藜苜蓿地下部（根）脯氨酸含量：
[0048] 对NaCl处理2周后接种与未接种印度梨形孢的蒺藜苜蓿根部脯氨酸含量进行测 定，结果显示在受到不同盐浓度100、150、200、250mM的NaCl处理后，印度梨形孢侵染组比 非侵染组脯氨酸含量分别提高了 8. 38%，7. 54%，26. 13%，37. 45% (表3)。脯氨酸含量与 植物系统抗性成正比。表明印度梨形孢能显著促进蒺藜苜蓿根部脯氨酸含量提高，增强蒺 藜苜蓿在中、高等盐度下的耐受力。
[0049] 表3. NaCl处理2周后接种与未接种印度梨形孢的蒺藜苜蓿地下部（根）脯氨酸 含量
[0050] u g/L
[0052] d 35天后测定蒺藜苜蓿地下部分（根）钠离子含量：持续进行盐胁迫处理：以蒺 藜苜蓿根部为中心，5cm为半径，浇灌浓度为100、150、200、250mM的NaCl盐溶液200mL，以 浇灌200mL的水作为对照。每个处理各10株；35天后测定蒺藜苜蓿根部钠离子含量：结果 显示在受到不同盐浓度处理后，印度梨形孢侵染组比非侵染组根部钠离子含量分别降低了 23. 96%，45. 65%，46. 32%，33. 22% (表 4)。
[0053] 表4. NaCl处理35天后接种与未接种印度梨形孢的蒺藜苜蓿地下部（根）钠离子 含量
[0054] mg/L
[0056] e. 35天后测定蒺藜苜蓿地上部（茎+叶）钠离子含量：结果显示在受到不同盐浓 度100、150、200、250mM的NaCl处理后，印度梨形孢侵染组比非侵染组钠离子含量分别降低 了 55. 05%，55. 36%，33. 22%，33. 47% (表 5)。
[0057] 表5. NaCl处理35天后接种与未接种印度梨形孢的蒺藜苜蓿地上部（茎+叶）钠 离子含量 [0058] mg/L
[0060] 实施例2
[0061] 将实施例1中印度梨形孢接种蒺藜苜蓿（步骤5)改为：将印度梨形孢孢子悬浮 液混合于FM培养基中，然后将经过表面消毒的蒺藜苜蓿种子放到含有（实验组）和不含有 (对照组）印度梨形孢孢子悬浮液的培养基中萌发，其余等同实施例1。35天后，盆栽蒺藜 苜蓿在不同盐浓度下100mM，150mM，200mM，250mM，印度梨形孢子侵染组比非侵染组根部钠 离子含量分别下降 44. 85%，41. 58%，39. 36%，36. 86%。
[0062] 实施例3
[0063] 将实施例1中印度梨形孢接种蒺藜苜蓿（步骤5)改为：先对蒺藜苜蓿种子进行 表面消毒处理，于25°C下培养皿中预先发芽，4-5天后，待种子长出2-3cm嫩芽，用印度梨形 孢孢子悬浮液进行浸泡，25°C，30min，把幼苗转接到FM培养基中，进行恒温恒湿常规培养， 培养7天，转移到花盆中培养。其余等同于实施例1。35天后，盆栽蒺藜苜蓿在不同盐浓度 下lOOmM，150mM，200mM，250mM，印度梨形孢子侵染组比非侵染组根部钠离子含量分别下降 46. 25%，45. 36%，37. 28%，35. 56%。
[0064] 本发明未尽事宜为公知技术。
【主权项】
1. 一种提高蒺藜苜蓿抗盐害能力的方法，其特征为包括以下步骤： (1) 印度梨形孢固体CM培养基的配制： 将20 g葡萄糖，2 g蛋白胨，1 g酵母提取物，1 g水解酪蛋白，50 ml 20X盐溶液和 1 ml微量元素，加水溶解至1升，再加15 g琼脂粉，高温高压灭菌，冷却后倒入平板即为固 体CM培养基； (2) 印度梨形孢培养及孢子悬浮液收集： 将活化后的印度梨形孢接种于步骤（1)所述的固体CM培养基中培养，培养条件为23 °C -30 °C，黑暗培养箱避光培养，3周后收集孢子体，用0. 05% Tween-20 (v/v)配成浓度为 2~10X 105个/ml的孢子悬浮液； (3) 印度梨形孢接种蒺藜苜蓿： 首先进行蒺藜苜蓿种子表面消毒：将蒺藜苜蓿种子浸泡到15% (v/v)次氯酸钠溶液中， 15~30 min后，用灭菌水冲洗3~6遍；然后实施以下三种方法之一进行印度梨形孢接 种：方法一：将种子浸泡到步骤（2)中得到的印度梨形孢孢子悬浮液中，25 °C，保持40~ 50 min;或者，方法二：将步骤（2)中得到的印度梨形孢孢子悬浮液混合于FM培养基中， 然后将经过表面消毒的蒺藜苜蓿种子放到含有步骤（2)中得到的印度梨形孢孢子悬浮液的 FM培养基中萌发；或者，方法三：用步骤（2)中得到的印度梨形孢孢子悬浮液对预先萌发的 蒺藜苜蓿幼苗根部进行孢子液沾染处理，经印度梨形孢孢子悬浮液沾染后的蒺藜苜蓿幼苗 转移到FM无菌培养基的方形培养皿中进行幼苗培养； (4) 蒺藜苜蓿幼苗的移栽和后期的管理： 将上一步得到的经印度梨形孢侵染后的种子或幼苗放入光照培养箱，培养条件为 24-26 °C，16 h光期、8 h暗期，湿度60%-70%，一周后将幼苗进行移栽，接下来实施常规的水 肥管理，使蒺藜苜蓿正常生长。2. 如权利要求1所述的提高蒺藜苜蓿抗盐害能力的方法，其特征为所述的20X盐溶 液的制备方法为：将 12 g NaN03,10.4 g KC1，10.4 g MgS04*7H20, 30.4 g 腿2卩04放入容器 内，加灭菌水至1升。3. 如权利要求1所述的提高蒺藜苜蓿抗盐害能力的方法，其特征为所述的微量元素 的制备方法为：将 6 g MnCl2.4H20，1.5 g Η3Β03,2·65 g ZnS04*7H20,750 mg KI，2.4 mg Na2M04 · 7H20,130 mg CuS04 · 5H20放入容器内，加灭菌水至1升。
【文档编号】A01C1/00GK105850535SQ201510033037
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2015年1月23日
【发明人】李亮, 马朝阳, 武洪庆, 齐树亭
【申请人】河北工业大学