一种小麦赤霉病扩展抗性的鉴定评价方法
【专利摘要】本发明公开了一种小麦赤霉病扩展抗性的鉴定评价方法，属于植物病害技术领域。方法包括：(1)小麦赤霉病菌分生孢子的培养与接种液的制备；(2)塑料袋的选择与准备；(3)小麦赤霉病菌接种液的接种与套袋保湿；(4)病情观察、记载与统计等步骤。该方法采用透明塑料袋保湿，显著提高了麦穗接种部位的环境湿度，并使其温度更趋均衡，有利于赤霉病菌的侵入与定植，显著提高了人工诱发田间小麦赤霉病的效果；且该方法简单易行，既不需要大量人工投入，也不需要高成本的设施投入。
【专利说明】
一种小麦赤霉病扩展抗性的鉴定评价方法 一、
技术领域
[0001] 本发明涉及植物病害技术领域，尤其涉及一种简易、高效、省力的田间人工接种诱 发小麦赤霉病的方法。 二、
【背景技术】
[0002] 小麦赤霉病(Gibberellazeae(Schw. )Perch.)广泛分布于我国温暖潮湿或半潮湿 地区，多发于长江上游、中下游及黄淮南片区，对小麦生产的危害甚大。该病害不仅会造成 小麦严重减产，更会恶化籽粒品质。赤霉病产生的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)毒性强，食用 后会引起眩晕、发烧、恶心、呕吐、腹泻等急性中毒症状，影响免疫能力和降低生育能力等， 危害人畜健康。国际上发达国家规定一旦检出毒素 DON就不能食用，DON食量超过2mg/kg便 不能作饲料。
[0003] 选育抗赤霉病的小麦优良品种，是最有效及环保的防治小麦赤霉病方法。选育抗 赤霉病的小麦品种必须在赤霉病发生的情况下才能进行筛选。小麦赤霉病发生需要满足以 下两个条件:一是具有病原菌菌源，二是适宜的温度、湿度条件。这两个条件不满足则不发， 满足不充分则发病轻，满足充分则发病重;赤霉病诱发方法很多，主要有自然诱发法和人工 诱发法两类。自然诱发法是将小麦种植于适宜赤霉病发病的环境条件下诱发出赤霉病，但 由于自然条件变化无常，上述两个发病条件可能无法同时满足或满足不充分，导致不发病 或轻发病，因此该方法使用较少。人工诱发法是指人工提供病原菌菌源和适宜的温度、湿度 条件并诱发病害，由于该法发病条件稳定且易于控制，基本能做到必发或重发。人工诱发方 法很多，代表性的方法有土表接种法和滴注接种法。土表接种法:在土表接种病原菌(带赤 霉病菌的麦粒），由之产生子囊孢子并侵染麦穗引起发病。土表接种法一般需配合人工喷 雾，创造适宜发病环境才能高效地诱发赤霉病，但喷雾设施的投入成本较高。滴注接种法： 用注射器将病原菌接种液注入麦穗的小花中而引起发病，该法虽利用了麦穗小花内密闭环 境适宜发病的温度、湿度条件，但容易受田间大环境的影响；而运用弥雾装置，虽然保湿效 果良好，但对生育期不同的品种因弥雾处理而会引起不同选择压，难以反应品种间真实的 抗性差异。
[0004] 三、技术方案
[0005] 技术问题
[0006] 本发明目的是，针对人工单花滴注法发病程度易受田间气候环境影响的缺陷，提 出一种简易、省力、低成本的且能高效诱发赤霉病的人工诱发田间小麦赤霉病的方法。
[0007] 技术方案
[0008] -种小麦赤霉病扩展抗性的鉴定评价方法，该方法按以下步骤进行：
[0009] (1)小麦赤霉病菌分生孢子的培养:选用玉蜀黍赤霉菌(6；11^6^1132636(3(31^.) Petch)有代表性强病力菌株3-4个为菌种，如在江苏选取菌株F0301、F0609、R)98(^PF1126 作为代表性菌株进行接种试验。因为不同的菌株之间其致病力存在着显著差异，选择有代 表性强致病菌株进行混合接种可以更有效地检测品种的抗病性;将这些菌株在PDA固体培 养基上分别进行培养活化，利用圆盘取样器从上述培养基中取3-5块带有赤霉菌株的roA固 体，放入150mL经过灭菌的绿豆汤液体培养基中，在25°C、180rpm条件下振荡培养4-5d后取 样镜检，经纱布过滤后配制等比例的3-4个菌种的混合孢子液，浓度为50000个/mL;
[0010] ⑵塑料袋的选择与准备：购买长X宽X厚的尺寸大小为25cmX20cmX50wii的透 明塑料袋以及用于捆扎的塑料扎绳，选择尺寸大小为25cmX2〇CmX5〇Mi的透明塑料袋可以 满足同时套取5-10个等接种麦穗条件，既提高了工作效率，又避免了套取单个麦穗易折断 的缺陷，也不会影响接种麦穗的正常光照需求。
[0011] (3)赤霉病菌接种液的接种与套袋保湿:在50%麦穗扬花时，选取步骤（1)的接种 液l〇yl滴注至穗中部小穗基部小花内。每个品种接种30个麦穗，剪取接种穗顶部小穗以上 的麦芒以示接种标记(代替每个接种麦穗都要挂牌的烦琐步骤，以提高工作效率），用步骤 (2)准备的透明塑料袋套取株高相近5-10个接种穗，并用塑料扎绳在穗下节间处进行适度 捆扎，同时在接种行(小区）易观察位置挂上标注接种日期的防水标签，套袋保湿72h后去除 塑料袋；
[0012] ⑷观察、记载与统计:在接种后第21天调查统计病小穗数与反应级，参照3个对照 品种的发病情况，所述3个对照品种分别为苏麦3号、扬麦158和安农8455,其中苏麦3号为抗 病对照、扬麦158为中抗对照，安农8455为感病对照，以平均反应级(Average Infection Rating)对参试材料进行赤霉病抗扩展性评价：
[0013] AIR= I：(病级X该反应级穗数)/调查总穗数，
[0014] 其中AIR为平均反应级，
[0015]病穗反应级标准为：
[0016] 0级，接种小穗无可见发病症状；
[0017] 1级，仅接种小穗发病，或相邻小穗发病，但病斑不扩展到穗轴；
[0018] 2级，穗轴发病，发病小穗数占总小穗数的1/4以下；
[0019] 3级，穗轴发病，发病小穗数占总小穗数的1/4~1/2;
[0020] 4级，穗轴发病，发病小穗数占总小穗数的1/2以上，
[0021] 抗性分级标准：
[0022] 抗病Resistant(R) :AIR〈AIRck-R;
[0023] 中抗Moderately resistant(MR) :AIRck-r < AIR〈AIRck-mr;
[0024] 中感Moderately susceptible(MS) :AIRck-mr < AIR〈AIRck-s;
[0025] 感病Susceptible(S) :AIR 2 AIRck-s;
[0026] 其中，AIR为平均反应级;AIRck-r为抗病对照平均反应级;AIRCK-mr为中抗对照平均 反应级;AIRgk-s为感病对照反应级。
[0027]所述PDA固体培养基配方为：马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂20克及水1000ml;制 备方法为：马铃薯洗净、去皮、切丝，加500ml水煮沸15分钟后，过滤，得马铃薯汁;在500ml水 中加琼脂，煮至琼脂溶解，过滤，得琼脂液;将马铃薯汁与琼脂液混合，并补充水至l〇〇〇ml， 再加入葡萄糖并加热至溶解;装瓶，在121°C下灭菌15分钟即成。
[0028] 所述绿豆汤培养液配方为:绿豆50克，水1000ml;制备方法为:绿豆洗净，加1000ml 水煮沸15分钟后，过滤，得绿豆汁，补充水至1000ml，装瓶，在121°C下灭菌15分钟即成。 [0029]有益效果
[0030] 1、单花滴注法已经被广泛应用于小麦赤霉病接种鉴定，但接种后保湿效果一直是 关系到鉴定成败的关键。本发明提出的透明塑料袋套袋保湿法是一种利用接种穗自身呼 吸、蒸腾作用产生的水汽保持袋内的100%的相对湿度，以改善接种赤霉病菌麦穗所处环境 条件，提高环境湿度，使接种液中的水分保持更久，有利于赤霉病菌对麦穗的侵入与定植， 故能显著提高人工诱发田间小麦赤霉病的人工接种诱发效果。
[0031] 2、本发明方法简单易行，既不需要大量人工投入，也不需要高成本的设施投入，并 能高效保湿，不仅节省了弥雾所需的装置和调节花期的繁重劳动，而且可在田间和温室的 任何位置、任何时间灵活开展赤霉病接种鉴定，显著提高了人工诱发田间小麦赤霉病的效 果，保证接种穗发病，真实反应参试材料的赤霉病扩展抗性。 四、
【附图说明】
[0032] 图1是透明塑料袋套袋保湿法在田间实施情况。 五、
【具体实施方式】
[0033] 下面实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
[0034] 实施例1:(一种小麦赤霉病扩展抗性的鉴定评价方法）
[0035]该方法按以下步骤进行：
[0036] (1)小麦赤霉病菌分生孢子的培养：选用江苏代表性玉蜀黍赤霉菌菌株F0301、 F0609、F0980和F1126为菌种;将这些菌株在PDA固体培养基上分别进行培养活化，利用圆盘 取样器从上述培养基中取3-5块带有赤霉菌株的PDA固体，放入150mL经过灭菌的绿豆汤液 体培养基中，在25°C、180rpm条件下振荡培养4-5d后取样镜检，经纱布过滤后配制等比例的 4个菌种的混合孢子液，浓度50000个/mL。其中：
[0037]所述PDA固体培养基配方为：马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂20克及水1000ml;制 备方法为：马铃薯洗净、去皮、切丝，加500ml水煮沸15分钟后，过滤，得马铃薯汁;在500ml水 中加琼脂，煮至琼脂溶解，过滤，得琼脂液;将马铃薯汁与琼脂液混合，并补充水至l〇〇〇ml， 再加入葡萄糖并加热至溶解;装瓶，在121°C下灭菌15分钟即成；
[0038] 所述绿豆汤培养液配方为:绿豆50克，水1000ml;制备方法为:绿豆洗净，加1000ml 水煮沸15分钟后，过滤，得绿豆汁，补充水至1000ml，装瓶，在121°C下灭菌15分钟即成； [0039] (2)塑料袋的选择与准备:购买尺寸大小为25cmX 20cmX50WH(长X宽X厚）的透 明塑料袋以及用于捆扎的塑料扎绳。
[0040] (3)赤霉病菌接种液的接种与套袋保湿:在开花期即50%麦穗扬花时，选取步骤 (1)的接种液1 〇yl滴注至穗中部小穗基部小花内，每个品种接种30个麦穗，剪取接种穗顶部 小穗以上的麦芒以示接种标记，用步骤(2)准备的透明塑料袋套取株高相近5-10个接种穗， 并用塑料扎绳在穗下节间处进行适度捆扎，同时在接种行(小区）易观察位置挂上标注接种 日期的防水标签，套袋保湿72h后去除塑料袋。
[0041] (4)观察、记载与统计:在接种后第21天的调查统计病小穗数与反应级，参照3个对 照品种的发病情况，所述3个对照品种分别为苏麦3、扬麦158和安农8455,其中苏麦3号为抗 病对照、扬麦158为中抗对照，安农8455为感病对照，以平均反应级对参试材料进行赤霉病 抗扩展性评价。
[0042] AIR= I：(病级X该反应级穗数)/调查总穗数，
[0043] 其中AIR为平均反应级，
[0044] 病穗反应级标准为：
[0045] 0级，接种小穗无可见发病症状；
[0046] 1级，仅接种小穗发病，或相邻小穗发病，但病斑不扩展到穗轴；
[0047] 2级，穗轴发病，发病小穗数占总小穗数的1/4以下；
[0048] 3级，穗轴发病，发病小穗数占总小穗数的1/4~1/2;
[0049] 4级，穗轴发病，发病小穗数占总小穗数的1/2以上。
[0050] 抗性分级标准：
[0051 ]抗病Resistant(R) :AIR〈AIRck-R;
[0052] 中抗Moderately resistant(MR) :AIRck-r < AIR〈AIRck-mr;
[0053] 中感Moderately susceptible(MS) :AIRck-mr < AIR〈AIRck-s;
[0054] 感病Susceptible(S) :AIR 2 AIRck-s;
[0055] 其中，AIR为平均反应级;AIRck-r为抗病对照平均反应级;AIRCK-mr为中抗对照平均 反应级;AIRgk-s为感病对照反应级。
[0056] 实施例2:(-种小麦赤霉病扩展抗性的鉴定评价方法）
[0057]为了明确本发明实验效果，
【申请人】在2014-2015年度选取部分已知抗性水平品种 与即将通过江苏省小麦新品种审定的新品系开展了小麦赤霉病抗扩展性鉴定试验，结果显 示本发明的"套袋保湿法"能高效诱发小麦赤霉病的发生，参试的20个品种的发病率均在 95%以上，平均反应级介于1.22~3.78之间（表1)。参考对照品种的赤霉病发生情况，对试 验材料进行了初步的抗性评价，发现淮南麦区小麦品种(系）的赤霉病抗性介于抗或中抗的 水平，而淮北麦区小麦品种（系）的赤霉病抗性则介于感或中感水平，这与当前江苏省小麦 生产实际情况相一致，其中宁麦9号、扬麦11、扬麦20、郑麦9023和淮麦20等品种的评价结果 均与其已报道的抗性水平相符合，表明本发明可以广泛地应用小麦赤霉病扩展抗性的鉴定 研究。
[0058]表1参试材料小麦赤霉病的抗病鉴定
【主权项】
1. 一种小麦赤霉病扩展抗性的鉴定评价方法，其步骤为： (1) 小麦赤霉病菌分生孢子的培养：选用玉蜀黍赤霉菌（Gibberellazeae( Schw .) Petch)有代表性强病力菌株3-4个为菌种，将这些菌株在PDA固体培养基上分别进行培养活 化，利用圆盘取样器从上述培养基中取3-5块带有赤霉菌株的PDA固体，放入150mL经过灭菌 的绿豆汤液体培养基中，在25°C、180rpm条件下振荡培养4-5d后取样镜检，经纱布过滤后配 制等比例的3-4个菌种的混合孢子液，浓度为50000个/mL; (2) 塑料袋的选择与准备：购买长X宽X厚尺寸大小为25cm X 20cm X 50μπι的透明塑料 袋以及用于捆扎的塑料扎绳； (3) 赤霉病菌接种液的接种与套袋保湿:在50 %麦穗扬花时，选取步骤（1)的接种液10μ 1滴注至穗中部小穗基部小花内，每个品种接种30个麦穗，剪取接种穗顶部小穗以上的麦芒 以示接种标记，用步骤(2)准备的透明塑料袋套取株高相近5-10个接种穗，并用塑料扎绳在 穗下节间处进行适度捆扎，同时在接种行（小区）易观察位置挂上标注接种日期的防水标 签，套袋保湿72h后去除塑料袋； (4) 观察、记载与统计:在接种后第21天的调查统计病小穗数与反应级，参照3个对照品 种的发病情况，所述3个对照品种分别为苏麦3、扬麦158和安农8455,其中苏麦3号为抗病对 照、扬麦158为中抗对照、安农8455为感病对照，以平均反应级对参试材料进行赤霉病抗扩 展性评价： AIR= Σ (病级X该反应级穗数)/调查总穗数， 其中AIR为平均反应级； 病穗反应级标准为： 〇级，接种小穗无可见发病症状； 1级，仅接种小穗发病，或相邻小穗发病，但病斑不扩展到穗轴； 2级，穗轴发病，发病小穗数占总小穗数的1/4以下； 3级，穗轴发病，发病小穗数占总小穗数的1/4~1/2; 4级，穗轴发病，发病小穗数占总小穗数的1/2以上， 抗性分级标准： 抗病(R) :AIR〈AIRck-r; 中抗(MR) :AIRck-r < AIR〈AIRck-mr; 中感(MS) :AIRck-mr < AIR〈AIRck-s; 感病（S) :AIR 2 AIRck-s， 其中，AIR为平均反应级;AIRck-r为抗病对照平均反应级;AIRCK-mr为中抗对照平均反应 级;AIRgk-s为感病对照反应级。2. 根据权利要求1所述的小麦赤霉病扩展抗性的鉴定评价方法，其特征是，所述PDA固 体培养基配方为：马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂20克及水1000ml;制备方法为：马铃薯洗 净、去皮、切丝，加500ml水煮沸15分钟后，过滤，得马铃薯汁;在500ml水中加琼脂，煮至琼脂 溶解，过滤，得琼脂液;将马铃薯汁与琼脂液混合，并补充水至1000ml，再加入葡萄糖并加热 至溶解;装瓶，在121°C下灭菌15分钟即成。3. 根据权利要求1或2所述的小麦赤霉病扩展抗性的鉴定评价方法，其特征是，所述绿 豆汤培养液配方为：绿豆50克，水1000ml;制备方法为：绿豆洗净，加1000ml水煮沸15分钟
【文档编号】A01G7/00GK105850537SQ201610209821
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月6日
【发明人】吴纪中, 张巧凤, 蔡士宾, 付必胜, 吴小有
【申请人】江苏省农业科学院