一种凤丫蕨的快速繁殖和离体保存方法
【专利摘要】本发明提供植物凤丫蕨(Coniogramme japonica(Thunberg)Diels)的快速繁殖和离体保存方法。包括外植体的获取、绿色球状体GGB诱导与增殖培养、生根培养、分化培养、离体保存或移栽步骤，取野外自然生长的凤丫蕨孢子，在孢子萌发培养基中培养，获得带根状茎的小苗，转入绿色球状体诱导与增殖培养基中培养，将生成的绿色球状体转入生根培养基中，然后将长出1?2条根、分化出小叶但仍未完全分化的绿色球状体转接至分化培养基中进行培养，分化出的小苗转接在离体培养基上继代培养离体保存，或将分化出的小苗进行移栽。该方法对凤丫蕨属植物种质资源的开发、利用和保护提供了重要的技术支撑。
【专利说明】
一种凤丫蕨的快速繁殖和离体保存方法
技术领域：
[0001 ]本发明涉及植物生物技术领域，具体地，涉及植物凤丫蕨(Coniogramme japonica (Thunberg) D i e 1 s)的离体保存方法。
【背景技术】：
[0002] 凤丫蕨（Coniogramme japonica(Thunberg)Diels)为裸子蕨科 (Hemionitidaceae)凤丫蕨属(ConiogrammeFee)多年生草本植物，广泛分布于我国西南及 长江中下游地区，喜生湿润林下和山谷阴湿处，海拔100-1300米。其地下根状茎发达，常连 片生长，根茎及全草入药，具有舒筋活络、祛寒除湿等功效，主要用于治疗风湿性关节炎、白 带、肾炎、无名毒疮等症。同时，凤丫蕨植株形态优美，亦是优良的观赏蕨类。目前，关于凤丫 蕨属植物各方面的研究渐渐增多，如，周丽华(2009,不同灭菌方法和赤霉素浓度对凤丫蕨 幼茎成苗的影响，安徽农业科学37(31): 15222-15223)以凤丫蕨幼茎为外植体，经自来水洗 2h，酒精消毒60s，升汞消毒10min能达到较好的灭菌效果，且在添加浓度为1.5mg/L赤霉素 (GA)的1/2MS培养基中可成苗，但最高成苗率只有75%;韦景楓等(2004,凤丫蕨组培快繁技 术初报，贵州林业科技32(3) :32-34)以凤丫蕨孢子成熟的叶片作为外殖体，对凤丫蕨的组 培快繁进行了研究。随着对该属植物各方面研究工作的深入，以及人们对于该属植物野生 资源需求的日益增加，进一步开展该属物种的离体保存的研究，将对凤丫蕨属植物种质资 源的利用和保护提供重要的技术支撑。至今，现有技术尚未见有凤丫蕨生物技术方法进行 离体保存的报道。
【发明内容】
：
[0003] 本发明的目的在于提供现有技术中未有的一种极具药用价值和观赏潜力的植物 凤丫蕨的离体保存方法。通过对凤丫蕨的孢子无菌萌发、绿色球状体(Green Globular Body，GGB)诱导、生根和离体保存等步骤，建立了凤丫蕨的快繁和离体保存体系，继代周期 达2年以上。该方法将对凤丫蕨属植物种质资源的开发、利用和保护提供重要的技术支撑。
[0004] 为实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
[0005] -种凤丫蕨的快速繁殖和离体保存方法，该方法包括外植体的获取、绿色球状体 GGB诱导与增殖培养、生根培养、分化培养、离体保存或移栽步骤，取野外自然生长的凤丫蕨 孢子，在孢子萌发培养基（1)中培养，获得带根状茎的小苗，转入绿色球状体诱导与增殖培 养基(2)中培养，将生成的绿色球状体转入生根培养基(3)中，然后将长出1-2条根、分化出 小叶但仍未完全分化的绿色球状体转接至分化培养基(4)中进行培养，分化出的小苗转接 在离体培养基(5)上继代培养离体保存，或将分化出的小苗进行移栽，所述的（1)孢子萌发 培养基为:基本培养基为MS大量元素取1/4，其余成分与MS相同的1/4MS培养基；（2)GGB诱导 与增殖培养基为:MS+6-BA0? 5mg/L+NAA0 ? 2mg/L; (3)生根培养基为：1/10MS; (4)分化培养基 为：1/2MS+IBA0 ? lmg/L+IAA0 ? lmg/L; (5)离体保存培养基为：1/2MS，以上培养基均添加蔗糖 30g/L，琼脂5.8g/L固化，pH5.8，（1) (2) (3) (5)在如下培养条件下培养:培养温度23 ± 2 °C， 光照强度10-20wn〇l/(m2 ? s)，光照12h/d;(4)的培养条件为:培养温度28°C，光照强度50y mol/(m2 ? s)，光照 12h/d。
[0006] 根据所述的一种凤丫蕨的快速繁殖和离体保存方法，其中所述的外植体的获取是 选择野外自然生长发育良好，没有病虫害的成年凤丫蕨植株，剪下长有成熟孢子的叶片，通 过自然脱落获得孢子，将孢子用双层擦镜纸包好，放入无菌水中浸泡6小时，然后用75%酒 精消毒5_7s，再用无菌水冲洗3遍，用0.1%HgCl 2水溶液进行消毒5-10min，在无菌条件下用 无菌水反复水洗3遍，滤纸吸干多余水分，然后用解剖刀切开擦镜纸，通过拖带擦镜纸将孢 子散落到培养基（1)中，接种90天后孢子萌发，出现原叶体的分化，在（1)培养基中继续培 养，获得带根状茎的小苗。
[0007] 根据所述的一种凤丫蕨的快速繁殖和离体保存方法，其中所述的绿色球状体GGB 诱导与增殖培养是（1)培养基中获得的带根状茎小苗去除须根和叶片后，接种至绿色球状 体诱导培养基(2)上，每瓶接种5个外植体，15天后出现绿色突起，继续在此培养条件下继代 培养2-3次，绿色突起进一步长大直至形成绿色球状体。
[0008] 根据所述的一种凤丫蕨的快速繁殖和离体保存方法，其中所述的生根培养是将获 得的绿色球状体转接至生根培养基(3)中，10天后开始出现根的分化，20天后根长至lcm长， 继续培养，可进一步分化出细小叶片。
[0009] 根据所述的一种凤丫蕨的快速繁殖和离体保存方法，其中所述的分化培养是将长 有1-2条根、分化出小叶但仍未完全分化的绿色球状体转接至(4)培养基中进行培养，30天 分化出大量的凤丫蕨小苗。
[0010] 根据所述的一种凤丫蕨的快速繁殖和离体保存方法，其中所述的离体保存是将培 养基(4)中分化出的小苗转接在培养基(5)上，每瓶接种5个，小苗继续生长，继代周期2年以 上。
[0011] 根据所述的一种凤丫蕨的快速繁殖和离体保存方法，其中所述的移栽是将培养基 (4)中的带根小苗进行移栽，首先将瓶苗放在大棚内炼苗3-5天，然后从培养瓶中取出生根 苗，洗去附着的培养基，略微晾干水分后进行移栽，移栽基质为经5%甲醛水溶液消毒过的 腐殖土 :沙土 = 2:1，栽好后浇透定根水，前期视苗生长状况进行及时通风或补水处理，待试 管苗长出新叶后，揭膜粗放管理。
[0012] 根据所述的一种凤丫蕨的快速繁殖和离体保存方法，其中所述的外植体的获取是 在选择野外自然生长且发育良好，没有病虫害的成年凤丫蕨植株，剪下长有成熟孢子的叶 片，装好带回实验室，通过自然脱落获得孢子，将孢子用双层擦镜纸包好，放入无菌水中浸 泡6小时，然后用75%酒精消毒5-7s，再用无菌水冲洗3遍，用0.1 %HgCl2水溶液进行消毒5-lOmin，在无菌条件下用无菌水反复水洗3遍，滤纸吸干多余水分，然后用解剖刀切开擦镜 纸，通过拖带擦镜纸将孢子散落到培养基（1)中，接种90天后孢子萌发，出现原叶体的分化， 在(1)培养基中继续培养；
[0013] 所述的绿色球状体GGB诱导与增殖培养是将小苗去除须根和叶片后，接种至GGB诱 导培养基(2)上，每瓶接种5个外植体，15天后出现绿色突起，继续在此培养条件下继代培养 2-3次，绿色突起进一步长大直至形成GGB，大小约0.5cm X 0.3cm绿色小球团，增殖率可达1: 6；
[0014] 所述的生根培养是将获得的GGB转接至生根培养基(3)中，10天后开始出现根的分 化，20天后根长至lcm长，继续培养，进一步分化出细小叶片；
[0015]所述的分化培养是将长有1-2条根、分化出小叶但仍未完全分化的GGB转接至(4) 培养基中进行培养，30天即可分化出大量的凤丫蕨小苗；
[0016]所述的离体保存是将培养基(4)中分化出的小苗转接在培养基(5)上，每瓶接种5 个，小苗继续生长，获得根状茎明显长长的小苗，偶尔伴生丛生小苗，在此培养条件下，继代 周期延长至2年以上，延长了继代周期，缩短了继代次数，维持了种质资源的遗传性；
[0017] 所用培养瓶均为白色透明玻璃瓶，直径7 ? 5cm X高9 ? 0cm，容积300ml;
[0018] 所述的移栽是将培养基(4)中的带根小苗进行移栽，首先将瓶苗放在大棚内炼苗 3-5天，然后从培养瓶中取出生根苗，洗去附着的培养基，略微瞭干水分后进行移栽，移栽基 质为经5%甲醛水溶液消毒过的腐殖土:沙土 = 2:1，栽好后浇透定根水，前期视苗生长状况 进行及时通风或补水处理，待试管苗长出新叶后，揭膜粗放管理，移栽成苗率80 %以上。
[0019] 与现有技术相比，本发明具备如下的优益性:本发明提供的一种极具药用价值和 观赏潜力的植物凤丫蕨的离体保存方法，是首次以野外自然生长的凤丫蕨孢子为外植体， 克服了野外取材时间不宜把握、易污染的困难。然后通过对孢子的消毒、无菌萌发、绿色球 状体(Green Globular Body，GGB)诱导、生根和离体保存等步骤，建立起一套完整和科学的 凤丫蕨的快速繁殖和离体保存体系，科学性强、操作简单。特别是首次实现了凤丫蕨离体保 存的继代周期延长至2年以上，大大降低了保存的成本，缩短了继代次数，维持了种质资源 的遗传性。为后续凤丫蕨植物资源的开发、利用和保护提供重要的技术支撑，同时也为凤丫 蕨属相关野生种质资源的离体保存、科学研究提供了科学依据。
【具体实施方式】：
[0020] 为了更好地说明本发明的实质性内容，下面用本发明的实施例来进一步说明本发 明，但本发明的内容并不局限于此。根据本发明技术方案和实施例的描述，也许同领域技术 人员在本发明的基础上还可以对本发明技术方案进行一些修改和改进。因此，在不偏离本 发明主要技术方案的基础上所做的修改和改进，均应属于本发明所要求保护的范围。
[0021] 实施例1:
[0022] 1、材料：凤丫蕨Coniogramme japonica(Thunberg)Diels。
[0023] 2、材料类别:野外自然生长的凤丫蕨孢子。
[0024] 3、培养条件：（1)孢子萌发培养基:基本培养基为MS大量兀素取1/4，其余成分与MS 相同的1 /4MS培养基；（2)GGB诱导与增殖培养基:MS+6-BA0 ? 5mg/L+NAA0 ? 2mg/L; (3)生根培 养基：1/10MS; (4)分化培养基：1/2MS+IBA0 ? lmg/L+IAAO ? lmg/L; (5)离体保存培养基：1/ 2MS。以上培养基均添加蔗糖30g/L，琼脂5.8g/L固化，pH5.8，培养温度均为25±2°C，光照强 度1 0-20mi〇 V (m2 ? s)，光照12h/d。所用培养瓶均为白色透明玻璃瓶，直径7.5cm X高 9.0cm，容积约300ml。所有培养基均添加琼脂5.8g/L固化，？耶.8。（1)(2)(3)(5)在如下培养 条件下培养:培养温度23 ± 2°C，光照强度10-20wiiol/(m2 ? s)，光照12h/d; (4)的培养条件 为:培养温度28°C，光照强度50wii〇l/(m2 ? s)，光照12h/d。
[0025] 4、生长与分化情况
[0026] 4.1外植体的获得:于2011年8月-11月间通过多次取样，在野外选择自然生长且发 育良好，没有病虫害的成年凤丫蕨植株，最终确定选取长有成熟孢子的叶片，将其剪下用普 通信封装好带回实验室，通过自然脱落获得孢子用于后续研究(表1)。将孢子用双层擦镜纸 包好，放入无菌水中浸泡6小时。然后用75%酒精消毒5-7s，再用无菌水冲洗3遍，用0.1 % HgCl2水溶液进行消毒5-10min，在无菌条件下用无菌水反复水洗3遍，滤纸吸干多余水分。 然后用解剖刀切开擦镜纸，通过拖带擦镜纸将孢子散落到培养基（1)中。接种约50天后孢子 萌发，出现原叶体的分化。在（1)培养基中继续培养，即可获得带根状茎的小苗，但生长缓 慢。
[0027] 表1取材时间的选择
[0029] 4.2GGB诱导与增殖培养:将小苗去除须根和叶片后，接种至GGB诱导培养基(2)上， 每瓶接种5个外植体。15天后出现绿色突起，继续在此培养条件下继代培养2-3次，绿色突起 进一步长大直至形成GGB，大小约0.5cmX 0.3cm绿色小球团，增殖率可达1:6，相较于其他培 养条件，培养基(2)获得的GGB更有利于后期小苗的分化(表2)。
[0030] 表2GGB诱导与增殖
[0032] 4.3生根培养:将获得的GGB转接至生根培养基(3)中，10天后开始出现根的分化， 20天后根长至lcm长。继续培养，可进一步分化出小叶片，大小约0.3X0.3cm，且但生长缓 慢，小叶片纤弱，未见伸长的根状茎。
[0033] 4.4分化培养基:将长有1 -2条根、分化出小叶但仍未完全分化的GGB转接至(4)培 养基中进行培养，30天即可分化出大量的凤丫蕨小苗。
[0034] 4.5离体保存:将培养基(4)中分化出的小苗转接在培养基(5)上，每瓶接种5个，小 苗继续生长。能获得根状茎明显伸长的小苗，偶尔伴生丛生小苗，但不如在培养基(4)上增 殖明显。在此培养条件下，继代周期可延长至2年以上，大大延长了继代周期，缩短了继代次 数，维持了种质资源的遗传性(表3)。同时，利用已保存的瓶苗重复以上步骤可重新诱导获 得GGB，并形成新的幼苗。
[0035]表3离体保存培养基
[0037] 4.6移栽:将培养基(4)中的带根小苗进行移栽。首先将瓶苗放在大棚内炼苗3-5 天，然后从培养瓶中取出生根苗，洗去附着的培养基，略微晾干水分后进行移栽。移栽基质 为经5 %甲醛水溶液消毒过的腐殖土 :沙土 = 2:1，栽好后浇透定根水，前期视苗生长状况进 行及时通风或补水处理，待试管苗长出新叶后，揭膜粗放管理，移栽成苗率80 %以上。
【主权项】
1. 一种凤丫蕨的快速繁殖和离体保存方法，该方法包括外植体的获取、绿色球状体GGB 诱导与增殖培养、生根培养、分化培养、离体保存或移栽步骤，取野外自然生长的凤丫蕨孢 子，在孢子萌发培养基（1)中培养，获得带根状茎的小苗，转入绿色球状体诱导与增殖培养 基(2)中培养，将生成的绿色球状体转入生根培养基(3)中，然后将长出1-2条根、分化出小 叶但仍未完全分化的绿色球状体转接至分化培养基(4)中进行培养，分化出的小苗转接在 离体培养基(5)上继代培养离体保存，或将分化出的小苗进行移栽，所述的（1)孢子萌发培 养基为:基本培养基为MS大量元素取1/4，其余成分与MS相同的1/4MS培养基；（2)GGB诱导与 增殖培养基为:MS+6-BA0 · 5mg/L+NAA0 · 2mg/L; (3)生根培养基为：1 /1OMS; (4)分化培养基 为：1/2MS+IBA0 · lmg/L+IAAO · lmg/L; (5)离体保存培养基为：1/2MS，以上培养基均添加蔗糖 30g/L，琼脂5.8g/L固化，pH5.8，（1) (2) (3) (5)在如下培养条件下培养:培养温度23 ± 2 °C， 光照强度10-20ym〇l/(m2 · s)，光照12h/d;(4)的培养条件为:培养温度28°C，光照强度50μ mol/(m2 · s)，光照 12h/d。2. 根据权利要求1所述的一种凤丫蕨的快速繁殖和离体保存方法，其特征在于所述的 外植体的获取是选择野外自然生长且发育良好，没有病虫害的成年凤丫蕨植株，剪下长有 成熟孢子的叶片，通过自然脱落获得孢子，将孢子用双层擦镜纸包好，放入无菌水中浸泡6 小时，然后用75%酒精消毒5-7s，再用无菌水冲洗3遍，用0.1 %HgCl2水溶液进行消毒5-lOmin，在无菌条件下用无菌水反复水洗3遍，滤纸吸干多余水分，然后用解剖刀切开擦镜 纸，通过拖带擦镜纸将孢子散落到培养基（1)中，接种90天后孢子萌发，出现原叶体的分化， 在(1)培养基中继续培养，获得带根状茎的小苗。3. 根据权利要求1所述的一种凤丫蕨的快速繁殖和离体保存方法，其特征在于所述的 绿色球状体GGB诱导与增殖培养是（1)培养基中获得的带根状茎小苗去除须根和叶片后，接 种至绿色球状体诱导培养基(2)上，每瓶接种5个外植体，15天后出现绿色突起，继续在此培 养条件下继代培养2-3次，绿色突起进一步长大直至形成绿色球状体。4. 根据权利要求1所述的一种凤丫蕨的快速繁殖和离体保存方法，其特征在于所述的 生根培养是将获得的绿色球状体转接至生根培养基(3)中，10天后开始出现根的分化，20天 后根长至lcm长，继续培养，可进一步分化出细小叶片。5. 根据权利要求1所述的一种凤丫蕨的快速繁殖和离体保存方法，其特征在于所述的 分化培养是将长有1-2条根、分化出小叶但仍未完全分化的绿色球状体转接至(4)培养基中 进行培养，30天分化出大量的凤丫蕨小苗。6. 根据权利要求1所述的一种凤丫蕨的快速繁殖和离体保存方法，其特征在于所述的 离体保存是将培养基(4)中分化出的小苗转接在培养基（5)上，每瓶接种5个，小苗继续生 长，继代周期2年以上。7. 根据权利要求1所述的一种凤丫蕨的快速繁殖和离体保存方法，其特征在于所述的 移栽是将培养基(4)中的带根小苗进行移栽，首先将瓶苗放在大棚内炼苗3-5天，然后从培 养瓶中取出生根苗，洗去附着的培养基，略微晾干水分后进行移栽，移栽基质为经5%甲醛 水溶液消毒过的腐殖土 :沙土 = 2:1，栽好后浇透定根水，前期视苗生长状况进行及时通风 或补水处理，待试管苗长出新叶后，揭膜粗放管理。8. 根据权利要求1所述的一种凤丫蕨的快速繁殖和离体保存方法，其特征在于所述的 外植体的获取是在选择野外生长发育良好，没有病虫害的成年凤丫蕨植株，剪下长有成熟 孢子的叶片，装好带回实验室，通过自然脱落获得孢子，将孢子用双层擦镜纸包好，放入无 菌水中浸泡6小时，然后用75 %酒精消毒5-7s，再用无菌水冲洗3遍，用0.1 %HgCl2水溶液进 行消毒5-10min，在无菌条件下用无菌水反复水洗3遍，滤纸吸干多余水分，然后用解剖刀切 开擦镜纸，通过拖带擦镜纸将孢子散落到培养基（1)中，接种90天后孢子萌发，出现原叶体 的分化，在(1)培养基中继续培养； 所述的绿色球状体GGB诱导与增殖培养是将小苗去除须根和叶片后，接种至GGB诱导培 养基(2)上，每瓶接种5个外植体，15天后出现绿色突起，继续在此培养条件下继代培养2-3 次，绿色突起进一步长大直至形成GGB，大小约0 · 5cm X 0 · 3cm绿色小球团，增殖率可达1:6; 所述的生根培养是将获得的GGB转接至生根培养基（3)中，10天后开始出现根的分化， 20天后根长至lcm长，继续培养，进一步分化出细小叶片； 所述的分化培养是将长有1-2条根、分化出小叶但仍未完全分化的GGB转接至(4)培养 基中进行培养，30天即可分化出大量的凤丫蕨小苗； 所述的离体保存是将培养基(4)中分化出的小苗转接在培养基(5)上，每瓶接种5个，小 苗继续生长，获得根状茎明显长长的小苗，偶尔伴生丛生小苗，在此培养条件下，继代周期 延长至2年以上，延长了继代周期，缩短了继代次数，维持了种质资源的遗传性； 所用培养瓶均为白色透明玻璃瓶，直径7.5cm X高9.0cm，容积300ml; 所述的移栽是将培养基（4)中的带根小苗进行移栽，首先将瓶苗放在大棚内炼苗3-5 天，然后从培养瓶中取出生根苗，洗去附着的培养基，略微晾干水分后进行移栽，移栽基质 为经5 %甲醛水溶液消毒过的腐殖土 :沙土 = 2:1，栽好后浇透定根水，前期视苗生长状况进 行及时通风或补水处理，待试管苗长出新叶后，揭膜粗放管理，移栽成苗率80 %以上。
【文档编号】A01H4/00GK105850741SQ201610255272
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月22日
【发明人】何俊, 孟静, 张舒, 杨俊波, 李德铢
【申请人】中国科学院昆明植物研究所