一种快速繁殖鸡蛋花种苗的方法
【专利摘要】本发明属植物栽培技术领域，涉及一种快速繁殖鸡蛋花种苗的方法，是取红花鸡蛋花带芽的、去叶的茎尖或茎段，切成小段经消毒灭菌后，利用改良的MS培养基进行不定芽的诱导、增殖培养、壮苗培养、生根培养，然后进行炼苗，移栽控温大棚培育。本发明以带芽的红花鸡蛋花茎段作为外植体，在不经愈伤组织阶段进行快速繁育，所得红花鸡蛋花种苗能够保持原品种的优良性状，遗传性状稳定，变异小，具有操作简单、成本低、生长速度快、周期短、繁殖率高等特点，是一种鸡蛋花以芽繁芽的无菌快繁体系，为鸡蛋花繁育和产业化生产奠定基础。
【专利说明】
一种快速繁殖鸡蛋花种苗的方法
技术领域
[0001 ]本发明属植物栽培技术领域，涉及一种鸡蛋花种苗的繁殖方法，具体是一种以鸡 蛋花茎段作为外植体进行快速繁殖种苗的方法。
【背景技术】
[0002] 鸡蛋花(Plumeria rubra L.cv.Acutifolia)，属夹竹桃科鸡蛋花属落叶灌林或乔 木，喜湿热气候，原产于墨西哥等美洲热带地区，现广植于亚洲热带及亚热带地区，国内主 产于福建、广东、广西、云南、海南等地。鸡蛋花树形优美，树冠半球形，叶似枇杷，大而青绿， 花色素雅，芳香，且花型奇特，是优良的庭院树种，既可在庭园、草地栽植观赏，也可盆栽，鲜 切花可用于插花或制作花束、花篮等。
[0003] 鸡蛋花干燥花朵为广东地区常用药材，是广东凉茶"五花茶"的主要原料之一，有 清热解暑、利湿、止咳的功效，用于湿热下痢，肺热咳嗽等。鸡蛋花含有鸡蛋花酸(plumeric acid)、甙类及挥发油，气味芳香，可提取香精应用于日用化妆品行业。
[0004] 鸡蛋花的常规繁殖方法是利用种子繁殖，也有采用扦插、压条、嫁接等方式繁殖， 但其繁殖速度慢、周期长，远远不能满足产业化的需求。目前，有相关研究人员尝试利用组 培技术进行快速繁殖鸡蛋花的相关研究，如专利CN103444540A公开了一种组织培养快速繁 育红花鸡蛋花的方法，其以红鸡蛋花叶片为外植体，在诱导形成愈伤组织后，再经愈伤组织 分化、芽增殖和生根培养，形成完整植株小苗，最后进行炼苗和移栽。然而，其以叶片作为外 植体，因叶片大多由已分化的细胞组成，其再生成植株通常需要经历从分化状态恢复到分 生组织状态的脱分化过程，而经脱分化的细胞在一定条件下经愈伤组织阶段再分化出芽或 胚状体而形成植株时，其后代易发生变异，导致获得的植株遗传学特性不稳定。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的提供一种快速繁殖鸡蛋花种苗的方法，以鸡蛋花茎段作为外植体进 行组织培养，在不经过愈伤组织阶段实现种苗快速繁殖，且能保证其遗传学特性，减少玻璃 化发生率，以满足城市绿化美化对鸡蛋花种苗的需求。
[0006] 本发明所采用的技术方案：
[0007] -种快速繁殖鸡蛋花种苗的方法，其步骤如下：
[0008] 1)外植体的取材与消毒：取红花鸡蛋花带芽的、去叶的茎尖或茎段，切成长1~ 1.5cm、带2~3个腋芽的小段作为外植体，消毒灭菌后得到无菌外植体。
[0009] 所述红花鸡蛋花外植体的消毒过程是：首先用自来水流水冲洗，然后用75%酒精 浸泡8~15 s，再放入0.1 % H g C12溶液消毒灭菌10~15 m i n，消毒灭菌液中加入2~3滴吐温-20,最后用无菌水冲洗3~5次，得到无菌外植体。
[0010] 2)诱导分化不定芽:将经消毒的外植体接种至诱导培养基中进行不定芽的诱导培 养，培养条件:温度为24~26°C，光照强度为1500~25001x，光照时间为10~12h/d;培养30 天后，外植体分化出不定芽。所述诱导培养基是以MS培养基为基本培养基，并添加6- BAO ? 5mg/L、NAA 0 ? 02mg/L、鹿糖30g/L、卡拉胶6 ? 5g/L，pH为5 ? 8。
[0011] 3)不定芽增殖培养:切取不定芽接种于增殖培养基中进行培养，培养条件:温度为 24~26°C，光照强度为1500~25001x，光照时间为10~12h/d;培养30天后获得大量的丛生 芽。所述增殖培养基是以MS培养基为基本培养基，并添加6-BA 2~3mg/L、NAA0.2~0.5mg/ L、鹿糖30g/L、卡拉胶 6 ? 5g/L，pH为5 ? 8。
[0012] 4)壮苗培养:将丛生芽接种至壮苗培养基中进行壮苗培养，培养条件:温度为24~ 26°C，光照强度为1500~25001x，光照时间为10~12h/d。所述壮苗培养基是以MS培养基为 基本培养基，并添加蔗糖30g/L、卡拉胶6.5g/L，pH为5.8。
[0013] 5)试管苗生根培养:待经壮苗培养的不定芽生长到2~3cm时，将不定芽丛进行单 株分离，接种到生根培养基上进行生根培养，培养条件:温度为24~26°C，光照强度为1500 ~25001x，光照时间为10~12h/d;培养30天后形成良好根系，获得完整植株。所述生根培养 基是以1/2MS培养基为基本培养基，并添加NAA 1.0mg/L、IBA 0.5mg/L、蔗糖30g/L、卡拉胶 6.5g/L，pH为5.8;
[0014] 6)试管苗炼苗移栽:将生根苗移至室外炼苗7~10天后取出，洗净小苗根部的培养 基，并在0.1%的高锰酸钾溶液中进行漂洗、消毒后，移至1:1的椰糠和腐殖土的基质中，并 放于控温大棚内进行培育。
[0015] 本发明以带芽的红花鸡蛋花茎段作为外植体，在不经愈伤组织阶段进行快速繁 育，所得红花鸡蛋花种苗能够保持原品种的优良性状，遗传性状稳定，变异小，具有操作简 单、成本低、生长速度快、周期短、繁殖率高等特点，是一种鸡蛋花以芽繁芽的无菌快繁体 系，为鸡蛋花繁育和产业化生产奠定基础。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合实施例，对本发明的【具体实施方式】作进一步详细描述。以下实施例用于 说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常 按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0017] 一、红花鸡蛋花种苗繁殖
[0018] 实施例一
[0019] 1、外植体的取材与消毒：于2015年5月在中国热带农业科学院热带作物品种资源 研究所基地，选取处于生长旺盛时期的红花鸡蛋花植株，采集当年生、有饱满而未萌发的腋 芽的嫩枝作为外植体。取带芽的、去叶的茎尖，切成长1.2cm、带2~3个腋芽的小段，一共切 取100段作为外植体放在l〇〇ml三角瓶进行消毒:首先用自来水流水冲洗lOmin，用75%酒精 浸泡l〇s，再放入0.1 %HgCl2溶液消毒灭菌12min，消毒灭菌液中加入2滴吐温-20,最后用无 菌水冲洗3次，得到无菌外植体。
[0020] 2、诱导分化不定芽：将经消毒的外植体接种至诱导培养基(MS+6-BA 0.5mg/L+ NAA0.02mg/L+鹿糖30g/L+卡拉胶6.5g/L，pH为5.8)中进行不定芽的诱导培养，培养条件:温 度为25°C，光照强度为18001x，光照时间为10h/d;培养30天后，外植体分化出不定芽。
[0021] 3、不定芽增殖培养:将分化出不定芽的茎尖细切成含有2个不定芽的小段200段， 接种于增殖培养基(MS+6-BA 2mg/L+NAA0 ? 3mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6 ? 5g/L，pH为5 ? 8)中进 行培养，培养条件:温度为24°C，光照强度为16001x，光照时间为12h/d;培养30天后获得大 量的丛生芽。
[0022] 4、壮苗培养：将丛生芽接种至壮苗培养基(MS+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L，pH为 5.8) 中进行壮苗培养，培养条件:温度为25°C，光照强度为18001x，光照时间为1 lh/d。
[0023] 5、试管苗生根培养:待经壮苗培养的不定芽生长到2~3cm时，单株切取400株，接 种到生根培养基（1/2MS+NAA 1 ? Omg/L+IBA 0 ? 5mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6 ? 5g/L，pH为5 ? 8) 上进行生根培养，培养条件:温度为25°C，光照强度为20001x，光照时间为12h/d;培养30天 后形成良好根系，获得完整植株。
[0024] 6、试管苗炼苗移栽:将300株根系完整的生根苗移至室外炼苗8天后取出，洗净小 苗根部的培养基，并在0.1%的高锰酸钾溶液中进行漂洗、消毒后，移至1:1的椰糠和腐殖土 的基质中，于控温大棚内进行培育。
[0025] 实施例二
[0026] 1、外植体的取材与消毒:于2015年6月中旬在中国热带农业科学院热带作物品种 资源研究所基地，选取处于生长旺盛时期的红花鸡蛋花植株，采集当年生、有饱满而未萌发 的腋芽的嫩枝作为外植体。取带芽的、去叶的茎段，切成长1.5cm、带2~3个腋芽的小段，一 共切取100段作为外植体放在l〇〇ml三角瓶进行消毒:首先用自来水流水冲洗lOmin，用75 % 酒精浸泡13s，再放入0.1 %HgCl2溶液消毒灭菌12min，消毒灭菌液中加入3滴吐温-20，最后 用无菌水冲洗4次，得到无菌外植体。
[0027] 2、诱导分化不定芽：将经消毒的外植体接种至诱导培养基(MS+6-BA 0.5mg/L+ NAA0.02mg/L+鹿糖30g/L+卡拉胶6.5g/L，pH为5.8)中进行不定芽的诱导培养，培养条件:温 度为26°C，光照强度为22001x，光照时间为12h/d;培养30天后，外植体分化出不定芽。
[0028] 3、不定芽增殖培养:将分化出不定芽的茎段细切成含有2个不定芽的小段200段， 接种于增殖培养基(MS+6-BA 3mg/L+NAA0 ? 3mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6 ? 5g/L，pH为5 ? 8)中进 行培养，培养条件:温度为24°C，光照强度为21001x，光照时间为12h/d;培养30天后获得大 量的丛生芽。
[0029] 4、壮苗培养：将丛生芽接种至壮苗培养基(MS+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L，pH为 5.8) 中进行壮苗培养，培养条件:温度为24°C，光照强度为2500lx，光照时间为1 Oh/d。
[0030] 5、试管苗生根培养:待经壮苗培养的不定芽生长到2~3cm时，单株切取400株，接 种到生根培养基（1/2MS+NAA 1 ? Omg/L+IBA 0 ? 5mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6 ? 5g/L，pH为5 ? 8) 上进行生根培养，培养条件:温度为26°C，光照强度为18001x，光照时间为10h/d;培养30天 后形成良好根系，获得完整植株。
[0031] 6、试管苗炼苗移栽:将300株根系完整的生根苗移至室外炼苗10天后取出，洗净小 苗根部的培养基，并在0.1%的高锰酸钾溶液中进行漂洗、消毒后，移至1:1的椰糠和腐殖土 的基质中，于控温大棚内进行培育。
[0032] 实施例三
[0033] 1、外植体的取材与消毒:于2015年7月中旬在中国热带农业科学院热带作物品种 资源研究所基地，选取处于生长旺盛时期的红花鸡蛋花植株，采集当年生、有饱满而未萌发 的腋芽的嫩枝作为外植体。取带芽的、去叶的茎段，切成1.3cm长、带2~3个腋芽的小段，一 共切取100段作为外植体放在l〇〇ml三角瓶进行消毒:首先用自来水流水冲洗10min，用75 % 酒精浸泡15s，再放入0.1 %HgCl2溶液消毒灭菌12min，消毒灭菌液中加入2滴吐温-20，最后 用无菌水冲洗5次，得到无菌外植体。
[0034] 2、诱导分化不定芽：将经消毒的外植体接种至诱导培养基(MS+6-BA 0.5mg/L+ NAA0.02mg/L+鹿糖30g/L+卡拉胶6.5g/L，pH为5.8)中进行不定芽的诱导培养，培养条件:温 度为25°C，光照强度为24001x，光照时间为10h/d;培养30天后，外植体分化出不定芽。
[0035] 3、不定芽增殖培养:将分化出不定芽的茎段细切成含有2个不定芽的小段200段， 接种于增殖培养基(MS+6-BA 2mg/L+NAA0 ? 5mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6 ? 5g/L，pH为5 ? 8)中 进行培养，培养条件:温度为26°C，光照强度为2400lx，光照时间为10h/d;培养30天后获得 大量的丛生芽。
[0036] 4、壮苗培养：将丛生芽接种至壮苗培养基(MS+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L，pH为 5.8)中进行壮苗培养，培养条件:温度为26°C，光照强度为21001x，光照时间为1 lh/d。
[0037] 5、试管苗生根培养:待经壮苗培养的不定芽生长到2~3cm时，单株切取400株，接 种到生根培养基（1/2MS+NAA 1 ? Omg/L+IBA 0 ? 5mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6 ? 5g/L，pH为5 ? 8) 上进行生根培养，培养条件:温度为25°C，光照强度为24001x，光照时间为12h/d;培养30天 后形成良好根系，获得完整植株。
[0038] 6、试管苗炼苗移栽:将300株根系完整的生根苗移至室外炼苗7天后取出，洗净小 苗根部的培养基，并在0.1%的高锰酸钾溶液中进行漂洗、消毒后，移至1:1的椰糠和腐殖土 的基质中，于控温大棚内进行培育。
[0039]二、种苗繁殖效果鉴定
[0040] 1.红花鸡蛋花外植体不定芽诱导效果鉴定
[0041] 为鉴定红花鸡蛋花外植体的诱导效果，对上述实施例的不定芽诱导情况进行观 察，统计不定芽诱导数，计算诱导率，结果见表1。
[0042] 表1红花鸡蛋花外植体诱导情况
[0044] 上述红花鸡蛋花外植体不定芽诱导效果表明，本发明以改良的MS培养基进行不定 芽诱导，诱导率达80%以上，具有较好的分化效果。
[0045] 2.红花鸡蛋花不定芽增殖效果鉴定
[0046] 为鉴定红花鸡蛋花不定芽的增殖效果，对上述实施例的不定芽的增殖情况进行观 察，统计增殖数，计算增值系数，结果见表2。
[0047]表2不定芽的增殖情况
[0050]上述不定芽增殖效果表明，本发明以改良的MS培养基进行不定芽增殖，增殖系数 达到5.0以上，增殖效果明显。
[0051] 3.不定芽生根效果鉴定
[0052]为鉴定不定芽的生根效果，对上述实施例的不定芽生根情况进行观察，统计生根 数，计算生根率，结果见表3。
[0053]表3不定芽的生根情况
[0055]上述不定芽生根效果表明，本发明以改良的MS培养基对不定芽进行诱导生根，在 短时间内（1个月左右)诱导出完整根系，生根率达90%以上。
[0056] 4.生根苗苗圃移栽效果鉴定
[0057]为鉴定生根苗的移栽成活效果，对上述实施例的生根苗苗圃移栽生长情况进行观 察，统计成活数，计算生根率，结果见表4。
[0058]表4生根苗的移栽生长情况
[0060] 上述移栽效果表明，本发明以诱导出良好根系的生根苗进行苗圃移栽，以椰糠和 腐殖土的混合物为栽培基质，具有较高的生根苗移栽成活率，达到90%以上，可以满足批量 种苗繁殖，为鸡蛋花繁育和产业化生产奠定基础。。
[0061] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰 也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种快速繁殖鸡蛋花种苗的方法，其特征在于，其步骤如下： 1) 外植体的取材与消毒：取红花鸡蛋花带芽的、去叶的茎尖或茎段，切成长1~1.5cm、 带2~3个腋芽的小段作为外植体，消毒灭菌后得到无菌外植体； 2) 诱导分化不定芽:将经消毒的外植体接种至诱导培养基中进行不定芽的诱导培养， 培养条件:温度为24~26°C，光照强度为1500~25001x，光照时间为10~12h/d;培养30天 后，外植体分化出不定芽；所述诱导培养基是以MS培养基为基本培养基，并添加6-BA 0 · 5mg/L、NAA0 · 02mg/L、鹿糖30g/L、卡拉胶 6 · 5g/L，pH为5 · 8; 3) 不定芽增殖培养:切取不定芽接种于增殖培养基中进行培养，培养条件:温度为24~ 26°C，光照强度为1500~25001x，光照时间为10~12h/d;培养30天后获得大量的丛生芽;所 述增殖培养基是以MS培养基为基本培养基，并添加6-BA 2~3mg/L、NAA0.2~0.5mg/L、蔗糖 30g/L、卡拉胶 6.5g/L，pH为5.8; 4) 壮苗培养:将丛生芽接种至壮苗培养基中进行壮苗培养，培养条件:温度为24~26 °C，光照强度为1500~25001x，光照时间为10~12h/d;所述壮苗培养基是以MS培养基为基 本培养基，并添加蔗糖30g/L、卡拉胶6.5g/L，pH为5.8; 5) 试管苗生根培养:待经壮苗培养的不定芽生长到2~3cm时，将不定芽丛进行单株分 离，接种到生根培养基上进行生根培养，培养条件：温度为24~26°C，光照强度为1500~ 25001x，光照时间为10~12h/d;培养30天后形成良好根系，获得完整植株;所述生根培养基 是以1/2MS培养基为基本培养基，并添加NAA 1.0mg/L、IBA 0.5mg/L、蔗糖30g/L、卡拉胶 6.5g/L，pH为5.8; 6) 试管苗炼苗移栽:将生根苗移至室外炼苗7~10天后取出，洗净小苗根部的培养基， 并在0.1%的高锰酸钾溶液中进行漂洗、消毒后，移至1:1的椰糠和腐殖土的基质中，并放于 大棚内进行培育。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述红花鸡蛋花外植体的消毒过程是：首 先用自来水流水冲洗，然后用75 %酒精浸泡8~15s，再放入0.1 % HgC 12溶液消毒灭菌10~ 15min，消毒灭菌液中加入2~3滴吐温-20,最后用无菌水冲洗3~5次，得到无菌外植体。
【文档编号】A01H4/00GK105850742SQ201610279094
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月28日
【发明人】李克烈, 李志英, 徐立, 符运柳, 黄碧兰
【申请人】中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所