一种梅片树愈伤组织的诱导与增殖方法
【专利摘要】本发明公开了一种梅片树愈伤组织的诱导与增殖方法，是取梅片树当年生枝条或嫩叶作为外植体，进行表面消毒；然后将消毒后的外植体置于愈伤组织诱导培养基上，进行培养获得愈伤组织；再将愈伤组织置于继代增殖培养基上进行培养，获得大量的愈伤组织；最后将愈伤组织置于防褐化培养基上进行培养，获得质地疏松的淡白色和淡黄色的愈伤组织。本发明不仅能够快速诱导得到梅片树愈伤组织，且诱导率较高、所获得的梅片树愈伤组织生长旺盛，可长期继代保持，为梅片树生物技术、细胞悬浮培养和生产次生代谢产物等研究奠定了良好的基础。
【专利说明】
-种梅片树愈伤组织的诱导与増殖方法
技术领域
[0001] 本发明设及植物生物技术领域，特别设及一种梅片树愈伤组织的诱导与增殖方 法。
【背景技术】
[0002] 天然右旋龙脑是从精科植物中提取的一种珍贵药材和名贵香料，有抗癌治癌、抗 菌消炎、消肿止痛、桂风醒神、开资解毒等作用，广泛应用于医药、食品、化妆品和香料工业 上，我国主要依赖进口，价格很高。目前我国用于提取右旋龙脑的最佳植物资源是龙脑精， 而广东省发现的梅片树是精科植物阴香(Cinnammonia burmannii)的一个化学型，有研究 人员通过水蒸气蒸馈法提取了梅片树叶中的挥发油，发现其主要成分有右旋龙脑 (78.6%)、乙酸龙脑醋(3.26%)、斯己醇(2.60%)和按叶油素（1.92%)，说明梅片树叶富含 右旋龙脑，是天然右旋龙脑的良好植物原料资源。但是梅片树的繁殖方式目前主要是有性 繁殖和杆插，有性繁殖容易产生性状变异，杆插生根较慢，历时较长，且受制于环境和母株 条数的限制。而采用组织培养技术不仅能解决该品种的繁殖困难问题，还可W通过细胞培 养批量生产天然右旋龙脑，W改变其天然资源短缺状况和维护生态平衡，具有重要的经济 价值和生态效益。
[0003] 近年来，通过组织培养技术获得大量优质种苗、通过植物细胞培养进行天然有效 成分的生产等生物技术已经取得了一些成就。然而，目前尚未发现梅片树组织快繁的相关 报道，其细胞培养还处在愈伤组织的初步诱导阶段，还亟待完善愈伤组织的诱导培养，解决 愈伤组织的继代保持培养、细胞系的筛选和悬浮细胞系建立等问题。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点，提供一种梅片树愈伤组织的诱导 与增殖方法，它能够在短时间内产生大量优质的梅片树愈伤组织，解决愈伤组织继代过程 中的褐化问题。
[0005] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0006] -种梅片树愈伤组织的诱导与增殖方法，包括下述步骤：
[0007] (1)无菌外植体茎段或叶片的获取:选取右旋龙脑含量较高的梅片树优良植株，取 其当年生枝条或嫩叶作为外植体进行消毒处理;将消毒后的嫩叶表面水分吸干，剪成1~ 2cm2左右大小的叶片;将消毒后的枝条剪成1~2cm长短的茎段；
[000引（2)梅片树愈伤组织的诱导培养:取无菌梅片树的叶片或茎段，将其W平放的方式 接种到愈伤组织诱导培养基上，置于培养箱中黑暗条件下培养25~35天，得到初代愈伤组 织，培养溫度为(25±1)°C;
[0009] (3)梅片树愈伤组织的继代培养:将初代愈伤组织中生长旺盛、质地疏松的淡白色 愈伤组织转接到继代增殖培养基中，于(25±irC、黑暗条件下培养10~20天，获得大量继 代愈伤组织；
[0010] (4)梅片树愈伤组织的防褐化培养:将生长状态较好的继代愈伤组织转接到不同 的防褐化培养基中，于(25 ± 1 rC、黑暗条件下进行培养，10~20天转接一次。
[0011] 步骤(1)中，所述消毒处理是提前Ξ天喷洒600~900倍多菌灵溶液，将采集的枝条 和嫩叶用饱和的洗涂液浸泡10~30min，流水冲洗10~30min后惊干，于超净工作台内，将嫩 叶用75%酒精浸泡10~50s，无菌水冲洗4~6次，再用0.1%HgCl2溶液(加1~3滴吐溫20)振 荡浸泡4~lOmin，无菌水冲洗4~6次;将枝条用75%酒精浸泡30~120s，无菌水冲洗4~6 次，再用0.1%化亂溶液(加1~3滴吐溫20)振荡浸泡8~15min，用无菌水冲洗4~6次。所述 洗涂液可W用立白洗洁精溶液。
[0012] 步骤(2)中，所述愈伤组织诱导培养基的组成为下述两者之一 ：（1)MS培养基、2~ 6mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、0.2~0.6mg/L的6-节氨基腺嚷岭、10~30g/L的薦糖和7~8g/L 的琼脂粉；（2)MS培养基、0.1~Img/L的糞乙酸、2~4mg/L的6-节氨基腺嚷岭、10~30g/L的 薦糖和7~8g/L的琼脂粉。
[0013] 步骤(3)中，所述继代增殖培养基的组成为下述两者之一：（1)MS培养基、2~6mg/L 的2，4-二氯苯氧乙酸、0.2~0.6mg/L的6-节氨基腺嚷岭、10~30g/L的薦糖和7~8g/L的琼 脂粉；（2)MS培养基、0.1~Img/L的糞乙酸、2~5mg/L的6-节氨基腺嚷岭、10~30g/L的薦糖 和7~8g/L的琼脂粉。
[0014] 步骤(4)中，所述的防褐化培养基成分为:MS培养基、10~30g/L的薦糖、7~8g/L的 琼脂粉、3~4mg/L的6-节氨基腺嚷岭、0.5~Img/L的糞乙酸和防褐添加物。所述防褐添加物 为0~2. Og/L的聚乙締邮咯烧酬、0~0.3g/L的抗坏血酸、0~1. Og/L的酸水解酪蛋白或0~ l.Og/L的巧樣酸中的一种或一种W上。
[0015] 本发明与现有技术相比具有如下优点和效果：
[0016] (1)本发明能够快速获得大量的梅片树愈伤组织。
[0017] (2)本发明获得的梅片树愈伤组织具有较高诱导率、生长旺盛、不褐化等优点，可 长期继代保持。
【附图说明】
[0018] 图1为梅片树叶片诱导出的愈伤组织。
[0019] 图2为梅片树茎段诱导出的愈伤组织。
[0020] 图3为继代培养中的愈伤组织。
[0021] 图4为继代培养中褐化的愈伤组织。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0023] 实施例1:外植体的选取和处理方法。
[0024] 选取右旋龙脑含量较高的梅片树优良植株，提前Ξ天喷洒800倍多菌灵溶液，于晴 朗的午后，采集当年生梅片树枝条作为外植体，用立白洗洁精溶液浸泡15min，流水冲洗 15min，惊干后备用；将枝条上较嫩的叶子剪下，于无菌操作台内，将嫩叶用75%酒精浸泡 20s，无菌水冲洗6次，再用0.1 %化Cl2溶液(加2滴吐溫20)振荡浸泡6min，无菌水冲洗6次， 然后将叶子表面水分吸干，剪成IcmX 1cm左右大小的片状，备用；于无菌操作台内将预处理 过的枝条剪成1~2cm长短的茎段，用75%酒精浸泡1.5min，无菌水冲洗6次，再用0.1 % HgCl2溶液(加2滴吐溫20)振荡浸泡12min，无菌水冲洗6次，备用。
[0025] 实施例2:梅片树愈伤组织的诱导培养方法。
[0026] (1)2,4-二氯苯氧乙酸和6-节氨基腺嚷岭组合对梅片树愈伤组织诱导的影响
[0027] 将实施例1中处理过的无菌外植体接种到添加有2,4-二氯苯氧乙酸和6-节氨基腺 嚷岭的梅片树愈伤组织诱导培养基上。接种方式:叶片W正面向上的方式平放在培养基表 面，茎段W平躺的方式放在培养基表面。培养条件:溫度(25±irC、暗培养1个月后得到初 级培养梅片树愈伤组织。经过W上诱导培养后，在梅片树叶片和茎段的切口处出现愈伤组 织，如图1、图2所示。
[0028] W上梅片树愈伤组织的诱导培养共进行9个处理，培养基配方如表1所示，每个处 理5瓶，每瓶接种6个外植体，重复多次，W统计其愈伤组织诱导率和生长状态。每个处理使 用的梅片树诱导培养基配方如表1所示，pH值为5.8，经高溫高压灭菌后备用。2，4-二氯苯氧 乙酸和6-节氨基腺嚷岭组合对梅片树愈伤组织诱导的影响见表2。
[0029] 表1 9个处理使用的培养基配方
[0030]
[0031] 表2 2,4-二氯苯氧乙酸和6-节氨基腺嚷岭组合对梅片树愈伤组织诱导的影响
[0032]
[0033] 注:表中k和q为各指标因素水平均值，R为各因素水平极差。
[0034] V'表示愈伤组织基本全部褐化死亡；
[0035] "++"表示愈伤组织生长状态较差，褐化死亡率较高；
[0036] "+++"表示愈伤组织生长状态一般，呈现为黄色，比较容易褐化；
[0037] "++++"表示愈伤组织生长状态较好，呈现淡白色。
[0038] 研究2,4-二氯苯氧乙酸和6-节氨基腺嚷岭组合对梅片树愈伤组织诱导的影响发 现，实验中9个处理对梅片树愈伤组织的诱导率均比较高，其中茎段愈伤组织诱导率普遍比 叶片愈伤组织诱导率要高，说明梅片树茎段更容易诱导出愈伤组织。极差分析结果表明2， 4-二氯苯氧乙酸对两种外植体愈伤组织诱导的影响均比6-节氨基腺嚷岭大。从上表2可知， MS培养基、4. Omg/L的2，4-二氯苯氧乙酸和0.4mg/L的6-节氨基腺嚷岭的组合中，叶片愈伤 组织的诱导率和生长状态显著好于其他处理组;而处理5和6中茎段愈伤组织诱导率均高达 100%，诱导出的愈伤组织比较大、生长旺盛，但相比之下，处理6诱导出的愈伤组织，在20天 后会有部分逐渐变为淡黄色，易褐化，因此选择MS培养基、4. Omg/L的2，4-二氯苯氧乙酸和 0.4mg/L的6-节氨基腺嚷岭的组合为梅片树茎段愈伤组织诱导最佳培养基配方。但进一步 观察发现2,4-二氯苯氧乙酸和6-节氨基腺嚷岭组合初级诱导出的愈伤组织比较致密，不利 于后续进行细胞悬浮培养等实验。
[0039] (2)6-节氨基腺嚷岭和糞乙酸组合对梅片树愈伤组织诱导的影响
[0040] 采用与实施例2中步骤（1)相同的方法进行梅片树愈伤组织诱导培养，不同的是， 所使用的诱导培养基中激素组合为6-节氨基腺嚷岭（2mg/L、3mg/L、4mg/L)和糞乙酸 (ο. lmg/L、0.5mg/L、Img/L)，6-节氨基腺嚷岭和糞乙酸组合对梅片树愈伤组织诱导的影响 见表3。
[0041] 研究6-节氨基腺嚷岭和糞乙酸组合对梅片树愈伤组织诱导的影响发现，实验中9 个处理对梅片树愈伤组织的诱导率均比较高，而茎段愈伤组织诱导率普遍比叶片愈伤组织 诱导率要高，说明该组合下梅片树茎段更容易诱导出愈伤组织。由表3可W看出，在茎段诱 导愈伤组织的9组处理中，愈伤组织的诱导率均达到95% W上，此时观察各处理下愈伤组织 的生长状态，记录下呈现淡白色、生长旺盛、疏松状态的愈伤组织所占比例进行处理。极差 分析结果表明，两种激素对梅片树叶片愈伤组织诱导率的影响从大到小的顺序为糞乙酸〉 6-节氨基腺嚷岭，对茎段愈伤组织诱导的影响大小顺序为6-节氨基腺嚷岭〉糞乙酸。从表3 可知，MS培养基、3mg/L6-节氨基腺嚷岭和Img/L糞乙酸的组合中，叶片愈伤组织的诱导率和 生长状态显著好于其他处理组;而MS培养基、3mg/L6-节氨基腺嚷岭和0.5mg/L糞乙酸的组 合对茎段愈伤组织的诱导率和优质率则显著高于其他处理组，为最佳诱导培养基。观察愈 伤组织生长状态可W看出，6-节氨基腺嚷岭和糞乙酸组合诱导出的愈伤组织比较疏松，适 合进行进一步的研究。
[0042] 表3 6-节氨基腺嚷岭和糞乙酸组合对梅片树愈伤组织诱导的影响
[0043]
[0044] 注:表中k和q为各指标因素水平均值，R为各因素水平极差。
[0045] "++"表示愈伤组织生长状态较差，褐化死亡率较高；
[0046] "+++"表示愈伤组织生长状态一般，呈现为黄色，比较容易褐化；
[0047] "++++"表示愈伤组织生长状态较好，呈现淡白色。
[004引实施例3:梅片树愈伤组织继代增殖培养方法。
[0049] (1)2,4-二氯苯氧乙酸和6-节氨基腺嚷岭组合对梅片树愈伤组织继代增殖培养的 影响
[0050] 将初诱导得到的梅片树愈伤组织转接至愈伤组织继代增殖培养基中进行培养，培 养条件:溫度(25±irC、暗培养15天，不断进行继代转接，得到梅片树继代增殖愈伤组织。 愈伤组织继代增殖培养共进行9个处理，每个处理接种5瓶，重复多次。每个处理使用的愈伤 组织继代增殖培养基配方与表1相同，pH值为5.8,经高溫高压灭菌后备用。2,4-二氯苯氧乙 酸和6-节氨基腺嚷岭组合对梅片树愈伤组织继代增殖的影响见表4。
[0051] 研究2,4-二氯苯氧乙酸和6-节氨基腺嚷岭组合对梅片树愈伤组织继代增殖的影 响发现，继代转接后几天即有大量愈伤组织褐化死亡，且继代次数越多，褐化越严重，如图4 所示。观察记录愈伤组织生长状态，计算其褐化率(褐化的愈伤组织数/接种愈伤组织数)和 增殖系数(增殖后的愈伤组织数/接种愈伤组织总数），通过极差分析得出，6-节氨基腺嚷岭 对梅片树愈伤组织继代褐化率的影响比2,4-二氯苯氧乙酸大，而对愈伤组织继代增值系数 的影响大小顺序则为2,4-二氯苯氧乙酸>6-节氨基腺嚷岭。从表4可知，MS培养基、4mg/L2， 4-二氯苯氧乙酸和0.6mg/L 6-节氨基腺嚷岭的组合中，梅片树愈伤组织继代褐化率最低， 而继代增殖系数最高，为增殖继代最佳培养基。
[0052] 表4 2,4-二氯苯氧乙酸和6-节氨基腺嚷岭组合对梅片树愈伤组织继代增殖的影 响
[0化3]
[0054] 注:表中k和q为各指标因素水平均值，R为各因素水平极差。
[0055] (2)6-节氨基腺嚷岭和糞乙酸组合对梅片树愈伤组织继代增殖培养的影响
[0056] 采用与实施例3中步骤(1)相同的方法进行梅片树愈伤组织继代增殖培养，不同的 是，所使用的诱导培养基中激素组合为6-节氨基腺嚷岭（2mg/L、4mg/L、5mg/L)和糞乙酸 (ο. lmg/L、0.5mg/L、Img/L)，6-节氨基腺嚷岭和糞乙酸组合对梅片树愈伤组织继代增殖培 养的影响见表5。
[0057]表5 6-节氨基腺嚷岭和糞乙酸组合对梅片树愈伤组织继代增殖的影响
[0化引 [0化9]
[0060] 注:表中k和q为各指标因素水平均值，R为各因素水平极差。
[0061] 研究6-节氨基腺嚷岭和糞乙酸组合对梅片树愈伤组织继代增殖的影响，通过极差 分析发现，糞乙酸对梅片树愈伤组织继代增殖系数和褐化率的影响均比6-节氨基腺嚷岭 大。从表5可W看出，处理6中愈伤组织的继代增殖系数最高，达3.6,且此处理下愈伤组织的 褐化率也较低，增殖培养得到的愈伤组织生长状态好，如图3所示。因此确定6-节氨基腺嚷 岭和糞乙酸组合下最佳的继代增殖培养基为基MS培养、4mg/L6-节氨基腺嚷岭和Img/L糞乙 酸的组合。
[0062] 实施例4:梅片树愈伤组织防褐化培养方法。
[0063] 将梅片树愈伤组织转接至愈伤组织防褐化培养基中进行培养，培养条件:溫度(25 ±1)°C、暗培养15天，不断进行继代转接。W上愈伤组织防褐化培养共进行18个处理，每个 处理接种5瓶，重复4次。每个处理使用的愈伤组织继代增殖培养基配方及对应实验结果如 表6所示，每个处理培养基同时添加有30g/L的薦糖、8g/L的琼脂粉、4mg/L的6-节氨基腺嚷 岭和Img/L的糞乙酸，pH值为5.8，经高溫高压灭菌后备用。
[0064] 表6 18个处理使用的防褐化培养基配方及实验结果
[00 化]
[0066]
[0067] 注：表示愈伤组织基本全部褐化死亡；"++"表示愈伤组织生长状态较差，褐化 死亡率较高；
[006引"+++"表示愈伤组织生长状态一般，呈现为黄色，比较容易褐化；
[0069] "++++"表示愈伤组织生长状态较好，呈现淡白色。
[0070] 由上表6可W看出，未添加抗褐化剂的常规培养基中（处理18)，梅片树愈伤组织继 代培养时其褐化率高达61.37%，且未褐化的愈伤组织生长状态较差，呈现黄色，容易进一 步褐化;而处理14的培养基中，愈伤组织的褐化率已降低至3.26%，愈伤组织的生长状态较 好，呈现淡黄色、疏松态，比较适合进行细胞悬浮培养等研究。所W得出最佳的梅片树愈伤 组织防褐化培养基为MS培养基、4mg/L 6-节氨基腺嚷岭、Img/L糞乙酸、Ig/L聚乙締邮咯烧 酬和0.1 g/L抗坏血酸的组合。
【主权项】
1. 一种梅片树愈伤组织的诱导与增殖方法，其特征在于包括下述步骤： (1) 无菌外植体茎段或叶片的获取:选取右旋龙脑含量较高的梅片树优良植株，取其当 年生枝条或嫩叶作为外植体进行消毒处理;将消毒后的嫩叶表面水分吸干，剪成1~2cm 2左 右大小的叶片;将消毒后的枝条剪成1~2cm长短的莖段； (2) 梅片树愈伤组织的诱导培养:取无菌梅片树的叶片或茎段，将其以平放的方式接种 到愈伤组织诱导培养基上，置于培养箱中黑暗条件下培养25~35天，得到初代愈伤组织，培 养温度为25±1°C; (3) 梅片树愈伤组织的继代培养:将初代愈伤组织中生长旺盛、质地疏松的淡白色愈伤 组织转接到继代增殖培养基中，于25± TC、黑暗条件下培养10~20天，获得大量继代愈伤 组织； (4) 梅片树愈伤组织的防褐化培养:将生长状态较好的继代愈伤组织转接到不同的防 褐化培养基中，于25 ± 1°C、黑暗条件下进行培养，10~20天转接一次。2. 根据权利要求1所述的梅片树愈伤组织的诱导与增殖方法，其特征在于:步骤(1)中， 所述消毒处理是提前三天喷洒600~900倍多菌灵溶液，将采集的枝条和嫩叶用饱和的洗涤 液浸泡10~30min，流水冲洗10~30min后晾干，于超净工作台内，将嫩叶用75 %酒精浸泡10 ~50s，无菌水冲洗4~6次，再用0.1%HgCl2溶液和加1~3滴吐温20振荡浸泡4~IOmin，无 菌水冲洗4~6次;将枝条用75%酒精浸泡30~120s，无菌水冲洗4~6次，再用0.1 ^HgCl2溶 液和加1~3滴吐温20振荡浸泡8~15min，用无菌水冲洗4~6次。3. 根据权利要求1所述的梅片树愈伤组织的诱导与增殖方法，其特征在于:步骤(2)中， 所述愈伤组织诱导培养基的组成为下述两者之一 =(I)MS培养基、2~6mg/L的2,4_二氯苯氧 乙酸、0.2~0.6mg/L的6-苄氨基腺嘌呤、10~30g/L的蔗糖和7~8g/L的琼脂粉；（2)MS培养 基、0.1~lmg/L的萘乙酸、2~4mg/L的6-苄氨基腺嘌呤、10~30g/L的蔗糖和7~8g/L的琼脂 粉。4. 根据权利要求1所述的梅片树愈伤组织的诱导与增殖方法，其特征在于:步骤(3)中， 所述继代增殖培养基的组成为下述两者之一 ：（I )MS培养基、2~6mg//L的2，4_二氯苯氧乙 酸、0.2~0.6mg/L的6-苄氨基腺嘌呤、10~30g/L的蔗糖和7~8g/L的琼脂粉；（2)MS培养基、 0.1~lmg/L的萘乙酸、2~5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤、10~30g/L的蔗糖和7~8g/L的琼脂粉。5. 根据权利要求1所述的梅片树愈伤组织的诱导与增殖方法，其特征在于:步骤(4)中， 所述的防褐化培养基成分为:MS培养基、10~30g/L的蔗糖、7~8g/L的琼脂粉、3~4m g//L的 6_苄氨基腺嘌呤、0.5~lmg/L的萘乙酸和防褐添加物。6. 根据权利要求5所述的梅片树愈伤组织的诱导与增殖方法，其特征在于:所述防褐添 加物为0~2.0g/L的聚乙烯毗咯烷酮、0~0.3g/L的抗坏血酸、0~1.0g/L的酸水解酪蛋白或 0~1.0g/L的柠檬酸中的一种或一种以上。
【文档编号】A01H4/00GK105875406SQ201610206779
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月1日
【发明人】靳春萍, 傅明辉
【申请人】广东工业大学