生物学对抗福氏耐格里变形虫的方法，和包含原生动物Willaertia magna的消毒剂的制作方法
【专利摘要】本发明涉及对抗耐格里属和尤其是福氏耐格里变形虫种的增殖的方法，除了施加于人或动物体的治疗方法外，其特征在于它使用原生动物Willaertia magna，还涉及包含这种原生动物的消毒剂。PTA-782420060821 PTA-782520060821
【专利说明】
生物学对抗福氏耐格里变形虫的方法，和包含原生动物 Wi I laertia magna的消毒剂
技术领域
[0001] 本发明设及生物学控制耐格里（Naegleria)属和尤其是福氏耐格里变形虫 (Naegleria fowlerKN.f.))的存在及其增殖的新方法。
【背景技术】
[0002] 福氏耐格里变形虫是属于化hlkampfiidae科的非寄生变形虫。运种变形虫在人类 引起严重的病理性病症，非常幸运的是运种病症极其罕见(2007年检测到235例）：原发性变 形虫脑膜炎（PAMKCervantes-Sandoval I，2008;Kemble SK，2012;TW，2010;Su MY，2013)。 感染运些非寄生变形虫在用抗生素治疗的约一周和几周内具有灾难性预后(Su MY,2013)。 对运种感染没有真正有效的治疗;非常幸运地，所述疾病是罕见的且要求一起具备引发PAM 的特定条件。运些特定条件和所需要的接种物在现在仍然未知。然而，一些药物和抗生素似 乎影响感染的进展，例如两性霉素 B、利福平和咪康挫，其当组合时被证实对2个或3个个体 有效。在1992年，文献报告仅7例在PAM后被证实幸存(Gautam化，2012)且仅在从2岁到14岁 的非常年轻的受试者中和治疗和感染留下或多或少大量神经学滞后效应的受试者中。因此 存活率甚至低于埃博拉病毒感染。因此，监控和控制运种非寄生变形虫构成越来越重要的 当务之急。
[0003] 通常，众所周知福氏耐格里变形虫在环境中具有广泛分布(Madinez AJ，1997)， 因为运种变形虫已从上壤、河水和湖水(Jamerson M，2009)或工业废水和生物膜(Goudot 8,2012;5.4.!111*3,2005)中分离，其特征在于它与其他非寄生变形虫共处。若干可能致病的 细菌，包括嗜肺军团菌化egionella pneumophila)，具有在非寄生变形虫中生存和复制的 成熟机制化uang SW，2010;De化11日化日日的，2011)。此外，已表明核电站通过将河水再加热 若干度极大地促进了福氏耐格里变形虫的发育。事实上，福氏耐格里变形虫是嗜热性的，其 发育溫度范围为25°C到45°C(Visvesvara GS，2007)。
[0004] 邸F，其在法国运营超过11个核电站，它量化了与水中检测到的福氏耐格里变形虫 的水平有关的风险。为了对该风险有更好的理解，EDF的研究和调查部口 W及医学研究部口 计算了当游泳时死于PAM的风险作为水中福氏耐格里变形虫的浓度的函数。该风险可W用 下列方式分解：
[0005] 1次游泳的风险=当在水中游泳时吸入"η"个福氏耐格里变形虫的可能性，其中福 氏耐格里变形虫W浓度"c"(每次游泳吸入10ml的水)存在
[0006] 乘 W
[0007] 当已吸入"η"个福氏耐格里变形虫时的死亡概率(根据动物数据建模）。
[000引当选择正常对数模型时，其提供最低估计，且完美符合实际数据化SA，Australia， New Zealand),获得W下风险：
[0009] 游泳水中N. f.的量η的浓度风险
[0010] 1个福氏耐格里变形虫/升，风险= 10-8,即每1亿次游泳一次死亡
[0011] 10个福氏耐格里变形虫/升，风险= 1.45xl〇-7,即每7000000次游泳一次死亡 [001 ^ 100个福氏耐格里变形虫/升，风险=7.24x10-6，即每140000次游泳一次死亡
[0013] 1000个福氏耐格里变形虫/升，风险= 1.34xl〇-3,即每746次游泳一次死亡
[0014] 根据Conseil sup紅ieur d'hygigne publique de France(CSHPF)[法国公共卫 生高级委员会]的建议，超过100个福氏耐格里变形虫(N.f.)/升的极限值必须导致禁止游 泳(尤其参见2004年5 月4 日 CSHPF的意见，与2003年抓 F 在 Bugey、Chooz、Dampierre、Golfech 和Nogent的电力生产核电站（CNPE)上进行的使用单氯胺的抗变形虫处理的经验反馈有 关)。
[001引在本文中，完全意外地，发明人已经表明，变开多虫属Willae;rtia magna(W.m.)消除 非寄生福氏耐格里变形虫。运种杀生物作用通过已经证实的Willaedia magna对于其他细 菌性试剂例如细菌嗜肺军团菌、假单胞菌属(Pseudomonas)和李斯特氏菌属化isteria)的 捕食能力来支持。
【发明内容】
[0016] 因此本发明的主题首先是用于控制耐格里属和尤其是福氏耐格里变形虫的增殖 的方法，其使用Willaedia属原生动物，优选Willaertia magna。根据本发明的方法不包括 施加于人或动物体的治疗方法。在根据本发明的方法中，通常用Willaedia属原生动物，尤 其是Willa&rtia magna种处理气流或液流。然而，它也可W是固体表面。
[0017] 根据本发明的方法尤其用于消毒卫生用水或工业用水分配网络、工厂的冷却回路 例如核型或空调网络。它可W实施用于控制水管中、或可W与人或动物食品接触或不接触 的表面的生物膜的形成。
[0018] 可W将原生动物直接添加到待处理的管或网络中循环的水或液体中。也可W将它 们喷雾在待消毒的工业网络、烟画、工厂中，和在待消毒的工业表面上，例如W水溶液诸如 气溶胶的形式。
[0019] 有利地，用于本发明上下文中的原生动物对应于2006年8月21日W保藏号PTA 7824保藏于ATCC的菌株，或对应于2006年8月21日W保藏号PTA 7825保藏于ATCC的菌株，运 两种菌株^CENTRE NATIONAL DE LA REC肥RC肥 SCIENTIFIQ肥（CNRS)[French 化tional Center for Scientific Research]-3rue Michel Ange-75794PARIS CEDEX 16/France和 UNIV邸SITE LYON ICLAUDE 邸RNA畑[Lyon IClaude Bernard University]-43Boulevard du llNovembre 1918-69622VILLEURBAN肥 Cedex/化ance的名义保藏。
[0020] 对应于W保藏号PTA 7824保藏于ATCC的菌株，或对应于w保藏号PTA 7825保藏于 ATCC的菌株的属于Willaedia属的原生动物是本发明的组成部分。所述保藏的菌株也描述 于PCT国际申请W02008/043969的公布说明书中。
[0021] 因此运种原生动物可W用于消毒剂，尤其旨在消除福氏耐格里变形虫和控制福氏 耐格里变形虫的增殖和污染。
[0022] 此外，本发明的主题是包含Willaedia属原生动物，尤其是Willaedia magna的 消毒剂。对应于W保藏号PTA 7824保藏于ATCC的菌株，或对应于W保藏号PTA 7825保藏于 ATCC的菌株的原生动物将是优选的。有利地，根据本发明的消毒剂为例如在蒸馈水中的水 溶液或悬浮液的形式。消毒剂可W是可喷雾形式，例如气溶胶或任何其他的施用方式。
[0023] 发明人已经通过比较在Willaedia属，尤其是Willaedia magna存在和不存在的 情况下福氏耐格里变形虫的复制证实了Willaedia属原生动物，尤其是Willaedia ma即a 对福氏耐格里变形虫增殖的抑制活性。发明人还通过利用非寄生变形虫的另一个种-棘变 形虫（Acanthamoeba)作为不引起福氏耐格里变形虫生长抑制的对照菌株证实了通过 Willaertia magna属抑制运种福氏耐格里变形虫生长的独特性质。
[0024] 考虑到不存在福氏耐格里变形虫的治愈性或预防性治疗的情况下，福氏耐格里变 形虫对人的死亡率风险在小于一周内大于95%，本发明是控制运种变形虫攝疫的重要科学 进展，其对环境和人具有中性影响。事实上，EC条例No. 1271/2008目前承认，Willaertia magna菌株不在危险种类中，且没有提及任何危险或警告建议，运与目前使用的单氯胺不 同。
[00巧]此外，本发明设及根据本发明和/或Willaedia属原生动物，尤其是Willaedia magna的消毒剂，W及对应于W保藏号PTA 7824保藏于ATCC的菌株，或对应于W保藏号PTA 7825保藏于ATCC的菌株的原生动物作为耐格里属的杀生物剂的用途。
[0026] W下实施例可W阐明本发明，但决不限制本发明。
【具体实施方式】
[0027] 1.材料和方法
[0028] 1.1所使用的菌株
[0029] -变形虫:所使用的菌株属于Ξ个不同的变形虫种：
[0030] -福氏耐格里变形虫(ATCC 30809);
[0031] -卡氏棘变形虫（Acanthamoeba castellanii(ATCC 30010));
[0032] -Willaertia ma即a(W保藏号PTA 7824和PTA 7825保藏于ATCC的菌株）
[0033] 将运Ξ种菌株在10%胎牛血清存在下在SCGYEM培养基(血清酪蛋白葡萄糖酵母提 取物培养基)上无菌培养，W每管3ml的比例分配到GREI肥R?管。在维持中，每8-9天将营养 体型亚培养。对于共培养，使用3到4天的亚培养W便正好在指数生长期中具备营养体。
[0034] SCGYEM培养基按照如下获得：
[0035] 酪蛋白（MERCK, 1.02244.010)10g
[0036] Na抽P〇4 1.325邑
[0037] Κ出P〇4 0.8邑 [003引葡萄糖2.5g
[0039] 酵母提取物(DIFC0 0127-17-9)5g
[0040] 蒸馈水900ml
[0041] 胎牛血清100ml
[0042] 将2.5ml化0H( IN)、然后将化抽P化和K出？化添加到900ml蒸馈水中。在加热板上略 微加热后，在磁力揽拌下逐渐添加酪蛋白。酪蛋白溶解后，加入葡萄糖和酵母提取物。
[0043] 完全溶解后，将培养基在玻璃纤维（SART0RIUS SM 6513400)上、然后在化111膜 (WHATMAN 7190 004)上依次过滤。然后将培养基等分入玻璃瓶中。将瓶子在120°C下在高压 灭菌器中灭菌20分钟。在最终使用和分配培养基之前，在层流净化罩下W最终容积10%的 比例无菌添加胎牛血清。
[0044] 1.2.制备Willaedia magna和福氏耐格里变形虫的储备悬浮液：
[0045] 各初始变形虫悬浮液(储备悬浮液）的制备采用SCGYB1培养基中无菌培养的各变 形虫的4个烧瓶(T 175ml)来进行。在指数生长期结束时收获福氏耐格里变形虫、卡氏棘变 形虫和Willa&rtia magna的运些储备变形虫悬浮液，运通常在培养开始后4至化天获得。
[0046] 为了增加所收获的变形虫的浓度，将烧瓶通过冰浴5到10分钟，然后人工揽拌，W 尽可能多地收集变形虫。
[0047] 合并运4个烧瓶的内容物W对在TH0MA单元上获得的变形虫悬浮液计数（[C]/ml)。 [004引将变形虫悬浮液转移入50m] falcon*型管中W通过isoog离屯、10分钟来去除 SCGYEM培养基。用无菌蒸馈水洗涂两次来冲洗第一次离屯、产生的变形虫沉淀，并在1500g离 屯、10分钟。在2次洗涂结束时，将最终沉淀收集在40ml容积的无菌水中。
[0049] 1.3.阐明Willaedia magna对福氏耐格里变形虫（菌株ATCC 30809)的杀生物作 用
[0050] 在包含10ml无菌PAS^age的变形虫盐水)培养基的T 25ml烧瓶中进行变形虫共培 养。将变形虫共培养的烧瓶W预先在Malassez血细胞计数器上计数的无菌变形虫悬浮液的 1 X 105个Willaedia magna/ml和1 X 105个福氏耐格里变形虫/ml的比例接种。通过将福氏 耐格里变形虫/Willaertia magna之比固定为1来进行福氏耐格里变形虫对Willaedia magna的侵染。将T 25ml烧瓶在30°C的解育器中解育。
[0051 ] PAS培养基按如下获得：
[0化2]
[0化3]
[0054]用0.22皿过滤器无菌过滤溶液1和2。为了获得1升PAS培养基:添加5.0ml溶液1和 5.0ml溶液2,然后用无菌蒸馈水将容积调节至1升。
[0化日]将Willaedia magna和福氏耐格里变形虫对照变形虫单培养在T25ml烧瓶中在 10ml灭菌PAS培养基中单独培养。
[0化6] 从预先在Malassez血细胞计数器上计数的无菌变形虫悬浮液，对于Willaedia magna对照，将烧瓶X 105个Willaedia magna/ml的比例接种，对于福氏耐格里变形虫 对照，将烧瓶W1X105个福氏耐格里变形虫/ml的比例接种。将T 25ml烧瓶在30°C的解育器 中解育。
[0057]各条件进行Ξ次。Malassez单元上的各计数重复5次。实验在3个月时期内重复Ξ (3)次。
[005引共培养和对照烧瓶中福氏耐格里变形虫和Willaedia magna变形虫的命运W下 列方式测定：
[0059] 福氏耐格里变形虫侵扰后监控变形虫浓度120小时。在各时间间隔(在第3小时，然 后每24小时），将共培养和对照烧瓶取样并检查两种变形虫的细胞生长和其形态学和动态。 对于各检查的烧瓶：
[0060] -在Malassez单元上直接计数变形虫。
[0061] -在120小时，由于联合使用MPN(最大可能数量)方法，低水平的福氏耐格里变形虫 不再允许Malassez单元上的可靠计数。广泛用于计数变形虫的该方法具有更准确的优点、 而且能将完整且活的变形虫与完整但死的变形虫区分开来。
[006^ 2.结果
[0063] 图1、2和3显示了共培养(Willaertia magna/福氏耐格里变形虫)和对照单培养变 形虫的实验。
[0064] 它们显示了与单培养中变形虫的各群体的发展相比，初始的Willaedia/耐格里 属之比为1的共培养后，Willaertia magna和福氏耐格里变形虫的各群体的自发发展。
[0(?日]图4a和4b显示在Willaedia ma即a变形虫存在下，福氏耐格里变形虫随时间的生 理状态。图4a对应于与Willaedia magna共培养的福氏耐格里变形虫的快速生理学降解的 图像。图4b对应于阐明Wi 1 laedia magna对福氏耐格里变形虫的"死亡之吻"现象的图像。
[0066] 图5显示共培养(Willaertia magna/福氏耐格里变形虫）和对照单培养变形虫的 实验。
[0067] 在图1、2和3中，称为Willaedia magna的带有菱形点(U)的曲线描述了无菌PAS培 养基中单独的Willa&rtia magna的测量浓度。
[0068] 称为福氏耐格里变形虫的带有方形点(η)的曲线描述了无菌PAS培养基中单独的 福氏耐格里变形虫的测量浓度。
[0069] 称为W+NF的带有Ξ角形点（D)的曲线描述了无菌PAS培养基中与福氏耐格里变形 虫共培养的WillaeKia magna的测量浓度。
[0070] 称为NF+W的带有叉形点（X)的曲线描述了无菌PAS培养基中与Willaedia magna 共培养的福氏耐格里变形虫的测量浓度。
[0071] 数据W在Malassez单元上计数的每毫升(ml)完整细胞的浓度来表示。
[0072] 在图4a中，黑色箭头表示Willaedia magna的存在，白色箭头表示完整或破碎的 福氏耐格里变形虫的存在。
[0073] 在图4b中，黑色箭头表示Willaedia magna的存在，白色箭头表示福氏耐格里变 形虫的存在。白色圆体现福氏耐格里变形虫细胞的轮廓。该"死亡之吻"现象已经在文献中 (Berke G.Source Department of Cell Biology, 1995)描述为允许粒酶透过的接触，其导 致祀细胞的调亡。
[0074] 在图5中，由菱形点(U)组成的曲线代表卡氏棘变形虫的单培养。
[0075] 由Ξ角形点(D)组成的曲线A+NF代表与福氏耐格里变形虫共培养的卡氏棘变形虫 的浓度。
[0076] 由方形点(η)组成的曲线NF代表福氏耐格里变形虫的单培养。
[0077] 由叉形(X)组成的曲线NF+A代表与卡氏棘变形虫共培养的福氏耐格里变形虫的浓 度。
[007引 2.1 .Willaertia magna完全抑制福氏耐格里变形虫的生长
[0079] 如表示与Willaedia magna共培养的福氏耐格里变形虫的发展的图1、2和3的叉 形曲线所示，福氏耐格里变形虫群体曲线中在约24小时非常迅速地发生分离。运种福氏耐 格里变形虫群体的降低仅在Wi 1 laedia magna存在下观察到。实验1、2和3(图1、2和3)中单 培养的福氏耐格里变形虫的对照曲线（带有方形点的曲线)在24小时均正在生长。此外，单 培养福氏耐格里变形虫的水平在24小时几乎加倍。
[0080] 值得注意的是，显微镜观察早在24小时就证实了与Willaedia magna共培养的福 氏耐格里变形虫的形态变化（图4)。福氏耐格里变形虫细胞的生理状态从伸展的营养体形 式变为更圆的受应力形式，但与抱囊形式仍然不相似。福氏耐格里变形虫细胞的内部变得 不透明，掩盖内部空泡(变形虫生长的标记KWillaedia magna存在下福氏耐格里变形虫 细胞的尺寸早在共培养的3小时比单培养中的尺寸小一半（图4a) sWillaedia magna变形 虫的捕食方式基于吞隧作用。图4b表明了在最初24小时内类似于"死亡之吻"的抑制现象。 Willaertia magna对福氏耐格里变形虫的吞隧作用确实发生了，但仅在共培养25小时之后 通过在运些吞隧体中存在包含福氏耐格里变形虫的Willaedia magna来证实（数据未报 告)。
[0081] 进行的所有实验证实在120小时内完全消除福氏耐格里变形虫的最大抑制效果。 Malassez单元在120小时的读数计数了存在且完整的福氏耐格里变形虫细胞，但不可W采 用该计数区分死细胞和活细胞。NNA琼脂+大肠杆菌巧.coli)上的双倍读数可W计数仅来自 营养体形式和/或来自抱囊形式的福氏耐格里变形虫活细胞。
[0082] 下表显示通过Malassez单元上的读数获得的和采用MPN方法获得的变形虫（福氏 耐格里变形虫)的浓度。
[0083] 将在感染后120小时取样的来自Willaedia magna/福氏耐格里变形虫共培养的 实验1、2和3(图1-3)的各烧瓶的等分试样接种在覆盖有一层大肠杆菌的NNA琼脂上。
[0084] 各种类的浓度的测定通过计数每个皿中确定的前部数目（number of fronts)来 测量，并显示于MPN表中W从其中推断变形虫浓度。
[00化]Nf =福氏耐格里变形虫
[0086] W.m=Willae;rtia ma即a
[0087]
[0088] 该表证实了 NNA琼脂上不存在福氏耐格里变形虫前部，表明在120小时不存在活的 抱囊或营养体形式的福氏耐格里变形虫。
[0089] 发明人表明了Willae^ia magna对耐格里属和尤其是福氏耐格里变形虫种的杀 生物作用的不可预料的性质不与其他变形虫种共有。
[0090] 如图5所示，与单培养中测量的这些种的浓度相比，变形虫属卡氏棘变形虫和福氏 耐格里变形虫的共培养对两个种的各自浓度不造成任何影响。该图显示棘变形虫类型的另 一种变形虫属在这两种变形虫的共培养期间对福氏耐格里变形虫群体的发展不存在相互 作用。
[0091] 在具有抑制耐格里属，尤其是福氏耐格里变形虫种的生长的特征方面， Willaertia magna是相当独一无二的D
[0092] 文献
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【主权项】
1. 用于控制耐格里属变形虫，尤其是福氏耐格里变形虫的增殖的方法，施加于人或动 物体的治疗方法除外，其特征在于它使用Wi Ilaertia属原生动物。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于用Wi Ilaertia属原生动物，尤其是 Wi I laertia magna处理气流或液流或固体表面。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于这些原生动物有利地对应于以保藏号 PTA 7824保藏于ATCC的菌株，或对应于以保藏号PTA 7825保藏于ATCC的菌株。4. 根据权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于实施该方法以用于消毒卫生用水 或工业用水分配网络、工业或核电站的冷却回路或空调网络。5. 根据权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于实施该方法以用于控制水管中、 或可以与人或动物食品接触或不接触的表面的生物膜的形成。6. 一种消毒剂，其包含原生动物WiIIaertia属，尤其是WiIlaertia magna种。7. 根据前述权利要求所述的消毒剂，其特征在于所述原生动物对应于以保藏号PTA 7824保藏于ATCC的菌株，或对应于以保藏号PTA 7825保藏于ATCC的菌株。8. 根据权利要求6或7所述的消毒剂，其特征在于其为水溶液或悬浮液形式。9. 属于Willaertia属的原生动物，其对应于以保藏号PTA 7824保藏于ATCC的菌株，或 对应于以保藏号PTA 7825保藏于ATCC的菌株。10. 根据权利要求6至8任一项所定义的消毒剂或根据权利要求9所定义的原生动物作 为耐格里属的杀生物剂的用途。
【文档编号】A01N63/00GK105899078SQ201480058425
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年10月22日
【发明人】F·普拉松, M·O·马梅里
【申请人】阿莫巴