一种火龙果花药诱导胚性愈伤组织的方法
【专利摘要】本发明公开了一种火龙果花药诱导胚性愈伤组织的方法，该方法以火龙果花蕾为试材，采集蕾期为9?11d的火龙果花蕾放在冰箱中冷藏处理；用水冲洗冷藏后的花蕾，转入超净工作台，用酒精消毒，再用升汞浸泡，再用无菌水冲洗，然后放在灭菌滤纸上吸干表面水份；处理完成后，用手术刀剥开花蕾上的鳞片，纵向切开花蕾，切除花丝，取出花药放在愈伤组织诱导培养基中暗培养；最后将获得的愈伤组织转入增殖培养基中增殖。通过本发明的方法获得的花药愈伤组织再分化力强，可为火龙果新品种选育及遗传转化提供新的途径。
【专利说明】
一种火龙果花药诱导胚性愈伤组织的方法
技术领域
[0001]本发明涉及火龙果栽培技术领域，特别是涉及一种火龙果花药诱导胚性愈伤组织的方法。
【背景技术】
[0002]火龙果为仙人掌科多年生攀援性肉茎植物，原产中美洲，是热带、亚热带的名优水果之一。火龙果花较大，长度可达45CM，单花重达600-800g，在组织培养中，大部分火龙果的组织培养方法，都是利用火龙果的成熟茎段，如申请号为200910311410.7的中国发明专利申请公开文献公开了一种火龙果的组织培养方法，火龙果的成熟茎段经消毒处理，接种在MS+多效唑0.1?1.5mg/L腋芽诱导培养基上，将获得的腋芽切下转入MS+6-BA1.0?6.0mg/L+矮壮素0.1?1.5mg/L培养基上增殖，42%试管苗同步生根，直接用于移栽。然而目前本领域中尚未见相关利用花药进行火龙果组织培养的报道。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于为解决利用火龙果花药进行火龙果组织培养的技术问题，提供一种火龙果花药诱导胚性愈伤组织的方法。
[0004]本发明是这样实现的:
首先，本发明是这样一种火龙果花药诱导胚性愈伤组织的方法，它包括以下步骤:
1)以火龙果花蕾为试材，采集蕾期为9-1Id的火龙果花蕾放在冰箱中冷藏处理；
2)用水冲洗步骤I)中冷藏后的花蕾，转入超净工作台，用酒精消毒，再用升汞浸泡，再用无菌水冲洗，然后放在灭菌滤纸上吸干表面水份；
3)在步骤2)处理完成后，用手术刀剥开花蕾上的鳞片，纵向切开花蕾，切除花丝，取出花药放在愈伤组织诱导培养基中暗培养；
4)将步骤3)中获得的愈伤组织转入增殖培养基中增殖。
[0005]其中，步骤3)中的愈伤组织诱导培养基为MS+6-BA 2.0 mg/L +2,4-D 0.5?1.0mg/L + 蔗糖 70g/L + 琼脂粉 7.5g/L。
[0006]步骤4)中采用的增殖培养基为MS+TDZ 0.4 mg/L +KT 0.8?1.0mg/L +蔗糖30g/L+琼脂粉7.5g/L。
[0007]步骤I)中花蕾冷藏时间为24h。
[0008]步骤2)中水冲洗时间至少2h，酒精消毒时间至少20s，升汞浸泡时间至少8min，无菌水冲洗五次以上。
[0009 ]步骤3 )中花药放在愈伤组织诱导培养基中暗培养时间为18-25d。
[0010]本发明通过以下技术方案实现其目的:
本发明的有益效果:本发明是在离体条件下进行火龙果胚性愈伤组织的诱导和增殖。在本领域中，通过枝条或茎段获得的愈伤组织分化力弱，而通过本发明的方法获得的花药愈伤组织再分化力强，可为火龙果新品种选育及遗传转化提供新的途径。
【具体实施方式】
[0011]为了加深对本发明理解，下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，该实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。在本发明基础上作出的修改或改进，若对本领域技术人员是显而易见的，则属于本发明要求保护的范围。以下内容中如涉及数量或比例，如无特别说明，均表示质量单位或质量比例。
[0012]实施例1:
该火龙果花药诱导胚性愈伤组织的方法，以火龙果的花药(处于小孢子处于单核靠边期)为试材，通过适宜的采样时间，预处理、消毒及接种方法，适宜的培养基，获得了火龙果愈伤组织。
[0013]1、外植体表面灭菌:
以火龙果“紫红龙”花蕾为材料，用少量洗洁精水将其表面脏物洗净后，流水冲洗I h。于超净工作台上用75%的酒精和0.1%的升汞分别处理不同时间。花蕾酒精消毒时间设10、20和30 s三个水平，升汞消毒时间设定为6、8、10和12 min四个水平，完全组合设计，共12个处理。消毒完成后，用无菌水冲洗5次，将外植体表面水分吸干，用手术刀将花蕾纵切，取出花药，切掉花丝，接种在相同培养基上。每处理接种30个花药，3次重复，30 d统计污染率、褐化率及成活率。
[0014]2、低温预处理:
以火龙果花蕾为材料，采样带回后放在4°C冰箱中分别预处理24h，48h和72h，以不预处理为对照。表面灭菌方法以I筛选出的方法，分批取出花药接种在相同培养基上，30 d统计污染率、褐化率、成活率及出愈率。
[0015]3、花蕾不同发育期比较:
取不同发育期(花蕾发育5d，7d，9d，lid, 13d)的火龙果“紫红龙”花蕾，用少量洗洁精水将其表面脏物洗净，流水冲洗I h后，表面灭菌以I筛选出的方法进行。设5个处理，花药接种方法、接种培养基、统计方法均同2。再通过倒置显微镱观察筛选出的发育期的小孢子是否处于单核靠边期，进行验证。
[0016]4、不同取样时间的影响:
以紫红龙为试材，分别在7，8，9，10，11月分五次取样。取样以3筛选出的发育期为准，表面灭菌以I筛选出的方法进行，花药接种方法、接种培养基、统计方法均同2。
[0017]5、花药愈伤组织诱导培养基筛选:
以紫红龙花蕾，接种在MS附加不同浓度的6-BA (1.0、2.(^P3.0mg/L)、2，4-D (0.1、
0.5和1.0 mg/L)和蔗糖(30、50和70g/L)完全组合设计，试验共计9个处理，每处理接种30个花药，3次重复，观察并记录愈伤组织的诱导情况及愈伤组织的质量，统计愈伤组织的诱导率。
[0018]6、愈伤组织的继代与增殖:
将初代培养诱导出来的愈伤组织切割成约0.5cm X 0.5cm大小，接种到愈伤组织增殖培养基中。生长调节剂TDZ浓度(0.2 mg/L、0.4 mg/L及0.6mg/L)，KT(0.6 mg/L、0.8 mg/L及1.0 mg/L)完全组合设计，共计9个处理。每处理接种20个外植体，重复3次，30 d转瓶I次。观察并记录愈伤组织的生长状态，60 d统计愈伤组织增殖系数。
[0019]当然，以上只是本发明的具体应用范例，本发明还有其他的实施方式，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明所要求的保护范围之内。
【主权项】
1.一种火龙果花药诱导胚性愈伤组织的方法，其特征在于包括以下步骤: 1)以火龙果花蕾为试材，采集蕾期为9-1Id的火龙果花蕾放在冰箱中冷藏处理； 2)用水冲洗步骤I)中冷藏后的花蕾，转入超净工作台，用酒精消毒，再用升汞浸泡，再用无菌水冲洗，然后放在灭菌滤纸上吸干表面水份； 3)在步骤2)处理完成后，用手术刀剥开花蕾上的鳞片，纵向切开花蕾，切除花丝，取出花药放在愈伤组织诱导培养基中暗培养； 4 )将步骤3 )中获得的愈伤组织转入增殖培养基中增殖。2.根据权利要求1所述的火龙果花药诱导胚性愈伤组织的方法，其特征在于:步骤3)中的愈伤组织诱导培养基为MS+6-BA 2.0 mg/L +2,4-D 0.5?1.0 mg/L +蔗糖70g/L +琼脂粉7.5g/L。3.根据权利要求1所述的火龙果花药诱导胚性愈伤组织的方法，其特征在于:步骤4)中采用的增殖培养基为MS+TDZ 0.4 mg/L +KT 0.8?1.0mg/L +蔗糖30g/L+琼脂粉7.5g/L。4.根据权利要求1所述的火龙果花药诱导胚性愈伤组织的方法，其特征在于:步骤I)中花蕾冷藏时间为24h。5.根据权利要求1所述的火龙果花药诱导胚性愈伤组织的方法，其特征在于:步骤2)中水冲洗时间至少2h，酒精消毒时间至少20s，升汞浸泡时间至少8min，无菌水冲洗五次以上。6.根据权利要求1所述的火龙果花药诱导胚性愈伤组织的方法，其特征在于:步骤3)中花药放在愈伤组织诱导培养基中暗培养时间为18-25d。
【文档编号】A01H4/00GK105900835SQ201610232271
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年4月14日
【发明人】范建新, 邓仁菊, 王永清, 刘红, 刘荣
【申请人】贵州省亚热带作物研究所