绳状青霉在防治马铃薯黑痣病的应用

文档序号:10541700阅读:492来源:国知局
绳状青霉在防治马铃薯黑痣病的应用
【专利摘要】本发明涉及治疗马铃薯黑痣病的生防菌剂技术领域,具体的,本发明提供绳状青霉在制备用于治疗或预防马铃薯黑痣病的药物中的应用。本发明绳状青霉在防治马铃薯黑痣病上效果显著,解决了传统防治马铃薯黑痣病的缺点,同时,本发明采用的菌种分布广泛、容易获得,适于大规模推广。
【专利说明】
绳状青霉在防治马铃薯黑痣病的应用
技术领域:
[0001] 本发明涉及治疗马铃薯黑痣病的生防菌剂技术领域,特别涉及绳状青霉在制备治 疗或预防马铃薯黑痣病的药物中的应用。
【背景技术】:
[0002] 马铃薯黑癒病(Rhizoctonia solani),其病原菌为立枯丝核菌,故此又称立枯丝 核菌病、茎基腐病、丝核菌溃疡病、黑色粗皮病,是以带病种薯和土壤传播的病害。立枯丝核 菌分布广泛,适应能力强,生长速度快,对于马铃薯生长危害非常大。在带病土壤中生长的 马铃薯一旦受到病菌侵染,其根和茎则受到危害,进而影响马铃薯块,带病薯块明显小于健 康薯块,这给作物正常生长以及农民经济收入带来较大损失。其病原菌可以早于发病症状 出现之前侵染且潜伏于植物或者土壤中,当病症出现之时,有些作物已经到了病入膏肓的 地步,这给病害的早期控制带来了很大的困难。
[0003] 目前对于病原真菌控制的方法主要采用加强田间管理、培育抗病品种、使用化学 药剂和施用生防菌剂等。但在实践中发现,单靠田间管理很难达到效果,抗病品种的选育需 要时间较长,而化学方法会加速土壤中微生物群落演替,在连续多年使用同一种类农药杀 菌剂后,大量对杀菌剂敏感的微生物群体被杀死而减少,另一些不敏感或已产生抗性的群 体得以繁衍,致使土壤微生物群落迅速更迭,群落结构发生改变,演替加速,使土壤微生物 群落结构发生变化,对土壤肥力产生影响。而生物防治通过在微生物有机肥料中加入病原 菌的拮抗菌,在不污染环境的情况下,对真菌病害引起的疾病得到有效控制,调节土壤微生 态环境趋于平衡。
[0004] 近年来采用拮抗菌及其代谢产物来防治病原微生物越来越多的受到重视,并且已 经成为防治植物病害的重要途径,迄今为止已报道立枯丝核茵的生防真菌有多种,最重要 的是木霉属真菌(T.richoderma),如哈茨木霉(T.harzianum)、康宁木霉(T.kobningii)等。
[0005] 绳状青霉(Penicillium funiculosum),结构:CYA培养基上25°C培养7天后菌落直 径为37~42mm;质地绳状,中央有絮状;分生孢子结构大量产生,分生孢子面灰绿色、尼加拉 河绿色或豆绿色,菌丝体白色,气生型菌丝;无渗出液或少量渗出液,反面黄色,有环带,无 皱纹产生。帚状枝通常双轮生,少量三轮生;孢梗茎顶端不膨大,壁平滑,2.8-3.2 X 50-120μ m;梗基顶端不膨大,每轮5~6个,彼此紧贴,近于平行,2.5-3.0Χ8-12μπι;瓶梗瓶状至披针 形,每轮通常4~6个或更多,1.8-22 X 8.0-11. Ομπι;分生孢子椭圆形,2.5-3.0 X 3.5-4. Ομπι, 分生孢子链疏松不规则。绳状青霉来源广泛,土壤、霉树叶、腐木、霉肉、霉档案、霉中药等多 种腐霉物上都可发现其踪迹。目前青霉菌用于提取青霉素、灰黄霉素等,但是还未有关于青 霉菌作为马铃薯黑痣病生防菌的报道。

【发明内容】

[0006] 因此,本发明旨在筛选出具有高拮抗作用的青霉菌来防治马铃薯黑痣病。
[0007] 具体的,本发明提供绳状青霉在制备用于治疗或预防马铃薯黑痣病的药物中的应 用。
[0008] 优选的,绳状青霉是单独的应用或联合的应用。
[0009] 优选的,将接于马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上经活化的绳状青霉打成菌饼,之 后接于roA液体培养基中,震荡3d,将发酵液离心,过滤,得到绳状青霉菌株的菌株发酵液, 将绳状青霉菌株的菌株发酵液施于种有马铃薯种薯的土壤中。
[0010] 优选的,菌株发酵液在ΡΗ=2·8~3.2的HC1下处理50~70min。
[0011]优选的,菌株发酵液按照lOOmlPDA液体培养基加一皿绳状青霉菌饼配置。
[0012]优选的,施用菌株发酵液选在马铃薯种薯出苗后。
[0013]优选的,菌株发酵液在马铃薯种薯出苗后施用不少于2次,间隔时间为24~30d。
[0014] 本发明绳状青霉在防治马铃薯黑痣病上效果显著,解决了传统防治马铃薯黑痣病 的缺点,同时,本发明采用的菌种分布广泛、容易获得,适于大规模推广。
【附图说明】:
[0015] 附图1是拮抗菌绳状青霉对峙培养第5天的显微图片。
[0016]附图2是拮抗菌绳状青霉对峙培养第6天的显微图片。
[0017]附图3是拮抗菌绳状青霉对峙培养第7天的显微图片。
[0018]附图4是马铃薯黑痣病菌正常培养第7天的显微图片。
[0019]附图5是拮抗菌绳状青霉对峙培养第8天的显微图片。
[0020]附图6是拮抗菌绳状青霉对峙培养第9天的显微图片。
[0021]附图7是拮抗菌绳状青霉对峙培养第10天的显微图片。
[0022]附图8是马铃薯黑痣病菌正常培养第10天的显微图片。
[0023] 附图9是盆栽试验对照组后期生长照片。
[0024] 附图10是盆栽试验对照组中期生长照片。
[0025]附图11是盆栽试验处理1组后期生长照片。
[0026]附图12是盆栽试验处理1组中期生长照片。
[0027]附图13是盆栽试验处理2组后期生长照片。
[0028]附图14是盆栽试验处理2组中期生长照片。
[0029]附图15是盆栽试验对照组与处理组薯块比较照片。
[0030]附图16是盆栽试验处理1组与处理2组薯块比较照片。
[0031]附图17是盆栽试验对照组与处理2组薯块比较照片。
[0032]附图18是盆栽试验对照组与处理1组薯块比较照片。
【具体实施方式】:
[0033] 1.拮抗青霉菌P19抑菌机理研究
[0034]通过平板对峙法筛选出对马铃薯黑痣病菌防治效最好的拮抗菌绳状青霉,并对绳 状青霉进行抑菌机理的研究。挑取平板对峙培养抑菌带上的菌丝或者初期绳状青霉与马铃 薯黑痣病菌刚接触时的菌丝,制作临时玻片在显微镜下观察并拍照。
[0035]附图1~8分别是5~10天马铃薯黑痣病菌在拮抗菌绳状青霉作用下的显微形态 图,总体可以看出,拮抗菌绳状青霉对马铃薯黑痣病菌确实具有抑制作用。马铃薯黑痣病菌 和拮抗菌绳状青霉在对峙培养第5天时开始接触并相互作用,在绳状青霉作用下马铃薯黑 痣病菌第5天的菌丝形态图(附图1),其菌丝已开始发生变化,菌丝壁出现弯曲,原生质体凝 结,颜色加深;第6天对峙培养的显微形态图(附图2),跟第5天相比,马铃薯黑痣病菌菌丝开 始发生显著变化,原生质体开始溶解,菌丝发生畸形;第7天(附图3),马铃薯黑痣病菌在绳 状青霉作用下,其菌丝畸形更加严重,跟第7天正常情况下(附图4)马铃薯黑痣病菌的显微 形态相比,菌丝整体变粗、膨大,原生质体不均匀,而正常情况下的菌丝则光滑,透明,原生 质体均匀,呈直角分支,分支处有缢缩;第8、9天(附图5、附图6)的菌丝形态跟第7天相比更 加畸形,并且侵入的拮抗菌绳状青霉菌丝逐渐增多,到第10天(附图7),已见马铃薯黑痣病 菌菌丝大部分被溶解,跟正常情况下第10天(附图8)马铃薯黑痣病菌相比,其菌丝生长混 乱,呈现明显的无序状态。出现上述情况的原因可能是拮抗菌绳状青霉的生长对马铃薯黑 痣病菌造成了空间和营养上的竞争,使其生长受到限制,也可能是绳状青霉所含有的抗菌 物质破坏了马铃薯黑痣病菌的细胞壁,进而溶解了菌丝内的原生质体,从而达到抑制马铃 薯黑痣病菌生长的目的。
[0036] 2.拮抗绳状青霉菌菌株发酵液(以下简称菌株发酵液)的制备
[0037] 将接于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)平板上经活化的绳状青霉用直径为5mm的 打菌器打成菌饼,接于l〇〇ml的PDA液体培养基中,在摇床上震荡3d,将发酵液在高速离心机 800/min下离心15min,后用微孔滤膜过滤,得到青霉菌菌株的菌株发酵液。
[0038] 2.1.菌株发酵液对温度的稳定性
[0039] 将菌株的浓缩发酵液分别在20°(:、30°(:、40°(:、50°(:、60°(:条件下处理101^11、 20min、30min后,吸取5μ1浓缩发酵液用牛津杯法做与马铃薯黑痣病菌的对峙实验,每个温 度梯度重复3次,根据其生长的情况来测定菌株发酵液对温度的稳定性。结果如表1所示:
[0040] 表1:不同温度处理对菌株发酵液的影响
[0041]
[0042] 表1显示菌株发酵液在试验各温度梯度处理不同时间后与马铃薯黑痣病菌做对峙 培养的生长情况,可以看出,在所有温度梯度的不同时间处理下,拮抗活性最好的处理是20 °C : lOmin,在20°C~40°C的处理温度下,其拮抗活性的变化没有明显的规律,当温度升高到 50°C时,菌株发酵液的拮抗活性随温度的升高和处理时间的增长而呈下降趋势,即当温度 升高到50°C,菌株发酵液的抑菌活性开始下降,并且随着处理时间的增长,下降的幅度越 大,但当温度升高到60°C时,即抑制了菌株发酵液的生长。因此可以知道马铃薯黑痣病菌拮 抗菌绳状青霉的抑菌活性物质在40°C以下具有相对稳定性,对高温不具有耐受力。
[0043] 2.2.菌株发酵液对PH的稳定性
[0044] 分别配制lmol/L的HCL和lmol/L的NaOH,用该酸和碱将菌株发酵液的PH值分别调 到3、5、7、9、11后,分别放置lh、2h、3h,后再将菌株发酵液调回到原始酸磁度,吸取菌株发酵 液5μ1用牛津杯法做与马铃薯黑痣病菌的对峙实验,每个梯度重复3次,根据菌株的生长情 况来测定菌株发酵液对酸碱的稳定性。结果如表2所示:
[0045] 表2:不同ΡΗ处理对Ρ19菌株发酵液的影响
[0046] Table3 Effect of different PH treatment on the stability of P19 fermentation broth
[0047]
[0048] 表2显示菌株发酵液在不同PH下处理不同时间后与马铃薯黑痣病菌做对峙实验的 生长情况,可知在所有的处理中,PH = 3处理2h时菌株发酵液具有最高活性,表现为马铃薯 生长趋势最好,对马铃薯黑痣病菌的抑制效果最强,PH = 9处理lh抑制效果次之;而抑菌活 性最弱的处理是PH=7处理2h,表现为马铃薯生长趋势最弱;其他的不同PH值下的处理之间 和相同PH不同时间的处理之间均无显著差异。由此可见马铃薯黑痣病菌拮抗菌绳状青霉的 抑菌物质在酸性和碱性条件下均能发生抑菌作用,而在中性条件下抑菌活性最低,即中性 条件下会抑制该菌株发酵液的抑菌活性。
[0049] 3.盆栽试验:马铃薯种薯经表面消毒后,一株移入装有健康土壤的盆中,一株移入 加有马铃薯黑痣病菌菌液的盆中,一株移入既有马铃薯黑痣病菌菌液,又有菌株发酵液的 盆中生长。盆栽试验在温室大棚进行。
[0050] 本试验设置两个处理组一个对照组,对照组(装有健康营养土的盆)和处理1组(加 马铃薯黑痣病菌菌液的盆)均设置一盆,而处理2组(既有马铃薯黑痣病菌菌液又有菌株发 酵液)设置三个重复。
[0051 ]实施结果:
[0052]附图9~14是盆栽实验的效果对比图。图中对照组和处理组在中期和后期的叶片 显示有较大差距。其中中期对照组(附图10)叶片生长茂盛,呈现正常绿色;处理1组中期(附 图12)则叶片明显卷曲,颜色稍浅,而处理2组中期(附图14)虽叶片较黄且植株较矮,但整体 长势好于处理1组中期,叶片生长茂盛。
[0053]叶片生长后期对照组和处理组之间对比更加明显,其对照组(附图9)生长更加茂 盛,叶片较多,绿色加深;处理1组后期(附图11)整体发黄,卷曲,边缘呈现干枯或焦黄,茎干 不能直立生长,较对照组更细;处理2组后期(附图13)植株卧倒,茎干较处理1组粗,叶片较 对照组和处理1组小,但是长势明显好于处理1组。
[0054]附图15~18是对照组和各处理组收获后薯块间的对比图,整体看来薯块间对比较 明显,对照组薯块明显大于各处理组(附图15、附图17、附图18),而处理2组的薯块稍大于处 理1组的薯块(附图16),且处理2组的薯块无黑色病斑或较少病斑出现。
【主权项】
1. 绳状青霉在制备用于治疗或预防马铃薯黑痣病的药物中的应用。2. 如权利要求1所述的应用,其特征在于:绳状青霉是单独的应用或联合的应用。3. 如权利要求1或权利要求2所述的应用,其特征在于:将接于马铃薯葡萄糖琼脂培养 基平板上经活化的绳状青霉打成菌饼,之后接于HM液体培养基中,震荡3d,将发酵液离心, 过滤,得到绳状青霉菌株的菌株发酵液,将绳状青霉菌株的菌株发酵液施于种有马铃薯种 薯的土壤中。4. 如权利要求3所述的应用,其特征在于:菌株发酵液在PH = 2.8~3.2的HCl下处理50 ~70min〇5. 如权利要求4所述的应用,其特征在于:菌株发酵液按照100mLPDA液体培养基加一皿 绳状青霉菌饼配置。6. 如权利要求5所述的应用,其特征在于:施用菌株发酵液选在马铃薯种薯出苗后。7. 如权利要求6所述的应用,其特征在于:菌株发酵液在马铃薯种薯出苗后施用不少于 2次,间隔时间为24~30d。
【文档编号】A01G7/06GK105901016SQ201610308759
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月3日
【发明人】沈瑞清, 安婧婧, 郭成瑾, 王喜刚, 张丽荣, 张萍, 刘浩, 张华普, 陈宏亮
【申请人】宁夏农林科学院
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