一种提高植物辐射诱变育种目标性状定向筛选效率的方法
【专利摘要】本发明公开了一种提高植物辐射诱变育种目标性状定向筛选效率的方法，包括如下步骤，对植物种子进行辐射诱变处理得到M0代种子；M0代种子进行多本粗插种植仅混收主穗种子得到M1代，M1代自交结实获得M2代种子；M2代种子在室内进行发苗培养，待幼苗生长到两叶一心时，分别提取每个单株的基因组DNA。利用辐射诱变能加快生物体基因组变异率的特点，在苗期运用分子生物学技术从辐射诱变群体中定向筛选目标性状突变体，减少了耗费在基因无变异或变异不符合所需目标性状导致突变中的工作量，并提高了对目标性状突变体筛选的准确率。
【专利说明】
-种提高植物福射诱变育种目标性状定向筛选效率的方法
技术领域
[0001] 本发明设及一种植物筛选方法，具体设及一种提高植物福射诱变育种目标性状定 向筛选效率的方法。
【背景技术】
[0002] 农作物福射诱变育种在确保世界粮食安全和增加营养供给方面具有重要的作用。 根据联合国FA0/IAEA突变品种数据库最新统计，截止到2013年9月底，有60多个国家在214 个植物种类上育成并通过商业注册的植物突变品种总数已达3218个，其中直接或间接利用 诱发突变体培育成的新品种在世界主要作物小麦、大麦和水稻分别为274、312、824个，占整 个诱变育成突变品种数的将近50%。在长期的自然环境条件下，生物体自身与外界环境相 互作用，为了适应环境的改变，其体内的遗传物质会发生一定的自发突变，然而频率很低， 约为10-5~10-8次。而利用核诱发突变技术诱发植物基因组产生突变或引起染色体崎变及 结构变异，提高诱发突变频率，从而能创造出新的性状、类型，丰富种质资源库和拓宽生物 遗传多样性，还能诱导产生自然界稀缺或用常规育种方法难W获得的新基因类型，为新品 种的选育提供丰富的原始材料。植物种质资源缺乏成为制约植物育种的瓶颈，福射诱变技 术已成为创制植物种质资源的有效途径，由于福射诱变的随机性，如何提高诱变频率，进行 所需目标性状的快速、高效的筛选成为育种者最为关注的问题。
【发明内容】
[0003] 鉴于W上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种提高植物福射诱变育 种目标性状定向筛选效率的方法，W克服现有技术中育种速度慢、育种效率不高的缺陷。
[0004] 为了达到上述发明目的及其他目的，本发明是通过W下技术方案实现的：
[0005] -种提高植物福射诱变育种目标性状定向筛选效率的方法，包括如下步骤：
[0006] 1)对植物种子进行福射诱变处理得到Μ0代种子；
[0007] 2)Μ0代种子进行多本粗插种植仅混收主穗种子得到Ml代，Ml代自交结实获得M2代 种子；
[000引3)M2代种子在室内进行发苗培养，待幼苗生长到两叶一屯、时，分别提取每个单株 的基因组DNA;
[0009] 4)确定育种目标性状，在Gene ba址数据库中查找目标性状基因的CDNA序列；
[0010] 5)根据目标性状基因的CDNA序列通过Primer Premier软件进行分子引物的设计； [OOW 6)用优化了的分子引物，经PCR过程，对M2代单株的基因组DNA进行扩增；
[0012] 7)扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，与DNA MA服比较，检测扩增产物的分子量大小 是否与目标性状基因 CDNA序列分子量大小一致；
[OOU] 8)切胶回收进行基因组测序，与目标性状基因 CDNA序列比对；
[0014] 9)具有与目标性状基因 CDNA序列差异的M2代单株，再进一步进行表型鉴定；
[0015] 10)严格自交繁殖后代，最终选出遗传稳定，目标性状符合育种要求的单株。
[0016] 优选地，所述植物种子为水稻种子。
[0017] 优选地，所述水稻种子在福射诱变处理前进行浸泡处理至露白，浸泡时间为不低 于 24h。
[001引优选地，所述福射诱变源为6化0- 丫射线。
[0019] 优选地，福射诱变中诱变剂剂量为150~250Gy，剂量率为1.0~2. OGy/Min。
[0020] 优选地，所述目标性状为儒低积累。
[0021] 本发明利用福射诱变能加快生物体基因组变异率的特点，在苗期运用分子生物学 技术从福射诱变群体中定向筛选目标性状突变体，减少了耗费在基因无变异或变异不符合 所需目标性状导致突变中的工作量，并提高了对目标性状突变体筛选的准确率。
【附图说明】
[0022] 图1为突变体HN186-M2-780与野生型0SNRAMP5基因 CDNA序列比对结果；
[0023] 图2为突变体HN186-M2-4711与野生型0SNRAMP5基因 CDNA序列比对结果；
[0024] 图3为M0代6化〇- 丫射线诱变处理效果；
[0025] 图4为技术流程图。
【具体实施方式】
[0026] W下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书 所掲露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可W通过另外不同的具体实 施方式加 W实施或应用，本说明书中的各项细节也可W基于不同观点与应用，在没有背离 本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0027] 实施例1
[00%] -种提高植物福射诱变育种目标性状定向筛选效率的方法，包括如下步骤：
[0029] 1)对植物种子进行福射诱变处理得到M0代种子；
[0030] 2)M0代种子进行多本粗插种植仅混收主穗种子得到Ml代，Ml代严格自交结实获得 M2代种子；
[0031] 3)M2代种子在室内进行发苗培养，待幼苗生长到两叶一屯、时，分别提取每个单株 的基因组DNA;
[0032] 4)确定育种目标性状，在Gene ba址数据库中查找目标性状基因的CDNA序列；
[0033] 5)根据目标性状基因的CDNA序列通过Primer Premier软件进行分子引物的设计；
[0034] 6)用优化了的分子引物，经PCR过程，对M2代单株的基因组DNA进行扩增；
[0035] 7)扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，与DNA MA服比较，检测扩增产物的分子量大小 是否与目标性状基因 CDNA序列分子量大小一致；
[0036] 8)切胶回收进行基因组测序，与目标性状基因 CDNA序列比对；
[0037] 9)具有与目标性状基因 CDNA序列差异的M2代单株，再进一步进行表型鉴定；
[0038] 10)严格自交繁殖后代，最终选出遗传稳定，目标性状符合育种要求的单株。
[0039] 具体地，所述植物种子为水稻种子。
[0040] 具体地，所述水稻种子在福射诱变处理前进行浸泡处理至露白，浸泡时间为2地。 [0041 ]具体地，所述福射诱变源为6化〇- 丫射线。
[0042] 具体地，福射诱变中诱变剂剂量为250Gy，剂量率为2. OGy/Min。
[0043] 实施例2
[0044] -种提高植物福射诱变育种目标性状定向筛选效率的方法，包括如下步骤：
[0045] 1)对植物种子进行福射诱变处理得到M0代种子；
[0046] 2)M0代种子进行多本粗插种植仅混收主穗种子得到Ml代，Ml代严格自交结实获得 M2；
[0047] 3)M2代种子在室内进行发苗培养，待幼苗生长到两叶一屯、时，分别提取每个单株 的基因组DNA;
[004引4)确定育种目标性状，在Gene ba址数据库中查找目标性状基因的CDNA序列；
[0049] 5)根据目标性状基因的CDNA序列通过Primer Premier软件进行分子引物的设计；
[0050] 6)用优化了的分子引物，经PCR过程，对M2代单株的基因组DNA进行扩增；
[0051] 7)扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，与DNA MA服比较，检测扩增产物的分子量大小 是否与目标性状基因 CDNA序列分子量大小一致；
[0052] 8)切胶回收进行基因组测序，与目标性状基因 CDNA序列比对；
[0053] 9)具有与目标性状基因 CDNA序列差异的M2代单株，再进一步进行表型鉴定；
[0054] 10)严格自交繁殖后代，最终选出遗传稳定，目标性状符合育种要求的单株。
[0055] 具体地，所述植物种子为水稻种子。
[0056] 具体地，所述水稻种子在福射诱变处理前进行浸泡处理至露白，浸泡时间为不低 于 30h。
[0057] 具体地，所述福射诱变源为SDCo- 丫射线。
[005引具体地，福射诱变中诱变剂剂量为200Gy，剂量率为1 .OGy/Min。
[0化9]实施例3
[0060] -种提高植物福射诱变育种目标性状定向筛选效率的方法，包括如下步骤：
[0061] 1)对植物种子进行福射诱变处理得到M0代种子；
[0062] 2)M0代种子进行多本粗插种植仅混收主穗种子得到Ml代，Ml代严格自交结实获得 M2；
[0063] 3)M2代种子在室内进行发苗培养，待幼苗生长到两叶一屯、时，分别提取每个单株 的基因组DNA;
[0064] 4)确定育种目标性状基因，在Gene ba址数据库中查找目标性状基因的CDNA序列；
[0065] 5)根据目标性状基因的CDNA序列通过Primer Premier软件进行分子引物的设计；
[0066] 6)用优化了的分子引物，经PCR过程，对M2代单株的基因组DNA进行扩增；
[0067] 7)扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，与DNA MA服比较，检测扩增产物的分子量大小 是否与目标性状基因 CDNA序列分子量大小一致；
[006引 8)切胶回收进行基因组测序，与目标性状基因 CDNA序列比对；
[0069] 9)具有与目标性状基因 CDNA序列差异的M2代单株，再进一步进行表型鉴定；
[0070] 10)严格自交繁殖后代，最终选出遗传稳定，目标性状符合育种要求的单株。
[0071 ]具体地，所述植物种子为水稻种子。
[0072]具体地，所述水稻种子在福射诱变处理前进行浸泡处理至露白，浸泡时间为不低 于 36h。
[0073] 具体地，所述福射诱变源为6化〇- 丫射线。
[0074] 具体地，福射诱变中诱变剂剂量为175Gy，剂量率为1.5Gy/Min。
[00巧]实施例4
[0076] 本实施例为福射诱变创制儒低积累水稻种质突变体；
[0077] 1)饱满的水稻HN186干种子3000粒左右消毒处理，用纯水浸泡24小时，使水稻种子 充分吸水，催芽，待种子露白时，使用^Co- 丫射线福照诱变处理，剂量250Gy，剂量率为 1.5Gy/Min，获得M0代种子的诱变群体。随机取50粒左右福照处理种子和未处理种子(对照） 在实验室发芽架做发苗试验，W观察苗期损伤效应来判断诱变处理效果。
[0078] 2)M0代种子播种育秩，待Ξ叶一屯、时，多本粗插种植仅混收主穗种子得到Ml代，Ml 代严格自交结实获得M2代群体种子，取M2代群体种子约5000粒在室内进行发苗培养，待幼 苗生长到两叶一屯、时，分别提取每个突变群体M2代单株叶片的基因组DNA。
[0079] 3)在Gene bank数据库中查找与儒吸收相关基因自然抗性相关巨隧细胞蛋白 0sNRAMP5的CDNA序列αD:AB690551)，根据0sNRAMP5基因的CDNA序列通过PrimerPremier 软件进行特异性分子引物的设计。
[0080] 4)取突变群体M2代单株叶片基因组DNA，将每个样品的浓度稀释为50ngAil，每10 个样品DNA等量混合构建样品池，5000个样品DNA构建500个混合池，依次编号P0化1- P(X)L500，用优化了的特异性分子引物，经PCR过程，分别对500个基因组DNA混合池进行扩 增，W每个样品混合池的基因组DNA为模板，按照下列体系和程序进行PCR，获得扩增产物。
[0081] 扩增的反应体系及PCR扩增程序
[0082] 正向引物：5' -AGAGAGCAGTGAGAGAGG-3';
[0083] 反向引物：5' -GACGGAGTCCTTCCTGAT-3';
[0084]
[0085] 5)扩增出每个混合池相对应的500个PCR产物，进行琼脂糖凝胶电泳，与DNA MAW 比较，检测扩增产物的分子量大小是否与基因 CDNA序列分子量大小一致。
[00化]6)切胶回收进行基因组测序。
[0087] 7)使用序列比对软件Bioedit，与野生型0SNRAMP5基因 CDNA序列比对，发现混合池 P(X)L78，P00L356，P00L472相对应的PCR产物的序列与野生型0sNRAMP5基因 CDNA序列存在差 异。
[0088] 8)利用步骤4)中的正、反向引物分别对混合池 P(X)L78，P00L356，P00L472包含的突 变群体中30个M2代单株基因组DNA进行PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，与DNAMA服 比较，检测扩增产物的分子量大小，切胶回收进行基因组测序，M2代突变群体中编号!1化86- M2-771、HN186-M2-775、HN186-M2-780、HN186-M2-3554、HN186-M2-3558、HN186-M2-4711、 HN186-M2-4718的7个单株与野生型0sNRAMP5基因 CDNA序列存在差异。
[0089] 9)将步骤8)中基因组序列存在差异的7个M2代单株在Ξ叶一屯、时移栽至儒含量背 景值一致的大田，严格自交繁殖后代，在成熟期单株收获巧粒，进行巧粒中儒含量的测定， 歴186-]?2-780、歷186-]\12-4711巧粒中儒含量相对野生型歷186巧粒儒含量降低，歴186-]\12- 780、HN186-M2-4711继续种植M3代进行综合鉴定，最终挟选出遗传稳定，综合性状优良的儒 低积累突变体。
[0090] ± 壤儒含量背景值为 1.225mg/Kg，实验组 HN186、HN186-M2-780、和 HN186-M2-4711 的含量见下表所示：
[0091]
[0092] 上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟 悉此技术的人±皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因 此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所掲示的精神与技术思想下所完 成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
【主权项】
1. 一种提高植物辐射诱变育种目标性状定向筛选效率的方法，包括如下步骤： 1) 对植物种子进行辐射诱变处理得到MO代种子； 2. M0代种子进行多本粗插种植仅混收主穗种子得到Ml代，Ml代自交结实获得M2代种 子； 3. M2代种子在室内进行发苗培养，待幼苗生长到两Pi心时，分别提取每个单株的基 因组DNA; 4) 确定育种目标性状，在Gene bank数据库中查找目标性状基因的⑶NA序列； 5) 根据目标性状基因的⑶NA序列通过Primer Premier软件进行分子引物的设计形成 优化了的分子引物； 6) 用优化了的分子引物，经PCR过程，对M2代单株的基因组DNA进行扩增； 7) 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，与DNAMARK比较，检测扩增产物的分子量大小是否与 目标性状基因⑶NA序列分子量大小一致； 8) 切胶回收进行基因组测序，与目标性状基因⑶NA序列比对； 9) 具有与目标性状基因 CDNA序列差异的M2代单株，再进一步进彳丁表型鉴定； 10) 自交繁殖后代，最终选出遗传稳定，目标性状符合育种要求的单株。2. 如权利要求1所述方法，其特征在于:所述植物种子为水稻种子。3. 如权利要求2所述方法，其特征在于:所述水稻种子在辐射诱变处理前进行浸泡处理 至露白，浸泡时间为不低于24h。4. 如权利要求1所述方法，其特征在于:所述辐射诱变源为6t3Co- γ射线。5. 如权利要求1所述方法，其特征在于:辐射诱变中诱变剂剂量为150~200Gy，剂量率 为1.0~2.0Gy/Min。6. 如权利要求1所述方法，其特征在于:所述目标性状为镉低积累。
【文档编号】A01H1/02GK105918114SQ201610001412
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年1月5日
【发明人】杨震, 彭选明, 王芊, 张勇, 谢洪科, 张逸妍, 张源海, 戴睿礼
【申请人】湖南省核农学与航天育种研究所