一种植物单倍体加倍方法
【专利摘要】本发明提供一种植物单倍体加倍方法，包括将处理过的植物单倍体幼芽用质量百分比为0.02％?0.05％的秋水仙素配以2％的二甲基亚砜的混合液浸泡单倍体幼芽的胚根部分,处理时间为18?36h，温度为14?18℃。本发明提供的单倍体加倍方法，解决了单倍体育种中加倍率低的技术难题，且操作简单，对人和环境安全性更高，将有效地推进单倍体育种的规模化进程。
【专利说明】
-种植物单倍体加倍方法
技术领域
[0001 ]本发明设及生物技术领域，尤其设及一种植物单倍体加倍方法。
【背景技术】
[0002] 随着人口的增加和经济的发展，玉米的需求量不断上涨。耕地面积减少和环境的 恶化使人们对高产、优质、抗逆性强的玉米新品种需求日益迫切。而目前用常规育种方法获 得高配合力的纯合自交系需耗费大量的人力和时间。常规的育种技术已经越来越不能满足 人们的育种需求。近年来，单倍体育种技术、基因工程育种、分子标记辅助育种等生物技术 手段的发展提高了育种效率，开辟了玉米育种的新途径。
[0003] 单倍体技术在玉米育种上应用具有如下优点：快速获得纯系；在单倍体中能简化 基因互作，去掉超显性效应，保留有利的加性和加性上位效应;还可淘汰有害的、致死和半 致死的隐性基因。但是，单倍体育种技术也存在缺点，那就是玉米单倍体育种中加倍率低， 而且操作往往比较复杂，无法实现玉米单倍体育种的规模化。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于解决上述现有技术存在的缺陷，提供一种能够提高玉米单倍体 育种中加倍率的方法。
[0005] -种植物单倍体加倍方法，包括将处理过的植物单倍体幼芽用质量百分比为 0.02%-0.05%的秋水仙素配W2%的二甲基亚讽的混合液浸泡单倍体幼芽的胚根部分，处 理时间为18-3化，溫度为14-18 °C。
[0006] 进一步地，如上所述的方法，处理植物单倍体的方法包括
[0007] 1)将玉米单倍巧粒消毒后置于细沙中26-30°C保湿催芽；
[000引2)待胚根长度1-1.5cm时将幼芽取出，置于一定溫度下保湿暗培养8-12h;
[0009] 3)取出幼芽，先切除胚根尖端l-2mm，再沿胚根纵切一个l-2mm小口。
[0010] 进一步地，如上所述的方法，步骤2)中所述一定溫度为4°C。
[0011] 进一步地，如上所述的方法，在经秋水仙素处理的幼芽后，包括：幼芽取出用流水 冲洗40-60min，移栽入培养皿中，进行智能溫室培养，待幼苗长至3叶一忍时移栽至大田。
[0012] 进一步地，如上所述的方法，所述智能溫室培养包括:培养溫度为26 °C，光培养化 或者暗培养16小时。
[0013] 进一步地，如上所述的方法，所述植物单倍体为蔬菜、花弁的单倍体。
[0014] 进一步地，如上所述的方法，所述植物单倍体为玉米的单倍体。
[0015] 有益效果：
[0016] 本发明提供的适用于玉米的单倍体加倍方法，此方法解决了玉米单倍体育种中加 倍率低的技术难题，且操作简单，对人和环境安全性更高，将有效地推进玉米单倍体育种的 规模化进程。
【具体实施方式】
[0017]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面本发明中的技术方案进行清 楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于 本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本发明保护的范围。
[001引实施例1:
[0019] 本实施例提供了一种玉米单倍体加倍方法，包括W下步骤：
[0020] 1)将玉米单倍巧粒消毒后置于细沙中26-30°C保湿催芽；
[0021] 2)待胚根长度1-1.5cm时将幼芽取出，置于4°C保湿暗培养8-12h;
[0022] 玉米根尖长度在1-1.5cm时其有丝分裂处于最活跃的时期，小于1cm或者大于 1.5cm的根也可W使用，但是效果次之。因此本实施例选择胚根长度为1-1.5cm。
[0023] 该步骤的主要作用是降低玉米根尖细胞分裂速度，让大部分细胞处于有丝分裂中 期，便于后面秋水仙素处理时能得到更多二倍体细胞，提高加倍率。
[0024] 4°C对玉米胚根生长、分生区有丝分裂属于临界溫度。低于4度，根尖产生严重冷 害，出现严重老化、发黄、死亡;高于4°C，根尖分生区细胞分裂仍会正常进行，很难达到多数 细胞处于同一分裂时期的状态。显微观察结果表明，4°C处理8-12小时后，处于同一分裂相 (有丝分裂中期）的细胞比例在25%-38%，溫度高于4°C，处于有丝分裂中期的细胞比例最 多在11%，因此，本实施例选择处理的条件为4°C保湿暗培养8-12h。
[0025] 3)取出幼芽，先切除胚根尖端l-2mm，再沿胚根纵切一个l-2mm小口；
[0026] 4)将上述处理好的单倍体幼芽放入1.5ml离屯、管中，用质量百分比为0.02%- 0.05%的秋水仙素配W2%的二甲基亚讽的混合液浸泡单倍体幼芽的胚根部分，处理时间 为18-3化，溫度为14-18 °C;
[0027] 1.5ml离屯、管大小正好能放入一粒玉米种子，其底端为圆锥形，去掉底部可让发芽 的玉米种子根伸出离屯、管，便于将离屯、管固定后药剂只浸泡根部而不会影响种子。
[0028] 本发明首先考虑的是怎样在低浓度秋水仙素的处理下提高玉米单倍体加倍率。在 低于前人处理浓度(0.06 %)下，通过延长浸泡处理时间、降低浸泡时溫度，一方面降低秋水 仙素对人体、单倍体苗及环境的危害，另一方面让加倍率与自然加倍比有显著提高。运是一 个有机的整体，低处理浓度、长时间处理、偏低的处理溫度缺一不可。
[0029] 秋水仙素浓度:前人研究绝大部分秋水仙素使用浓度(质量百分比）均在0.06%- 0.08%，对单倍体种子(或苗、根、茎尖)伤害、对人和环境的潜在威胁较大。秋水仙素浓度低 于0.02%时，对玉米胚根无损伤，但加倍率最多也只有12%，与自然加倍效果无显著差异； 秋水仙素大于0.05%时，对胚根的影响主要集中在后期生长上，大量出现根肿、褐化、生长 缓慢等情况，导致死苗、崎形苗、弱苗比例上升。
[0030] 浸泡处理时间：运里的时间是在秋水先素浓度在0.02%-0.05%浓度下的。低于18 小时，加倍效率与自然加倍差异不显著；高于36小时，对玉米根系生长影响显著，降低移栽 成活率。
[0031] 浸泡溫度:溫度低于14度，根尖细胞分裂活动缓慢，加倍率与自然加倍无显著差 异；14-18度之间的溫度，玉米根尖细胞分裂稳定，在处理18-36小时的时间内移栽成活率最 高，苗子崎形率最低;溫度高于18度，根尖细胞分裂速度较快，处理时间短加倍效果不显著， 如果处理时间长，后移栽后容易产生崎形苗。
[0032] 5)将经秋水仙素处理的幼芽取出用流水冲洗40-60min，移栽入专用营养杯中 优质生物有机质和矿物质等组成的材料为栽培介质，通过腐熟杀虫杀菌等前期处理，添加 赔石等辅助材料），置于智能溫室培养（1化暗培养，她光照培养），注意保持营养盘湿度，待 幼苗长至3叶一忍时移栽至大田。
[0033] 本发明不仅可用于单倍体苗的栽培，还用于园艺、蔬菜、花弁领域。
[0034] 实施例2:
[0035] 1)玉米单倍体种子发芽:将单倍体种子消毒后置于蒸馈水中浸泡10小时;将浸泡 后的种子均匀地插入湿度75%左右的装满沙子的发芽盘中（沙盘厚度lOcmW上），铺上湿毛 巾，放置在26 Γ的培养箱中暗培养2天，并及时补充水分。
[0036] 胚根顶端切除：待玉米单倍体胚根长至1.5cm左右时，切除玉米单倍体幼芽胚根顶 端1 -2mm,再沿胚根方向纵切1 -2mm。
[0037] 2)秋水仙素溶液配制：分别配制3种不同浓度（质量百分比）的秋水仙素溶液： 0.02 %秋水仙素巧％二甲基亚讽;0.04 %秋水仙素+2 %二甲基亚讽;0.049 %秋水仙素+2 % 二甲基亚讽;0.05%秋水仙素+2%二甲基亚讽；
[0038] 3)幼芽浸泡:步骤1)处理的幼芽胚根向下放入加入300ul步骤2所述不同浓度秋水 仙素溶液的1.5m 1离屯、管中，使幼芽的胚根部分浸泡在溶液中，而种子不接触秋水仙素溶 液。整个操作过程在10-24°C进行，浸泡时间在12-3化。
[0039] 4)将幼芽从离屯、管中取出，放进发芽盒，并立即用清水冲洗，随后将废弃的秋水仙 素溶液倒进固定的废液桶中并处理。清水冲洗时间40-60min。
[0040] 5)将幼芽移栽在入装有营养±的营养杯中，放置在智能溫室中培养。培养溫度为 26°C，光培养化，暗培养16小时。注意保持营养±湿度。待幼苗长至2-3叶时候，移栽入大田。 田间管理水平略高于普通大田。
[0041 ] 实施例3:
[0042] 该方法为目前最常见的方法一一萌动种子处理法
[0043] 秋水仙素浓度:0.06%、0.08%、0.1%
[0044] 单倍体种子发芽:将单倍体种子消毒后于蒸馈水中浸泡lOh;将种子均匀地摆放在 铺有湿毛巾的发芽盘中，放置在26°C的适宜环境中暗光培养24h左右，待胚根破口后取出。
[0045] 处理:将露白（胚根破口）的种子胚面向下置于发芽盘中，再加入适量上述不同浓 度的秋水仙素溶液，W刚好淹没种子胚面为准。处理时间分别为4h、8小时、12小时。处理溫 度为常溫(22度左右）。
[0046] 处理后的种子用流水冲洗40min左右，播于营养鉢中，待3叶时期移入大田。管理上 略高于普通水平。
[0047] 对照组试验2:(自然加倍法）
[004引将单倍体种子催芽后直接播于营养鉢中，待3叶时期移入大田。管理上略高于普通 水平。
[0049] 结果如下表；
[0050] 表1不同秋水仙素浓度处理后单倍体苗崎形率(每处理W50苗统计，无死亡株）
[0化1 ]
L0056J 根据表1-表3发现，本发明所提供的玉米单倍体加倍技术能显著降低秋水仙素对 玉米幼芽的毒害，致崎率平均在15%左右(对照平均50%);显著地提高玉米单倍体的加倍 率，雄穗散粉率最高可达34%，远高于对照（自然加倍，平均在5-10%)，且降低了秋水仙素 使用浓度一半。此方法解决了玉米单倍体育种中加倍率低的技术难题，且操作简单，对人和 环境安全性更高，将有效地推进玉米单倍体育种的规模化进程。
[0057]最后应说明的是：W上实施例仅用W说明本发明的技术方案，而非对其限制;尽管 参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解:其依然可 W对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换； 而运些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和 范围。
【主权项】
1. 一种植物单倍体加倍方法，其特征在于，包括将处理过的植物单倍体幼芽用质量百 分比为O . 02 % -0.05 %的秋水仙素配以2 %的二甲基亚砜的混合液浸泡单倍体幼芽的胚根 部分，处理时间为18-36h，温度为14-18°C。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，处理植物单倍体的方法包括 1) 将玉米单倍籽粒消毒后置于细沙中26-30°C保湿催芽； 2) 待胚根长度1-1.5cm时将幼芽取出，置于一定温度下保湿暗培养8-12h; 3) 取出幼芽，先切除胚根尖端l_2mm，再沿胚根纵切一个l-2mm小口。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述一定温度为4°C。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在经秋水仙素处理的幼芽后，包括:幼芽取 出用流水冲洗40-60min，移栽入培养皿中，进行智能温室培养，待幼苗长至3叶一芯时移栽 至大田。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述智能温室培养包括:培养温度为26°C， 光培养8h、暗培养16小时交替进行。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物单倍体为蔬菜、花卉的单倍体。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物单倍体为玉米的单倍体。
【文档编号】A01H1/08GK105918116SQ201610327715
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年5月17日
【发明人】宋军, 杜文平, 余桂容, 陈谦, 徐利远, 林杨
【申请人】四川省农业科学院生物技术核技术研究所