一种当归愈伤组织诱导培养基的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种当归愈伤组织诱导培养基，其特征在于，所述培养基的配比为B5+11.0?17.0ug/ml皇竹草氨基酸提取液+0.6?0.9mg/L 2,4?D+1.2?3.0mg/L NAA。本发明还提供了一种当归愈伤组织诱导的方法，所述方法包括以下步骤：选取生长健壮的当归幼嫩组织部位，洗净后依次用90％乙醇消毒12s，0.1％HgCl2消毒8min，无菌水冲洗3次后，切成4mm小段，接种于权利要求1所述当归愈伤组织诱导培养基中，2200?2400lx光照强度下室温培养15?18d，光照8h/d。本发明的有益效果为诱导时间短；诱导率高，适用范围广，宜推广应用；可培养得到高多糖含量细胞。
【专利说明】
-种当归愈伤组织诱导培养基
技术领域
[0001] 本发明属于植物培养领域，具体设及一种当归愈伤组织诱导培养基。
【背景技术】
[0002] 当归[Angelica sinensis(01iv. )Diels]为伞形科多年生草本植物，W干燥根入 药，富含挥发油、有机酸、多糖和黄酬等化学成分，具有补血活血、调经止痛、润肠通便等功 效，素有"十方九归"之称，主产于甘肃、云南、四川、陕西、青海等省。近年来，随着中药产业 的发展，当归已在美容保健、饮品、调味品等行业中广泛应用，市场需求量越来越大。然而当 归作为一种高海拔育苗、低海拔引种移栽的特殊植物，利用传统开星生地育苗的方法，既破 坏天然植被，造成严重的水±流失，导致环境恶化，又因当归种子的生产周期长，繁殖系数 低，育苗成本高。加之近年来由于气溫升高，原适宜区的适宜性下降，其育苗所需的高海拔 地也越来越少，因此，进行当归无菌苗培养和愈伤组织诱导研究，是替代传统育苗方式，保 护当归种植区的植被和生态环境，解决当归种苗工厂化生产的基础。
[0003] 皇竹草，又称皇草、凌云竹，为禾本科狼尾草属多年生草本植物，根系发达、密集， 因此比较耐干旱，适应性强。皇竹草植株高大，一般高4~5m，最高可长到8m，鲜草产量很高， 是丰产的牧草。皇竹草含丰富营养素，现已测定含粗蛋白18.6%、精蛋白16.68%、粗纤维 17.78%、精脂肪3.8%、总糖8.3%及17种氨基酸及钢、钟、巧、儀等微量元素。当前，对于皇 竹草营养成分的开发利用局限于少数保健饮料的生产，尚未见其在其他方面的报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种当归愈伤组织诱导培养基，W期用离体快繁的方式来 替代传统育苗方式获得性状稳定的当归苗，为工厂化生产提供理论依据，保护当归种植区 的植被和生态环境，同时获得大量次生代谢产物当归多糖。
[0005] 为实现上述发明目的，本发明提供的技术方案如下：
[0006] 本发明提供一种当归愈伤组织诱导培养基，所述培养基的配比为85叫1.〇- 17.011肖/1111皇竹草氨基酸提取液+0.6-0.9111肖/12,4-0+1.2-3.0111肖/1酷八。
[0007] 本发明还提供一种当归愈伤组织诱导的方法，所述方法包括W下步骤:选取生长 健壮的当归幼嫩组织部位，洗净后依次用90%乙醇消毒123,0.1%化(：12消毒8111^，无菌水 冲洗3次后，切成4mm小段，接种于上述当归愈伤组织诱导培养基中，2200-24001X光照强度 下室溫培养15-18d，光照化/d。
[000引优选的，上述方法中当归幼嫩组织部位为当归叶片、叶柄W及根尖部位。
[0009] 优选的，上述方法中接种当归幼嫩叶片的愈伤组织诱导培养基配比为Bs+ll.Oug/ ml皇竹草氨基酸提取液+0.6mg/L 2,4-D+3.0mg/L NAA，光照强度为24001X，培养时间为 17d。
[0010] 优选的，上述方法中接种当归幼嫩叶柄的愈伤组织诱导培养基配比为Bs+ll.Oug/ ml皇竹草氨基酸提取液+0.6mg/L 2，4-D+3 . Omg/L NAA，光照强度为22001X，培养时间为 17d。
[0011] 优选的，上述方法中接种当归幼嫩根尖的愈伤组织诱导培养基配比为B5+17.0mg/ L皇竹草氨基酸提取液+0.75mg/L 2,4-D+3.0mg/L NAA，光照强度为23001X，培养时间为 15d。
[0012] 与现有技术相比，本发明的有益效果为首次将皇竹草氨基酸提取液应用于当归愈 伤组织诱导培养基中，能够与2,4-D、NAA协同促进愈伤组织的诱导，诱导时间短;对当归叶 片、叶柄W及根尖均具有很高的诱导率，适用范围广，宜推广应用;诱导产生的愈伤组织进 行细胞悬浮培养可得高多糖含量细胞。
【具体实施方式】
[0013] 为使本技术领域的技术人员能更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例对 本发明技术方案进行详细说明。
[0014] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0015] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0016] 实施例1
[0017] -种当归愈伤组织诱导培养基，所述培养基的配比为B日+11.Oug/ml皇竹草氨基酸 提取液+〇.6mg/L 2,4-D+1.2mg/L NAA。
[001引对比例1
[0019] -种当归愈伤组织诱导培养基，所述培养基的配比为B日+0.6mg/L2，4-D+1.2mg/L NAAo
[0020] 实施例2
[0021] 一种当归愈伤组织诱导培养基，所述培养基的配比为Bs+14.Oug/ml皇竹草氨基酸 提取液+〇.75mg/L 2,4-0+2. Img/L NAA。
[0022] 对比例2
[0023] 一种当归愈伤组织诱导培养基，所述培养基的配比为Bs+2. Img/L NAA。
[0024] 实施例3
[0025] 一种当归愈伤组织诱导培养基，所述培养基的配比为B5+17.0mg/L皇竹草氨基酸 提取液+〇.9mg/L 2,4-0+3.Omg/L NAA。
[00%] 对比例3
[0027] -种当归愈伤组织诱导培养基，所述培养基的配比为Bs。
[0028] 实施例4
[0029] 选取生长健壮的当归幼嫩叶片，洗净后依次用90%乙醇消毒12s，0.1%化Cl2消毒 8min，无菌水冲洗3次后，切成4mm小段，接种于实施例1所得当归愈伤组织诱导培养基中， 22001X光照强度下室溫培养15d，光照化/d。
[0030] 对比例4
[0031] 选取生长健壮的当归幼嫩叶片，洗净后依次用90%乙醇消毒12s，0.1%化Cl2消毒 8min，无菌水冲洗3次后，切成4mm小段，接种于对比例1所得当归愈伤组织诱导培养基中， 22001X光照强度下室溫培养15d，光照化/d。
[0032] 实施例5
[0033] 选取生长健壮的当归幼嫩叶柄，洗净后依次用90%乙醇消毒12s，0.1%化Cl2消毒 8min，无菌水冲洗3次后，切成4mm小段，接种于实施例2所得当归愈伤组织诱导培养基中， 23001X光照强度下室溫培养16.5d，光照化/d。
[0034] 对比例5
[0035] 选取生长健壮的当归幼嫩叶柄，洗净后依次用90%乙醇消毒12s，0.1%化Cl2消毒 8min，无菌水冲洗3次后，切成4mm小段，接种于对比例2所得当归愈伤组织诱导培养基中， 23001X光照强度下室溫培养16.5d，光照化/d。
[0036] 实施例6
[0037] 选取生长健壮的当归幼嫩根尖，洗净后依次用90%乙醇消毒12s，0.1%化Cl2消毒 8min，无菌水冲洗3次后，切成4mm小段，接种于实施例3所得当归愈伤组织诱导培养基中， 24001X光照强度下室溫培养18d，光照化/d。
[003引对比例6
[0039] 选取生长健壮的当归幼嫩根尖，洗净后依次用90%乙醇消毒12s，0.1%化Cl2消毒 8min，无菌水冲洗3次后，切成4mm小段，接种于对比例3所得当归愈伤组织诱导培养基中， 24001X光照强度下室溫培养18d，光照化/d。
[0040] 表1实施例4-6及对比例4-6当归愈伤组织诱导率统计表
[0041]
[0042]
[0043] 从表1可知实施例4-6愈伤组织诱导率均在95.9 % W上，显著高于对比例4- 680.2%?下的愈伤组织诱导率，表明本发明提供的当归愈伤组织诱导培养基各成分间具 有协同作用。
[0044] 正交实验确定当归叶片、叶柄W及根尖愈伤组织诱导的最佳培养基配比、培养时 间及光照强度。
[0045] 表2诱导培养基配比、培养时间及光照强度对当归叶片、叶柄W及根尖愈伤组织诱 导的正交实验因素水平
[0046]
[0047] 实施例7
[004引不同愈伤组织培养基配比、培养时间及光照强度对当归叶片愈伤组织诱导的影响 [0049] 表3诱导培养基配比、培养时间及光照强度对当归叶片愈伤组织诱导的正交实验
[(Κ)加 ]
[0化1 ]
[0052]从表3正交实验的结果极差R值分析可知各因素对当归叶片愈伤组织诱导率影响 的大小为E>A>C>D>B，即培养时间 > 皇竹草氨基酸提取液>NAA>光照强度>2,4-D。最 优组合为A1B1C3D3E2，即皇竹草氨基酸提取液浓度为11. Omg/L，2，4-D浓度为0.6mg/L，NAA浓 度为3.0mg/L，光照强度为24001X，培养时间为17d。
[0化3] 实施例8
[0054] 不同愈伤组织培养基配比、培养时间及光照强度对当归叶柄愈伤组织诱导的影响
[0055] 表4诱导培养基配比、培养时间及光照强度对当归叶柄愈伤组织诱导的正交实验
[0化6]
[0化7]
[0058]从表4正交实验的结果极差R值分析可知各因素对当归叶柄愈伤组织诱导率影响 的大小为E>C>B>A>D，即培养时间>NAA>2,4-D>皇竹草氨基酸提取液>光照强度。最 优组合为A1B1C3D1E2，即皇竹草氨基酸提取液浓度为11. Omg/L，2，4-D浓度为0.6mg/L，NAA浓 度为3. Omg/L，光照强度为22001X，培养时间为17d。
[0化9] 实施例9
[0060] 不同愈伤组织培养基配比、培养时间及光照强度对当归根尖愈伤组织诱导的影响
[0061] 表5诱导培养基配比、培养时间及光照强度对当归根尖愈伤组织诱导的正交实验
[0062]
[0063]
[0064] 从表5正交实验的结果极差R值分析可知各因素对当归根尖愈伤组织诱导率影响 的大小为A > B > C > D > E，即皇竹草氨基酸提取液培养时间> 2，4-D > NAA >光照强度 > 培 养时间。最优组合为A3B2C3D2E1，即皇竹草氨基酸提取液浓度为17 . Omg/L，2，4-D浓度为 0.75mg/L，NAA浓度为3. Omg/L，光照强度为23001X，培养时间为15d。
[00化]当归多糖（angelica polysaccharides，AP)，组分含D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖、 心阿拉伯糖、葡萄糖醒酸W及半乳糖酸等。AP为当归主要水溶性成分，且具有明显地改善血 液系统、免疫促进、抗肿瘤等广泛的药理活性。酬酸是分子中同时含有簇基和酬基的化合 物，氨基酸经联合脱氨或其它方式脱氨所生成的α-酬酸中间产物可促进多糖的生成，而利 用植物细胞悬浮培养技术进行药用植物次生代谢产物生物合成是解决目前植物次生代谢 产物欠缺的重要途径，愈伤组织的外观形态和生理状态直接影响到后续建立细胞悬浮系的 质量。
[0066] 实施例10
[0067] 用实施例4-6及对比例4-6制得的当归叶片、叶柄及根尖愈伤组织按常规细胞悬浮 培养技术进行培养，检测培养细胞中多糖含量，结果见表6。
[0068] 表6当归叶片、叶柄及根尖愈伤组织经细胞悬浮培养所得细胞多糖含量
[0069]
'[0070]~从表6可知实施例4-6诱导的当归叶片、叶柄及根尖愈伤组织经细胞悬浮培养后细I 胞多糖含量均在211.4mg/LW上，显著高于对比例4-6诱导的当归叶片、叶柄及根尖愈伤组 织经细胞悬浮培养后低于60.8mg/L的细胞多糖含量，表明本发明提供的当归愈伤组织诱导 培养基各成分之间具协同作用。另外，实施例4-6的细胞多糖含量与对比例4的细胞多糖含 量有显著差距，且对比例460.8mg/L和对比例556.9mg/L细胞多糖含量无明显差距，表明对 当归愈伤组织经细胞悬浮培养后细胞多糖含量影响最大的成分是诱导培养基中的皇竹草 氨基酸提取液。
[0071] W上实施例仅是本发明的几个实施例，但本发明并非局限于此。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有做出任何创造性劳动的前提下得到的所有其它实施方 式，都属于本发明所保护的范围。
【主权项】
1. 一种当归愈伤组织诱导培养基，其特征在于，所述培养基的配比为B5+l 1.0-17. Oug/ ml皇竹草氨基酸提取液+0.6-0.9mg/L 2,4-D+1 ·2_3· Omg/L NAA。2. -种当归愈伤组织诱导的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤:选取生长健壮 的当归幼嫩组织部位，洗净后依次用90%乙醇消毒12s，0.1 ^HgCl2消毒Smin，无菌水冲洗3 次后，切成4mm小段，接种于权利要求1所述当归愈伤组织诱导培养基中，2200-24001X光照 强度下室温培养15-18d，光照8h/d。3. 根据权利要求2所述当归愈伤组织诱导的方法，其特征在于，所述当归幼嫩组织部位 为当归幼嫩叶片、叶柄以及根尖部位。4. 根据权利要求3所述当归愈伤组织诱导的方法，其特征在于，所述接种当归幼嫩叶片 的愈伤组织诱导培养基配比为B5+l1.0 ug/ml皇竹草氨基酸提取液+0.6mg/L 2，4-D+3. Omg/ L NAA，光照强度为2400Ix，培养时间为17d。5. 根据权利要求4所述当归愈伤组织诱导的方法，其特征在于，所述接种当归幼嫩叶柄 的愈伤组织诱导培养基配比为B5+l1.0 ug/ml皇竹草氨基酸提取液+0.6mg/L 2，4-D+3. Omg/ L NAA，光照强度为2200Ix，培养时间为17d。6. 根据权利要求4所述当归愈伤组织诱导的方法，其特征在于，所述接种当归幼嫩根尖 的愈伤组织诱导培养基配比为B5+17. Omg/L皇竹草氨基酸提取液+0.75mg/L 2，4-D+3. Omg/ L NAA，光照强度为2300Ix，培养时间为15d。
【文档编号】A01H4/00GK105918131SQ201610355651
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年5月25日
【发明人】不公告发明人
【申请人】广州聚注专利研发有限公司