一种野栽杂交后代花药愈伤组织诱导培养基的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种野栽杂交后代花药愈伤组织诱导培养基，该培养基的配比由一定比例的KNO3、(NH4)3SO4、KH2PO4、MgSO4?7H2O、CaCl2?2H2O、MnSO4?4H2O、ZnSO4?7H2O、H3BO3、KI、NaMoO4?2H2O、CuSO4?5H2O、CoCl2?6H2O、FeSO4?7H2O、甘氨酸、丙氯酸、赖氨酸、烟酸、叶酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆素、肌醇、水解乳蛋白、酵母浸提物、NAA、2.4?D、蔗糖、琼脂、活性炭组成，pH值为5.5。采用本发明的技术方案，对野栽杂种后代花药培养时愈伤组织诱导率高，能够诱导出高质量的愈伤组织，愈伤组织的结构坚实。
【专利说明】
一种野栽杂交后代花药愈伤组织诱导培养基
技术领域
[0001] 本发明属于稻种资源研究的植物组织培养技术领域，尤其涉及一种野栽杂交后代 花药愈伤组织诱导培养基。
【背景技术】
[0002] 在有性杂交技术中，采用种间远缘杂交方法是有效的转移种间优异基因的有效方 法，但是该方法也存在最难克服的技术问题，就是在野栽稻种间杂交后代自交分离严重，在 很长时期内很难获得稳定的优良品系的技术问题。我们曾经做过1400多个野栽杂交组合， 先后历史10余年，仍然有部分杂交组合后代品系继续分离，无法获得自交稳定品系，从而严 重影响野生稻优异种质（优异基因）的应用。同时，经过调查，许多育种家都一致反映，利用 野生稻优异种质作杂交育种周期很长，杂种后代出现严重分离是造成周期长的主要原因。 所以，大家都希望能采取新技术克服这一难题，提供容易稳定的具有优异基因的中间材料， 进而促进野生稻优异种质的利用。然而，在野栽远缘杂交后代(F2~6)的花药培养研究中发 现，花药培养的第一步就是要得到花药愈伤组织，而且必须是高诱导率的花药愈伤组织;但 是，采用现有技术的花药愈伤组织的培养基得到的愈伤诱导率很低，最高只能达到10%左 右，所以严重影响了花药培养的效率。
【发明内容】
[0003] 针对以上技术问题，本发明公开了一种野栽杂交后代花药愈伤组织诱导培养基， 对野栽杂种后代花药培养具有高效诱导愈伤组织的效果。
[0004] 对此，本发明的技术方案为：
[0005] -种野栽杂交后代花药愈伤组织诱导培养基，其包括的组分及其浓度为： KNO1 278(V2880mg/l, (HH4)3SO4; 650-720 mg/1, KH2PO^ 500-550 mg/!,
[0006] MgS04*7H2〇 155 ~210 mg/L， CaCl2*2H20 146~196mg/U MnS04*4H20 19.5~26.2mg/l, ZnS04*7H20 6.6-9.6 mg/l, H1BO1 ~2.8mg/l， KI 0,6-1 .Qmg/1> NaMoO4GH2O 0.015 ~0,035mg/l， CuSOrSH2O 0.010~0.040mg/l, CoCh?6H-.〇 0.010~0.040mg/l, 铁盐 9~llml/L， 甘氨酸 2.0±0.2mg/l， 丙氯酸 2.0±0.2mg/U 赖氨酸 2.0±0.2mg/l， 烟酸 0.5±0.1mg/l，
[0007] 叶酸 0.5±0.1mg/l， 盐酸硫胺素 1.0±0.2mg/h 盐酸 Pit 哆素 0.5±0.2mg/l， 肌醇 50±3mg/l， 水解乳蛋白 800士 30mg/l， 酵母浸提物 1000±30 mg/1， NAA 2.0±0.8 nig/?， 2.4-D 3.5±0.3 mg/l, 蔗糖 15000士200 mg, h 琼脂 9000±200 mg/l, 活性炭 10±2 mg/l, pH 5,5-5.8:
[0008] 其中，所述铁盐中含有的FeS〇4的摩尔浓度为0.02mol/l。
[0009] 作为本发明的进一步改进，所述的野栽杂交后代花药愈伤组织诱导培养基包括的 组分及其浓度为： KNQ3 2810~2850mg/L
[0010] (NH4)5SO., 673-713 mg/l, KH2PO4 515-535 mg/1, MgS04*7H：0 175-195 mg/1. CaC:b.2H:0 156- 176ing/l, MnSa,*4H20 20.2~-24.2m^l, ZnSO4*?H2O 7.6-8.6 mg/1, HiBO3 1.5~2.5mg/L KI 0.7-0.9mg/l. NaMo〇4*2H20 0.015^0.035 mg/lr CuS04*5H,0 0.015-0.035 mg/1, CoCI2W-I2O ()·015~0.035 mg/l， 铁.? 9~llnil/L， 甘&(酸 2.0±0.15 mg/i, 丙氯酸 2.0±0.1_5 mg/丨，
[0011] 赖氨酸 2.0±0.15 mg/U 姻酸 0.5±0.05 mg/丨， 叶酸 （).5土().()5 mg/l， 盐酸硫胺素 1.0: ±0.15 mg/L 盐酸吡哆素 0.5土0.15 mg/1， 肌醇 5.0^2,:5 mg/1， 水解乳蛋白 800士 20 mg/l， 酵母浸提物 1000±20 mg/1， NAA 2.0±0.5 mg/1, 2.4-D 3.5士0.25 mg/丨， 蔗糖 1500i)：t100 mg,，l, 谅脂 9000+100 mg/1, 活性拔 10±2 mg/U pH 5.5 ~5.7 〇
[0012] 作为本发明的进一步改进，所述铁盐采用铁盐母液；所述铁盐母液为将5.57g FeSO4 · 7H2〇和7.45g Na-EDTA定容于1000ml蒸馏水中得到。
[0013] 在水稻野栽(栽野)远缘杂交过程中或者在野生稻优异种质创新、育种过程常常出 现杂种^代及以后的子代(F2~F n)中严重分离的现象，这种现象严重阻碍野生稻优异种质 利用。我们在近10年来先后作了 1000余个普通野生稻与栽培稻品种杂交组合，部分不经过 本培养基进行花药培养的杂交组合后代材料已经超过F18代，还在继续分离，很难获得稳定 的优良材料。采用野栽杂种后代(Fp 4)的材料进行花药培养获取单倍体愈伤组织进而分化 出单倍体绿苗在出代就获得稳定单株，H2代就形成稳定株系，能够有效地克服野栽杂种后代 疯狂分离技术难题，并极大地缩短野栽杂交育种周期，提升野生稻优异种质(基因）利用效 果。
[0014] 在研制本野栽杂种花药愈伤组织诱导培养基前，我们采用栽培稻的花药培养的愈 伤组织诱导培养基，进行野栽杂种后代花药愈伤组织诱导培养，愈伤组织诱导率普遍较低， 在80多次试验中平均愈伤组织诱导率徘徊5%左右，并且出现大量参试杂交组合花药愈伤 组织诱导率为0的现象。
[0015] 采用本发明的技术方案，在野生稻优异种质创新研究及野栽杂交育种过程中先后 做了 200多次试验，每次小花2800多枚，共试验576000多枚小花，平均愈伤组织诱导率20 % 以上，株系最高诱导率33%以上。比现有技术的培养基的平均诱导率提高2倍多，达到和超 过栽培稻品种间杂交后代花药培养愈伤组织诱导率，为从根本上解决普通野生稻与栽培稻 的野栽杂交后代疯狂分离的技术难题提供了新的方向，为野生稻优异种质利用打下坚实基 础。
[0016] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0017] 采用本发明的技术方案，愈伤组织诱导率高，能够诱导出高质量的愈伤组织，表现 在愈伤组织的结构坚实，分化率较好，有效地提升了我国普通野生稻与栽培稻杂交后代花 药愈伤组织诱导技术水平，基本上解决野栽杂种后代花药愈伤组织诱导难，为进一步解决 野生稻优异基因在水稻(杂交水稻、超级稻、优质常规稻)利用的技术难题奠定了基础。
【具体实施方式】
[0018] 下面对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。
[0019] 实施例1
[0020] -种野栽杂交后代花药愈伤组织诱导培养基，其包含的组分及其浓度为：
[0021] KNO3 2810mg/l, (NH4)3SO4 673mg/l ,KH2PO4 515mg/l ,MgSO4 · 7H20 175mg/l, CaCl2· 2H20 156mg/l,MnSO4· 4H20 20.2mg/l,ZnSO4· 7H20 7.6mg/l,H3BO3 1.5mg/l,KI 0.7mg/l，NaMo〇4.2H20 0.015mg/l，CuS〇4.5H20 0.015mg/l，CoCl2.6H2〇 0.015mg/l，铁盐 9ml/L，甘氨酸I · 8mg/1，丙氯酸 I · 8mg/1，赖氨酸I · 8mg/l，烟酸0 · 4mg/1，叶酸0 · 4mg/1，盐酸 硫胺素〇 · 8mg/l，盐酸吡哆素0 · 4mg/l，肌醇48mg/l，水解乳蛋白780mg/l，酵母浸提物980mg/ I，NAA I · 5mg/1，2 · 4_D 3 · 2mg/1，鹿糖14800mg/1，琼脂8800mg/1，活性炭IOmg/1，pH为5 · 5。
[0022] 其中，铁盐采用铁盐母液加入;所述铁盐母液为将5.57g FeS〇4 · 7H20和7.45g Na-Η)ΤΑ定容于I OOOml蒸馏水中得到，在添加铁盐时，每升培养基取铁盐母液9ml。
[0023] 实施例2
[0024] -种野栽杂交后代花药愈伤组织诱导培养基，其包含的组分及其浓度为：
[0025] KNO3 2820mg/l, (NH4)3SO4 685mg/l ,KH2PO4 520mg/l ,MgSO4 · 7H20 180mg/l, CaCl2 · 2H20 160mg/l,MnSO4 · 4H20 20.5mg/l,ZnSO4 · 7H20 8.Omg/1,H3BO3 2.0mg/l,KI 0.9mg/l，NaMo〇4.2H20 0.02mg/l，CuS〇4.5H20 0.02mg/l，CoCl2.6H20 0.02mg/l，铁盐 9ml/L，甘氨酸2 · Omg/1，丙氯酸2 · Omg/1，赖氨酸2 · Omg/1，烟酸0 · 5mg/l，叶酸0 · 5mg/l，盐酸 硫胺素 I. 〇mg/l，盐酸吡咳素 0.5mg/l，肌醇50mg/l，水解乳蛋白800mg/l，酵母浸提物 1000mg/l，NAA2 · Omg/1，2 · 4-D 3 · 5mg/l，鹿糖 15000mg/1，琼脂9000mg/1，活性炭 I Omg/1，pH 为 5·6〇
[0026] 其中，铁盐采用铁盐母液加入;所述铁盐母液为将5.57g FeS〇4 · 7H20和7.45g Na-Η)ΤΑ定容于I OOOml蒸馏水中得到，在添加铁盐时，每升培养基取铁盐母液9ml。
[0027] 实施例3
[0028] -种野栽杂交后代花药愈伤组织诱导培养基，其包含的组分及其浓度为：
[0029] KNO3 2850mg/l, (NH4)3SO4 713mg/l ,KH2PO4 535mg/l ,MgSO4 · 7H20 195mg/l, CaCl2 · 2H20 176mg/l，MnS〇4 · 4H20 24.2mg/l，ZnS〇4 · 7H20 9.6mg/l，H3B03 2.5mg/l，KI 0.9mg/l，NaMo〇4 · 2H20 0.035mg/l，CuS〇4 · 5H20 0.035mg/l，CoCl2 · 6H2O 0.035mg/l，铁盐 IOml/L，甘氨酸2 · lmg/1，丙氯酸2 · lmg/1，赖氨酸2 · lmg/1，烟酸0 · 5mg/l，叶酸0 · 5mg/l，盐酸 硫胺素 I. 〇mg/l，盐酸吡咳素 0.5mg/l，肌醇50mg/l，水解乳蛋白600mg/l，酵母浸提物 1020mg/l，NAA 2.0mg/l，2.4_D 3.5mg/l，鹿糖 15100mg/l，琼脂9000mg/l，活性炭I .Omg/1， pH为5.6。
[0030] 其中，铁盐采用铁盐母液加入;所述铁盐母液为将5.57g FeS〇4 · 7H20和7.45g Na-Η)ΤΑ定容于1000ml蒸馏水中得到，在添加铁盐时，每升培养基取铁盐母液10ml。
[0031] 实施例4
[0032] -种野栽杂交后代花药愈伤组织诱导培养基，其包含的组分及其浓度为：
[0033] KNO3 2830mg/l, (NH4)3SO4 693mg/l ,KH2PO4 525mg/l ,MgSO4 · 7H20 185mg/l, CaCl2 · 2H20 166mg/l,MnSO4 · 4H20 22.2mg/l,ZnSO4 · 7H20 8.6mg/l,H3BO3 2.Omg/1,KI 0.8mg/l，NaMo〇4 · 2H20 0.025mg/l，CuS〇4 · 5H20 0.025mg/l，CoCl2 · 6H2O 0.025mg/l，铁盐 I Iml/L，甘氨酸2 · Omg/1，丙氯酸2 · Omg/1，赖氨酸2 · Omg/1，烟酸0 · 5mg/l，叶酸0 · 5mg/l，盐酸 硫胺素 I. 〇mg/l，盐酸吡咳素 0.5mg/l，肌醇50mg/l，水解乳蛋白800mg/l，酵母浸提物 100011^/1，熟厶2.011^/1，2.4-0 3.711^/1，鹿糖1510011^/1，琼脂910011^/1，活性炭3.011^/1， pH为5.8。
[0034] 其中，铁盐采用铁盐母液加入;所述铁盐母液为将5.57g FeSO4 · 7H20和7.45g Na-Η)ΤΑ定容于1000ml蒸馏水中得到，在添加铁盐母液时，每升培养基取铁盐母液11ml。
[0035] 对比例1
[0036]本例采用N6的培养基，其包含的组分及其浓度详见表1所示
[0037] 对比例2
[0038] 本例采用杭大V的培养基，其包含的组分及其浓度详见表1所示。
[0039] 采用实施例1~实施例4、对比例1~2的培养基分别对IR36X北海野生稻、IR661X 北海野生稻、IR2061 X北海野生稻、桂99 X北海野生稻、桂99 X来宾野生稻进行野栽杂种后 代花药愈伤组织的培养实验，实验数据详见表2。
[0040] 表1对比例1和对比例2的培养基的配方表
[0042] 其中，铁盐为采用铁盐母液进行添加，所述铁盐母液为采用5.57g的FeS〇4 · 7H20和 7.45g的Na-EDTA(乙二胺四乙酸二钠)溶于IL水中的溶液得到。
[0043] 表2实施例1~实施例4、对比例1~2的花药培养愈伤组织诱导结果
[0045]从表2结果看到，实施例3在各种野栽杂种后代的组合中，诱导率最高，愈伤组织的 结构坚实，平均诱导率23.04%，株系最高诱导率36.58%，采用本发明技术方案的实施例1 ~4的培养基的诱导率都高于对比例1和对比例2的。其中，对比例1和对比例2为国内诱导率 效果好的培养基。
[0046] 将采用实施例1~实施例4、对比例1~2的培养基得到的愈伤组织进行转分化，经 过对比，采用实施例3的培养基得到的愈伤组织也是愈伤组织转分化后出绿苗最多诱导培 养基，说明其诱导出来的愈伤组织质量较好。
[0047] 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定 本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在 不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的 保护范围。
【主权项】
1. 一种野栽杂交后代花药愈伤组织诱导培养基，其特征在于：其包括的组分及其浓度 为： KNO3 2780~2880mg/l， (NH4)3SO4 650~720 mg/1， KH2PO4 500-550 mg/1, MgSO4 ·7Η20 155~210 mg/1， CaCl2·2Η20 146~196mg/l， MnSO4·4Η20 19.5~26.2mg/l, ZnS〇4.7H2〇 6.6~9.6 mg/1, H3BO3 I·0~2·8mg/l， KI 0.6-1.Omg/1, NaMoO4-2H20 0.015~0.035 mg/1， CuSO4-5H20 0.010-0.040mg/l, C〇C12-6H20 0.010-0.040mg/l, 铁盐 9~llml/L， 甘氨酸 2·0±0·2 mg/1， 丙氯酸 2.0±0.2mg/l， 赖氨酸 2·0±0·2 mg/1， 烟酸 0.5±0.1mg/l， 叶酸 0.5±0.1mg/l， 盐酸硫胺素 1.0 ±0.2 mg/1， 盐酸吡哆素 0.5±0.2mg/l， 肌醇 50±3mg/l， 水解乳蛋白 800±30 mg/1， 酵母浸提物 1000±30 mg/1， NAA 2·0±0·8 mg/1， 2.4-D 3·5±0·3 mg/1， 鹿糖 15000 ± 200 mg/1， 琼脂 9000 ± 200 mg/1， 活性炭 10±2 mg/1， pH 5.5~5.8; 其中，所述铁盐中含有的FeS〇4的摩尔浓度为0.02mol/l。2. 根据权利要求1所述的野栽杂交后代花药愈伤组织诱导培养基，其特征在于，其包括 的组分及其浓度为： KNO3 2810~2850mg/l, (NH4)3SO4 673~713 mg/1， KH2PO4 515~535 mg/1， MgSO4·7Η20 175~195 mg/1， CaCl2 ·2Η20 156~176mg/l， MnSO4 ·4Η20 20.2~24.2mg/l, ZnSO4·7Η20 7.6-8.6 mg/1, Η3ΒΟ3 I·5~2·5mg/l， KI 0.7~0.9mg/l, NaMoO4·2Η20 0.015-0.035 mg/1, CuSO4 ·5Η20 0.015~0.035 mg/1， C〇C12-6H20 0.015~0.035 mg/1， 铁盐 9~llml/L， 甘氨酸 2·0±0·15 mg/1， 丙氯酸 2·0±0·15 mg/1， 赖氨酸 2·0±0·15 mg/1， 烟酸 0·5±0·05 mg/1， 叶酸 0·5±0·05 mg/1， 盐酸硫胺素 1.0 ±0.15 mg/1， 盐酸吡哆素 0·5±0·15 mg/1， 肌醇 50±2·5 mg/1， 水解乳蛋白 800±20 mg/1， 酵母浸提物 1000±20 mg/1， NAA 2·0±0·5 mg/1， 2.4-D 3·5±0·25 mg/1， 鹿糖 15000±100 mg/1， 琼脂 9000 ± 100 mg/1， 活性炭 10±2 mg/1， pH 5.5^5.7〇3.根据权利要求2所述的野栽杂交后代花药愈伤组织诱导培养基，其特征在于:所述铁 盐采用铁盐母液，所述铁盐母液为将5.57g FeS〇4.7H20和7.45g Na-EDTA定容于1000 ml蒸馏 水中得到。
【文档编号】A01H4/00GK105941142SQ201610266275
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年4月26日
【发明人】梁云涛, 陈成斌
【申请人】广西壮族自治区农业科学院水稻研究所