一种提高乌鳢三倍体育成率的方法
【专利摘要】本发明公开了一种提高乌鳢三倍体育成率的方法，包括如下步骤：他莫昔芬喂养料的配备、对乌鳢母本进行投喂他莫昔芬喂养料、冷休克+静水压处理、雌激素抑制剂溶液的配制、取受精卵放入雌激素抑制剂溶液中常温浸泡、取鱼苗投喂氯米芬幼体料、取雄性四倍体作为父本，取普通二倍体作为母本，采用回交的方式获得三倍体。通过此方法，可获得100%的乌鳢三倍体纯系，提高了三倍体的育成率与出苗率，减少了育种与选种的麻烦，更主要的是对自然水产品种种质和生态环境无污染。
【专利说明】
一种提高乌鳢三倍体育成率的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及乌鳢的多倍体繁育方法，具体涉及一种提高乌鳢三倍体育成率的方 法。
【背景技术】
[0002] 乌鳢俗称黑鱼，生性凶猛，繁殖力强，胃口奇大，体色呈灰黑色，生长速度快。三倍 体乌鳢的不育特征，使其在抗逆性、抗病性以及肉质等方面表现出更为显著的优势。现有技 术中，不育三倍体乌鳢是通过四倍体与二倍体倍间杂交获得，但要获得98%以上的三倍体乌 鳢，那么就需要建立遗传稳定、纯度极高的四倍体鱼系。
[0003] 在鱼类遗传育种中，通常利用冷/热休克，或通过杂交等方法抑制受精卵的第一次 有丝分裂或直接异源染色体加倍，制备出同源或异源四倍体鱼，其中冷休克一般是与静水 压处理一起，难以获得较高纯度的四倍体系，而热休克的方式虽然易于操作，同样，难以获 得纯度高的四倍体系;而杂交的方法虽然纯度高，但成功率低、周期长。此外，上述这些方法 制备的四倍体鱼，有些可育、有些又不可育，同时也可能存在基因混杂现象（异源四倍体）， 容易造成生物危险。
【发明内容】
[0004] 针对上述现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种方法稳定的提高乌鳢三 倍体育成率的方法。
[0005] 为达到上述目的，本发明的技术方案如下： 一种提高乌鳢三倍体育成率的方法，包括如下步骤： (1) 他莫昔芬喂养料的配备:取纯度为95%以上的他莫昔芬粉剂，加入到乌鳢人工饲养 饲料中，制成喂养料，其中他莫昔芬含量为15~20g/kg饲料，待用； (2) 投喂:在乌鳢母本产卵前5~10天，按常规饲料投喂方法对乌鳢母本进行投喂他莫 昔分喂养料，每天两次，早上8:00每100g乌體母本投喂15~20g，下午6:00每100g乌體母本 投喂10~15g;至其卵发育成熟，然后，取雄乌鳢放在一起，使其自然产卵交配受精，得受精 卵，备用； (3) 冷休克+静水压处理:在一次卵裂时，采用冷休克与静水压相结合的方法，把步骤 (2)中的受精卵放入温度为-1~I. (TC的冷水中，静水压压力为180~300Kg/cm2,持续时间 为2~3min; (4) 雌激素抑制剂溶液的配制:将氯米芬和睾酮一起溶于80%~90%的乙醇中，再加蒸馏 水配制成雌激素抑制剂溶液，其中雌激素抑制剂溶液中氯米芬的浓度为60~120mg/l，睾酮 的浓度为20~80mg/l; (5) 取步骤(3)处理后的受精卵放入按步骤(4)所制备的雌激素抑制剂溶液中，常温浸 泡10~30s，然后取出放于孵化池中正常孵化，至出苗； (6) 取步骤(5)中的鱼苗，投喂氯米芬幼体料;配比量为每kg幼体料加10~15g氯米芬， 每次投喂量为每万尾20~40g加有氯米芬的幼体料，每天投喂三次，直至变为乌仔苗;从而 获得雄性乌鳢四倍体纯系； (7 )三倍体的获得:取步骤(6 )的雄性四倍体作为父本，取普通二倍体作为母本，采用回 交的方式，获得1 〇〇%三倍体。
[0006] 本发明的优点：1、本发明给母本饲喂他莫昔芬，起到抑制DNA复制和促雄性的双重 作用的同时，将受精卵第一次卵裂时间推延3_5min，并提高了所有受精卵第一次卵裂的同 步度(可达99%)，为染色体加倍和提高其四倍体率提供了时间保障和奠定了坚实基础;2、在 受精卵一次卵裂采用冷休克与较低的静水压(低于常用的350kg/cm 2)，以及较短的处理时 间（低于5min)，不仅有效降低了因为冷休克时间过长、压力过高对受精卵的破坏程度，提高 受精卵的成活率，而且降低了操作难度和加压成本;3、雌激素抑制剂溶液浸泡以及投喂氯 米芬幼体料，有效强化与保证雄性转化率;4、用纯系的雄性四倍体与原有的雌性二倍体回 交，有效保证了三倍体的纯度。因而通过此方法，可获得100%的乌鳢三倍体纯系，提高了三 倍体的育成率与出苗率，减少了育种与选种的麻烦，更主要的是对自然水产品种种质和生 态环境无污染。
【具体实施方式】
[0007] 现结合具体实施例，对本发明作进一步描述。
[0008] 实施例一 提高乌鳢三倍体育成率的方法，包括如下步骤： (1) 他莫昔芬喂养料的配备:取纯度为95%以上的他莫昔芬粉剂，加入到乌鳢人工饲养 饲料中，制成喂养料，其中他莫昔芬含量为15g/kg饲料，待用； (2) 投喂:在乌鳢母本产卵前5天，按常规饲料投喂方法对乌鳢母本进行投喂他莫昔芬 喂养料，每天两次，早上8:00每100g乌體母本投喂20g，下午6:00每100g乌體母本投喂15g; 至其卵发育成熟，然后，取雄乌鳢放在一起，使其自然产卵交配受精，得受精卵，备用； (3) 冷休克+静水压处理:在一次卵裂时，采用冷休克与静水压相结合的方法，把步骤 (2)中的受精卵放入温度为(TC的冷水中，静水压压力为260Kg/cm 2,持续时间为3min; (4) 雌激素抑制剂溶液的配制:将氯米芬和睾酮一起溶于80%的乙醇中，再加蒸馏水配 制成雌激素抑制剂溶液，其中雌激素抑制剂溶液中氯米芬的浓度为60mg/l，睾酮的浓度为 20mg/l； (5) 取步骤(3)处理后的受精卵放入按步骤(4)所制备的雌激素抑制剂溶液中，常温浸 泡30s，然后取出放于孵化池中正常孵化，至出苗； (6) 取步骤(5)中的鱼苗，投喂氯米芬幼体料;配比量为每kg幼体料加15g，每次投喂量 为每万尾40g，每天投喂三次，直至变为乌仔苗;从而获得雄性乌鳢四倍体纯系； (7 )三倍体的获得:取步骤(6 )的雄性四倍体作为父本，取普通二倍体作为母本，采用回 交的方式，获得1 〇〇%三倍体。
[0009] 实施例二 提高乌鳢三倍体育成率的方法，包括如下步骤： (1)他莫昔芬喂养料的配备:取纯度为95%以上的他莫昔芬粉剂，加入到乌鳢人工饲养 饲料中，制成喂养料，其中他莫昔芬含量为20g/kg饲料，待用； (2) 投喂:在乌鳢母本产卵前10天，按常规饲料投喂方法对乌鳢母本进行投喂他莫昔芬 喂养料，每天两次，早上8:00每100g乌體母本投喂20g，下午6:00每100g乌體母本投喂IOg; 至其卵发育成熟，然后，取雄乌鳢放在一起，使其自然产卵交配受精，得受精卵，备用； (3) 冷休克+静水压处理:在一次卵裂时，采用冷休克与静水压相结合的方法，把步骤 (2)中的受精卵放入温度为(TC的冷水中，静水压压力为300Kg/cm2,持续时间为3min; (4) 雌激素抑制剂溶液的配制:将氯米芬和睾酮一起溶于90%的乙醇中，再加蒸馏水配 制成雌激素抑制剂溶液，其中雌激素抑制剂溶液中氯米芬的浓度为l〇〇mg/l，睾酮的浓度为 60mg/l； (5) 取步骤(3)处理后的受精卵放入按步骤(4)所制备的雌激素抑制剂溶液中，常温浸 泡l〇s，然后取出放于孵化池中正常孵化，至出苗； (6) 取步骤(5)中的鱼苗，投喂氯米芬幼体料;配比量为每kg幼体料加10g，每次投喂量 为每万尾20g，每天投喂三次，直至变为乌仔苗;从而获得雄性乌鳢四倍体纯系； (7 )三倍体的获得:取步骤(6 )的雄性四倍体作为父本，取普通二倍体作为母本，采用回 交的方式，获得1 〇〇%三倍体。
[0010]上述两个实施例仅为本发明的优选方案之二，并不能限制本发明的保护范围，任 意与本发明等同或相似的技术手段视为本发明的保护范围。以下附上本发明部分处理方式 及结果统计。
[0011]附：乌鳢三倍体育成结果统计
注：上述结果是在乌鳢母本产卵前10天投喂他莫昔芬，静水压处理3分钟、常温浸泡 l〇s、每万尾投喂氯米芬〇.2g所取得的结果。
【主权项】
1. 一种提高乌鳢三倍体育成率的方法，包括如下步骤： (1) 他莫昔芬喂养料的配备：取纯度为95%以上的他莫昔芬粉剂，加入到乌鳢人工饲养 饲料中，制成喂养料，其中他莫昔芬含量为15~20g/kg饲料，待用； (2) 投喂：在乌鳢母本产卵前5~10天，按常规饲料投喂方法对乌鳢母本进行投喂他莫 昔分喂养料，每天两次，早上8:00每100g乌體母本投喂15~20g，下午6:00每100g乌體母本 投喂10~15g;至其卵发育成熟，然后，取雄乌鳢放在一起，使其自然产卵交配受精，得受精 卵，备用； (3) 冷休克+静水压处理：在一次卵裂时，采用冷休克与静水压相结合的方法，把步骤 (2)中的受精卵放入温度为-1~I. (TC的冷水中，静水压压力为180~300Kg/cm2,持续时间 为2~3min; (4) 雌激素抑制剂溶液的配制:将氯米芬和睾酮一起溶于80%~90%的乙醇中，再加蒸馏 水配制成雌激素抑制剂溶液，其中雌激素抑制剂溶液中氯米芬的浓度为60~120mg/l，睾酮 的浓度为20~80mg/l; (5) 取步骤(3)处理后的受精卵放入按步骤(4)所制备的雌激素抑制剂溶液中，常温浸 泡10~30s，然后取出放于孵化池中正常孵化，至出苗； (6) 取步骤(5)中的鱼苗，投喂氯米芬幼体料;配比量为每kg幼体料加 10~15g氯米芬， 每次投喂量为每万尾20~40g加有氯米芬的幼体料，每天投喂三次，直至变为乌仔苗;从而 获得雄性乌鳢四倍体纯系； (7) 三倍体的获得:取步骤(6)的雄性四倍体作为父本，取普通二倍体作为母本，采用回 交的方式，获得1 〇〇%三倍体。
【文档编号】A01K67/027GK105941332SQ201610497626
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年6月30日
【发明人】杨品红, 谢中国, 王芙蓉
【申请人】湖南文理学院