蛙雄性四倍体纯系高效育成方法
【专利摘要】本发明公开了一种蛙雄性四倍体纯系高效育成方法，包括如下步骤：他莫昔芬喂养料的配备、对母蛙进行投喂他莫昔芬喂养料、冷休克+静水压处理、雌激素抑制剂溶液的配制、取受精卵放入雌激素抑制剂溶液中，正常孵化至出苗成蝌蚪、取蝌蚪，投喂氯米芬幼体料等，通过此方法，可获得100%的蛙雄性四倍体纯系，有效提高了四倍体的育成率及出苗率，相比杂交而言，能获得纯度更高、后代更为稳定的雄性四倍体鱼系，为不育三倍体蛙的育成奠定了坚实的基础。
【专利说明】
蛙雄性四倍体纯系高效育成方法
技术领域
[0001] 本发明涉及蛙的多倍体繁育方法，具体涉及蛙雄性四倍体纯系高效育成方法。
【背景技术】
[0002] 蛙，常见的有虎纹蛙、棘胸蛙等，无尾，善于跳跃，属于两栖动物的蛙科。三倍体蛙 的不育特征，使其在生长速度、抗逆性、抗病性以及肉质等方面表现出更为显著的优势。现 有技术中，要获得三倍体不育蛙，最快捷有效的方法是通过四倍体与二倍体倍间杂交获得， 那么就需要建立遗传稳定、纯度极高的四倍体鱼系。目前为止尚未发现关于蛙雄性四倍体 高效育成的报道。
【发明内容】
[0003] 针对上述现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种方法稳定、种群纯度高 达100%的蛙雄性四倍体纯系高效育成方法。
[0004] 为达到上述目的，本发明的技术方案如下： 蛙雄性四倍体纯系高效育成方法，包括如下步骤： (1) 他莫昔芬喂养料的配备:取纯度为95%以上的他莫昔芬粉剂，加入到蛙人工饲养饲 料中，制成喂养料，其中他莫昔芬含量为20~25g/kg喂养料，待用； (2) 投喂:在母蛙产卵前5~10天，按常规饲料投喂方法对母蛙进行投喂他莫昔芬喂养 料，每天两次，早上8:00每100g母娃投喂10~20g，下午6:00每100g母娃投喂10~15g;至其 卵发育成熟，然后，取雄蛙放在一起，使其自然产卵交配受精，得受精卵，备用； (3) 冷休克+静水压处理:在一次卵裂时，采用冷休克与静水压相结合的方法，把步骤 (2)中的受精卵放入温度为-1~I. (TC的冷水中，静水压压力为180~300Kg/cm2,持续时间 为3~5min; (4) 雌激素抑制剂溶液的配制:将氯米芬和睾酮一起溶于80%~90%的乙醇中，再加蒸馏 水配制成雌激素抑制剂溶液，其中雌激素抑制剂溶液中氯米芬的浓度为80~140mg/l，睾酮 的浓度为20~80mg/l; (5) 取步骤(3)处理后的受精卵放入按步骤(4)所制备的雌激素抑制剂溶液中，常温浸 泡10~30s，然后取出放于孵化池中正常孵化，至出苗成蝌蚪； (6) 取步骤(5)中的蝌抖，投喂氯米芬幼体料;配比量为每kg幼体料加10~15g氯米芬， 投喂量为每1000只投喂10~20g加有氯米芬的幼体料，直至变为幼蛙;从而获得100%雄性蛙 四倍体纯系。
[0005] 本发明的优点：1、本发明中在母本中投喂他莫昔芬，起到抑制DNA复制和促雄性的 双重作用的同时，推延了受精卵第一次卵裂的时间（3-5min)、提高了所有受精卵第一次卵 裂的同步程度(可达99%)，为操作下一步提供时间保障和奠定了染色体加倍的基础;2、在受 精卵一次卵裂采用冷休克与较低的静水压(低于常用的350kg/cm 2)，以及较短的处理时间 (低于5min)，有效减少长时间冷休克和压力对受精卵的破坏作用，提高受精卵的成活率;3、 雌激素抑制剂溶液浸泡，进一步强化了雄性转化率;4、蝌蚪继续投喂氯米芬，再次强化与保 证雄性的转化率。因而通过此方法，可获得100%的蛙雄性四倍体纯系，有效提高了四倍体的 育成率及出苗率，相比杂交而言，能获得纯度更高、后代更为稳定的雄性四倍体鱼系，为不 育三倍体蛙的育成奠定了坚实的基础。
【具体实施方式】
[0006] 现结合具体实施例，对本发明作进一步描述。
[0007] 实施例一 虎纹蛙雄性四倍体纯系高效育成方法，包括如下步骤： (1) 他莫昔芬喂养料的配备:取纯度为95%以上的他莫昔芬粉剂，加入到蛙人工饲养饲 料中，制成喂养料，其中他旲昔芬含量为25g/kg喂养料，待用； (2) 投喂:在母蛙产卵前5天，按常规饲料投喂方法对母蛙进行投喂他莫昔芬喂养料，每 天两次，早上8:00每100g母娃投喂20g，下午6:00每100g母娃投喂IOg;至其卵发育成熟，然 后，取雄蛙放在一起，使其自然产卵交配受精，得受精卵，备用； (3) 冷休克+静水压处理:在一次卵裂时，采用冷休克与静水压相结合的方法，把步骤 (2)中的受精卵放入温度为-1°C的冷水中，静水压压力为260Kg/cm2，持续时间为5min; (4) 雌激素抑制剂溶液的配制:将氯米芬和睾酮一起溶于80%的乙醇中，再加蒸馏水配 制成雌激素抑制剂溶液，其中雌激素抑制剂溶液中氯米芬的浓度为80mg/l，睾酮的浓度为 20mg/l； (5) 取步骤(3)处理后的受精卵放入按步骤(4)所制备的雌激素抑制剂溶液中，常温浸 泡30s，然后取出放于孵化池中正常孵化，至出苗； (6) 取步骤(5)中的蝌蚪，投喂氯米芬幼体料;配比量为每kg幼体料加15g氯米芬，投喂 量为每1000只20g幼体料，直至变为幼蛙;从而获得100%雄性蛙四倍体纯系。
[0008] 实施例二 棘胸蛙雄性四倍体纯系高效育成方法，包括如下步骤： (1) 他莫昔芬喂养料的配备:取纯度为95%以上的他莫昔芬粉剂，加入到蛙人工饲养饲 料中，制成喂养料，其中他旲昔芬含量为20g/kg喂养料，待用； (2) 投喂:在母蛙产卵前10天，按常规饲料投喂方法对母蛙进行投喂他莫昔芬喂养料， 每天两次，早上8:00每100g母娃投喂20g，下午6:00每100g母娃投喂15g;至其卵发育成熟， 然后，取雄蛙放在一起，使其自然产卵交配受精，得受精卵，备用； (3) 冷休克+静水压处理:在一次卵裂时，采用冷休克与静水压相结合的方法，把步骤 (2)中的受精卵放入温度为-1°C的冷水中，静水压压力为300Kg/cm2，持续时间为3min; (4) 雌激素抑制剂溶液的配制:将氯米芬和睾酮一起溶于90%的乙醇中，再加蒸馏水配 制成雌激素抑制剂溶液，其中雌激素抑制剂溶液中氯米芬的浓度为120mg/l，睾酮的浓度为 60mg/l； (5) 取步骤(3)处理后的受精卵放入按步骤(4)所制备的雌激素抑制剂溶液中，常温浸 泡15s，然后取出放于孵化池中正常孵化，至出苗； (6) 取步骤(5)中的蝌蚪，投喂氯米芬幼体料;配比量为每kg幼体料加10g，投喂量为每 1000只IOg幼体料，直至变为幼蛙;从而获得100%雄性蛙四倍体纯系。
[0009]上述两个实施例仅为本发明的优选方案之二，并不能限制本发明的保护范围，任 意与本发明等同或相似的技术手段视为本发明的保护范围。以下附上本发明部分处理方式 及结果统计。
[0010]附：蛙雄性四倍体育成结果统计
注:上述结果是在母蛙产卵前10天投喂他莫昔芬，静水压处理3分钟，雌激素抑制剂常 温浸泡15s，每万尾投喂氯米芬0.3g所取得的结果。
【主权项】
1.蛙雄性四倍体纯系高效育成方法，包括如下步骤： (1) 他莫昔芬喂养料的配备：取纯度为95%以上的他莫昔芬粉剂，加入到蛙人工饲养饲 料中，制成喂养料，其中他莫昔芬含量为20~25g/kg喂养料，待用； (2) 投喂：在母蛙产卵前5~10天，按常规饲料投喂方法对母蛙进行投喂他莫昔芬喂养 料，每天两次，早上8:00每100g母娃投喂10~20g，下午6:00每100g母娃投喂10~15g;至其 卵发育成熟，然后，取雄蛙放在一起，使其自然产卵交配受精，得受精卵，备用； (3) 冷休克+静水压处理：在一次卵裂时，采用冷休克与静水压相结合的方法，把步骤 (2)中的受精卵放入温度为-1~I. (TC的冷水中，静水压压力为180~300Kg/cm2,持续时间 为3~5min; (4) 雌激素抑制剂溶液的配制:将氯米芬和睾酮一起溶于80%~90%的乙醇中，再加蒸馏 水配制成雌激素抑制剂溶液，其中雌激素抑制剂溶液中氯米芬的浓度为80~140mg/l，睾酮 的浓度为20~80mg/l; (5) 取步骤(3)处理后的受精卵放入按步骤(4)所制备的雌激素抑制剂溶液中，常温浸 泡10~30s，然后取出放于孵化池中正常孵化，至出苗成蝌蚪； (6) 取步骤(5)中的蝌抖，投喂氯米芬幼体料;配比量为每kg幼体料加10~15g氯米芬， 投喂量为每1000只投喂10~20g加有氯米芬的幼体料，直至变为幼蛙;从而获得100%雄性蛙 四倍体纯系。
【文档编号】A01K67/027GK105941333SQ201610499246
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年6月30日
【发明人】杨品红, 谢中国, 王芙蓉
【申请人】湖南文理学院