一种仙鹤草的快速繁殖方法
【专利摘要】本发明一种仙鹤草的快速繁殖方法，剪取无病虫害、粗壮的当年生枝条作为外植体，对外植体进行消毒，将已消毒外植体接种到培养基中，培养5?7天，当初代培养上的腋芽萌发长到2?3cm以后，将腋芽从外植体上剪切下来，转接到第一继代培养基中进行增殖，继代3?5次后，转入第二继代培养基中培养，将继代培养得到的叶长3~6cm、具有2~5片叶的健壮小苗转接入生根培养基中，当根生长到1?3cm出苗时，进行炼苗移栽，先将培养瓶移至大棚，在自然条件下炼苗4~10天，然后将炼苗完成的小苗从培养瓶中取出，洗净小苗根部附着的培养基，再用适乐时溶液浸根，取出后移栽至栽培介质中。本发明提高了仙鹤草的移栽成活率，达到92?95%。
【专利说明】
一种仙鹤草的快速繁殖方法
技术领域
[0001]
本发明属于植物学领域，尤其涉及一种植物的组织培养技术，特别涉及一种仙鹤草，具体来说是一种仙鹤草的快速繁殖方法。
[0002]
【背景技术】
[0003]仙鹤草(Jgriff1fiia pi1sa)为蔷薇科龙牙草属，多年生草本植物，高50-120 cm，主产于浙江、江苏、湖北、黑龙江等地。由于仙鹤草具有较强的生物活性，多年来国内外学者对其化学成分和药理作用进行了研究。研究表明，仙鹤草中含有黄酮、鞣质、糖苷、有机酸、挥发油、三萜皂苷等化学成分，具有抗肿瘤、降血糖、镇痛抗炎、止血、抗心律失常等多方面的药理作用。随着对仙鹤草药理及临床研究的不断深入，新用途不断地被发掘出来，使用量也逐步增加。另外，仙鹤草在日常生活中还可用来泡茶及作为野菜食用。
[0004]仙鹤草适应性、抗逆性较强，在林下、路边、沟边均能生长，适宜生长温度为15-20°C。目前，仙鹤草仍处于野生分布状态，但随着中药、茶饮、食用等消费需求的增长，规模化人工栽培势在必行。仙鹤草主要采用播种和分株繁殖，繁殖速度慢，在短期内很难生产出大量的种苗，而组织培养方法能解决上述难题。周禄斌等采用仙鹤草种子作为外植体，筛选出了愈伤组织诱导、增殖及高含量总黄酮的最佳培养条件。但上述现有技术主要公开了利用组织培养技术进行药用植物次生代谢产物(黄酮类)生产方面的内容，目前还没有公开从种苗生产角度进行组织培养的具体操作条件。
[0005]
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种仙鹤草的快速繁殖的方法，所述的这种仙鹤草的快速繁殖的方法解决了现有技术中的仙鹤草繁殖速度慢的技术问题。
[0007]本发明一种仙鹤草的快速繁殖方法，包括如下步骤:
1)一个选择外植体的步骤，于4-5月间，剪取无病虫害、粗壮的当年生枝条作为外植体，去掉植物叶片；
2)一个消毒的步骤，将洗洁精涂在植物茎干表面，用纱布擦洗，然后用自来水反复清洗至无泡沫，重复上述清洗步骤2~5次，最后流水冲洗3-5h，在超净工作台上先将枝条截成1.5?3.5cm的带芽茎段，放入一个容器中，然后用质量百分比浓度为60?80%的酒精浸泡20?50s，无菌水冲洗，最后用质量百分比浓度为0.0.5-0.15%升汞消毒8-12min，无菌水冲洗4?8次；
3)—个初代培养的步骤，将上述的已消毒外植体接种到培养基中，每瓶接一个，培养5-7天后腋芽开始生长，所述的接种培养基为MS培养基，在所述的MS培养基中还添加有6-苄氨基腺嘌呤和萘乙酸，所述的6-苄氨基腺嘌呤在培养基中的浓度为2.0-1.5mg/L，所述的萘乙酸在培养基中的浓度为0.1 mg/L;
4)一个继代培养的步骤，当初代培养上的腋芽萌发长到2-3cm以后，将腋芽从外植体上剪切下来，转接到第一继代培养基中进行增殖，第一继代培养基为MS培养基，在MS培养基中还添加有6-苄氨基腺嘌呤和萘乙酸，所述的6-苄氨基腺嘌呤在培养基中的浓度为0.1 -
0.2mg/L，所述的萘乙酸在培养基中的浓度为0.1 mg/L;继代3-5次后，转入第二继代培养基中培养，所述的第二继代培养基为MS培养基，在MS培养基中还添加有6-苄氨基腺嘌呤和萘乙酸，所述的6-苄氨基腺嘌呤在培养基中的浓度为0.05 mg/L，所述的萘乙酸在培养基中的浓度为0.1 mg/L；
5)—个生根培养的步骤，将继代培养得到的叶长3~6cm、具有2?5片叶的健壮小苗转接入生根培养基中，所述的生根培养基为1/2MS培养基，在MS培养基中还添加有萘乙酸，所述的萘乙酸在培养基中的浓度为0.05-0.1 mg/L，15-20天生根，当根生长到l-3cm出苗时，进行炼苗移栽；
6)—个炼苗移栽的步骤，先将培养瓶移至大棚，在自然条件下炼苗4?10天，然后将炼苗完成的小苗从培养瓶中取出，洗净小苗根部附着的培养基，再用100ppm的适乐时溶液浸根3?8min，取出后移栽至栽培介质中，所述的栽培介质由草炭和珍珠岩组成，所述的草炭和珍珠岩的质量比为3:1，用塑料薄膜覆盖保湿，相对湿度控制在70-80%，5?9天以后逐渐降低湿度至20?30%，移栽期间遮阴40?60%，温度控制在15-25 0C。
[0008]进一步的，所述的接种培养基中还添加有琼脂和蔗糖，所述的琼脂在培养基中的浓度为7g/L，所述的蔗糖在培养基中的浓度为30g/L，所述的培养基的PH值在5.8-5.9之间。
[0009]进一步的，所述的第一继代培养基中还添加有琼脂和蔗糖，所述的琼脂在培养基中的浓度为7g/L，所述的蔗糖在培养基中的浓度为30g/L，所述的培养基的PH值在5.8-5.9之间。
[0010]进一步的，所述的第二继代培养基中还添加有琼脂和蔗糖，所述的琼脂在培养基中的浓度为7g/L，所述的蔗糖在培养基中的浓度为30g/L，所述的培养基的PH值在5.8-5.9之间。
[0011]进一步的，所述的生根培养基中还添加有琼脂和蔗糖，所述的琼脂在培养基中的浓度为7g/L，所述的蔗糖在培养基中的浓度为30g/L，所述的培养基的PH值在5.8-5.9之间。
[0012]进一步的，在初代培养、继代培养和生根培养的步骤中，培养的温度为23±1°C，14~18h/d的光周期，光照强度为1800?2200LUX。
[0013]上述的MS培养基和1/2MS培养基均为本领域的技术领域熟知的常规培养基，再次不再赘述。
[0014]本发明以茎段作为外植体，能保持仙鹤草具有较强的生物活性。同时选择春季萌发后的枝条进行初代培养的外植体，一方面能提高茎段腋芽的萌发率，另一方面也能降低外植体的污染率。在继代过程中，继代次数超过3代后，逐渐降低培养基的激素浓度有利于防止植株玻璃化。生根培养时，将增殖后的丛生苗分成每丛2-3个芽，能增加植物的生根能力。生根后及时进彳丁苗木移栽，能提尚移栽成活率。
[0015]本发明的培养基针对的外植体为仙鹤草茎段，同时在继代增殖培养过程中，通过前期适当提高激素浓度以增加仙鹤草的增殖系数，对具有2-3个芽的丛生苗进行生根培养，经过炼苗以提高仙鹤草的移栽成活率，达到92-95%。
[0016]本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明利用仙鹤草茎段作为外植体，容易获得无菌苗，实验操作简单易行;仙鹤草主要的繁殖方式为分株繁殖，整个生长过程较长且繁殖系数较低，通过不同生长激素达到仙鹤草组培快速繁殖方式，能有效在短期内获得大量优质的仙鹤草种苗。
【具体实施方式】
[0017]实施例1
4月，剪取无病虫害、粗壮的当年生枝条作为外植体，去掉植物叶片，将洗洁精涂在植物茎干表面，用纱布轻轻擦洗，然后用自来水反复清洗至基本无泡沫，重复上述清洗步骤3次，最后流水冲洗3h。在超净工作台上先将枝条截成2cm左右的带腋芽茎段，然后用75%酒精浸泡30s，无菌水冲洗一次，再用0.1%升汞消毒8min，无菌水冲洗6次。将上述的已消毒外植体接种到培养基中，每瓶接一个，培养5天后开始生长，所述接种培养基为MS + 6-BA1.5mg/L+ NAA0.1 mg/L。当初代培养上的茎段腋芽萌发长到2-3cm以后，将腋芽从外植体上剪切下来，转接到第一继代培养基中进行增殖，第一继代培养基为MS + 6-BA0.1 mg/L + NAA0.1mg/L。继代5次后，转入第二继代培养基中培养，第二继代培养基为MS + 6-BA0.05 mg/L +NAA0.1 mg/L。将继代培养得到的叶长3cm以上、具有4片叶的健壮小苗转接入生根培养基中，生根培养基为1/2MS+NAA0.05 mg/L，20天生根，当根生长到l_3cm出苗时，进行炼苗移栽。各培养基中添加琼脂为7g/L，蔗糖30g/L，PH值调节为5.8-5.9;培养条件为培养温度23± 1°C，16h/d的光周期，光照强度2000LUX左右。
[0018]将培养瓶移至大棚，在自然条件下炼苗7天，然后将炼苗完成的小苗从培养瓶中取出，洗净小苗根部附着的培养基，再用100ppm的适乐时溶液浸根5min，取出后移栽至栽培介质(草炭:珍珠岩比例为3:1)中。用塑料薄膜覆盖保湿，相对湿度控制在70-80%，7天以后逐渐降低湿度，移栽期间遮荫50%左右，温度15-25°C，移栽成活率为92%。
[0019]
实施例2
5月，剪取无病虫害、粗壮的当年生枝条作为外植体;去掉植物叶片，将洗洁精涂在植物茎干表面，用纱布轻轻擦洗，然后用自来水反复清洗至基本无泡沫，重复上述清洗步骤3次；最后流水冲洗5h。在超净工作台上先将枝条截成2cm左右的带腋芽茎段，然后用75%酒精浸泡30s，无菌水冲洗一次，再用0.1%升汞消毒12min，无菌水冲洗6次。将上述的已消毒外植体接种到培养基中，每瓶接一个，培养7天后开始生长，所述接种培养基为MS + 6-BA2.0mg/L+ NAA0.1 mg/L。当初代培养上的茎段腋芽萌发长到2-3cm以后，将腋芽从外植体上剪切下来，转接到第一继代培养基中进行增殖，第一继代培养基为MS + 6-BA0.2mg/L + NAA0.1mg/L。继代3次后，转入第二继代培养基中培养，第二继代培养基为MS + 6-BA0.05 mg/L +NAA0.1 mg/L。将继代培养得到的叶长3cm以上、具有4片叶的健壮小苗转接入生根培养基中，生根培养基为1/2MS+NAA0.lmg/L，15天生根，当根生长到l_3cm出苗时，进行炼苗移栽。各培养基中添加琼脂为7g/L，蔗糖30g/L，PH值调节为5.8-5.9;培养条件为培养温度23 土 I°C，16h/d的光周期，光照强度2000LUX左右。
[0020]将培养瓶移至大棚，在自然条件下炼苗7天，然后将炼苗完成的小苗从培养瓶中取出，洗净小苗根部附着的培养基，再用100ppm的适乐时溶液浸根5min，取出后移栽至栽培介质(草炭:珍珠岩比例为3:1)中。用塑料薄膜覆盖保湿，相对湿度控制在70-80%，7天以后逐渐降低湿度，移栽期间遮荫50%左右，温度15-25°C，移栽成活率为95%。
【主权项】
1.一种仙鹤草的快速繁殖方法，其特征在于包括如下步骤: 1)一个选择外植体的步骤，于4-5月间，剪取无病虫害、粗壮的当年生枝条作为外植体，去掉植物叶片； 2)—个消毒的步骤，将洗洁精涂在植物茎干表面，用纱布擦洗，然后用自来水反复清洗至无泡沫，重复上述清洗步骤2~5次，最后流水冲洗3-5h，在超净工作台上先将枝条截成1.5?3.5cm的带芽茎段，放入一个容器中，然后用质量百分比浓度为60?80%的酒精浸泡20?50s，无菌水冲洗，最后用质量百分比浓度为0.0.5-0.15%升汞消毒8-12min，无菌水冲洗4?8次； 3)—个初代培养的步骤，将上述的已消毒外植体接种到培养基中，每瓶接一个，培养5-7天后腋芽开始生长，所述的接种培养基为MS培养基，在所述的MS培养基中还添加有6-苄氨基腺嘌呤和萘乙酸，所述的6-苄氨基腺嘌呤在培养基中的浓度为2.0-1.5mg/L，所述的萘乙酸在培养基中的浓度为0.1 mg/L; 4)一个继代培养的步骤，当初代培养上的腋芽萌发长到2-3cm以后，将腋芽从外植体上剪切下来，转接到第一继代培养基中进行增殖，第一继代培养基为MS培养基，在MS培养基中还添加有6-苄氨基腺嘌呤和萘乙酸，所述的6-苄氨基腺嘌呤在培养基中的浓度为0.1 -0.2mg/L，所述的萘乙酸在培养基中的浓度为0.1 mg/L;继代3-5次后，转入第二继代培养基中培养，所述的第二继代培养基为MS培养基，在MS培养基中还添加有6-苄氨基腺嘌呤和萘乙酸，所述的6-苄氨基腺嘌呤在培养基中的浓度为0.05 mg/L，所述的萘乙酸在培养基中的浓度为0.1 mg/L； 5)—个生根培养的步骤，将继代培养得到的叶长3?6cm、具有2?5片叶的健壮小苗转接入生根培养基中，所述的生根培养基为1/2MS培养基，在MS培养基中还添加有萘乙酸，所述的萘乙酸在培养基中的浓度为0.05-0.1 mg/L，15-20天生根，当根生长到l-3cm出苗时，进行炼苗移栽； 6)—个炼苗移栽的步骤，先将培养瓶移至大棚，在自然条件下炼苗4?10天，然后将炼苗完成的小苗从培养瓶中取出，洗净小苗根部附着的培养基，再用100ppm的适乐时溶液浸根3?8min，取出后移栽至栽培介质中，所述的栽培介质由草炭和珍珠岩组成，所述的草炭和珍珠岩的质量比为3:1，用塑料薄膜覆盖保湿，相对湿度控制在70-80%，5?9天以后逐渐降低湿度至20?30%，移栽期间遮阴40?60%，温度控制在15-25 0C。2.根据权利要求1所述的一种仙鹤草的快速繁殖方法，其特征在于:所述的MS培养基中还添加有琼脂和蔗糖，所述的琼脂在培养基中的浓度为7g/L，所述的蔗糖在培养基中的浓度为30g/L，所述的培养基的PH值在5.8-5.9之间。3.根据权利要求1所述的一种仙鹤草的快速繁殖方法，其特征在于:在初代培养、继代培养和生根培养的步骤中，培养的温度为23 ± TC，14?18h/d的光周期，光照强度为1800?2200Luxo
【文档编号】A01H4/00GK105961202SQ201610354404
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月26日
【发明人】罗玉兰, 朱春玲, 张冬梅, 沈烈英
【申请人】上海市园林科学规划研究院