一种蝉花的人工培养方法
【专利摘要】本发明涉及一种蝉花的人工培养方法，该方法包括如下步骤：步骤1，蝉花菌种通过液体培养进行扩增；步骤2，将步骤1扩增后的菌种接种到固体培养基中进行固体培养，其中所述固体培养基中加入L-硒-甲基硒代半胱氨酸；步骤3，对孢梗束进行采收；其中，L-硒-甲基硒代半胱氨酸的加入量为0.004-0.04％。本发明人工培养方法采用在蝉花培养基中添加定量的L-硒甲基硒代半胱氨酸，通过微生物转化后，制成富硒蝉花，所得产品中有机硒和多糖的含量高，食用安全、方便，可满足各类人群的补硒要求。
【专利说明】
_种蝉花的人工培养方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种蝉花的人工培养方法，具体涉及一种利用L-硒甲基硒代半胱氨 酸人工培养蝉花的方法。
【背景技术】
[0002] 蝴花（Isaria cicadae Miquel)属于真菌界（FUNGI)的子囊菌门（Ascomycot)、 盘菌亚门（Pezizomycotina)、奠壳菌纲（Sordariomycetes)、肉座菌目（Hypocreales)、虫 草科（Cordycipitaceae)、棒束孢属（Isaria)，是我国名贵的中药材，是寄生在蝴（俗称"知 了"）上的一种虫草菌。其药用已有1000多年历史，是我国传统的名贵药材之一，具有多方 面的药用价值。主要成分有腺苷、虫草多糖、虫草酸（甘露醇）、虫草素、尿嘧啶、留醇、生物 碱、维生素、无机盐、矿物质元素等。蝉花具有独特而广泛的功效，如改善肾功能，抗肿瘤，调 节免疫系统，滋补强壮，提高细胞能力、抗疲劳，降血压、血糖，解热、镇痛、改善睡眠，改善脂 质代谢，促进造血，抗真菌，抗衰老等。
[0003] 微量元素硒具有抗癌抗肿瘤以及提高机体免疫力，抗氧化保护心血管、提高红细 胞的携氧能力、拮抗和降低某些有毒元素及物质的毒性、保护视器官的健全功能等保健作 用。
[0004] 蝉花对硒的转化率较高，且人体对真菌类有机硒的利用率较高，可以达到 70% -90%。在蝉花的培养料中加入一定量的硒能够提高子实体的产量并且能够提高蝉花 中有效成分的含量。使得富硒蝉花成为一种极具开发潜质的具有优良功效的保健食品。现 有技术培养富硒真菌多是在培养基中添加无机硒如亚硒酸钠（中国专利CN 103371044A、 CN 103190291A、CN 103070011A)或有机硒如富硒食用菌粉（CN 102219601A)。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种蝉花的人工培养方法。
[0006] 本发明的另一个目的在于提供一种用于培养蝉花的固体培养基。
[0007] 本发明的目的是通过如下方案实现的：
[0008] -种蝉花的人工培养方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
[0009] 步骤1，蝉花菌种通过液体培养进行扩增；
[0010] 步骤2,将步骤1扩增后的菌种接种到固体培养基中进行固体培养，其中所述固体 培养基中加入L-硒-甲基硒代半胱氨酸；
[0011] 步骤3，对孢梗束进行采收。
[0012] 进一步，步骤2中所述L-硒-甲基硒代半胱氨酸的加入量为0.004-0. 04% ;更 进一步，加入量为〇· 008-0. 035% ;更进一步，加入量为0· 02-0. 035% ;更进一步，加入量为 0.03-0. 035%;其中，所述百分比为L-硒-甲基硒代半胱氨酸占固体培养基重量的百分比。
[0013] 进一步，步骤2中所述固体培养基为本领域常规固体培养基，如谷物培养基，农作 物秸杆培养基，农作物皮壳培养基，经济林木树枝培养基，植物茎杆培养基等；其中优选谷 物培养基；所述谷物可选自小麦、玉米、大米、小米、黄豆粉、荞麦、大麦、燕麦、糙米、粳米中 的任意一种或几种。
[0014] 进一步，步骤2接种量为5% -15% ;更进一步，接种量为5-10% ;更进一步优选为 7%。
[0015] 进一步，步骤2固体培养过程中，在菌丝体生长阶段采用遮光培养，培养温度 22-24Γ ;从孢梗束始发至采收阶段采用光照培养，培养温度为20-22Γ ;培养过程中相对湿 度为60-70% ;更进一步，孢梗束始发时保证光照强度为100-200LX。
[0016] 本发明步骤1所述液体培养过程以菌种扩增为目的，可采用常规的菌种扩培方 法，包括斜面培养、摇瓶培养、种子罐培养、发酵罐培养中的任意一种或几种方法的组合；所 用培养基为本领域常规的液体培养基，如PSA培养基或酵母浸出粉-复合氨基酸-蔗糖培 养基，酵母浸出粉-白砂糖-大豆水解蛋白培养基，麸皮煮汁-白砂糖培养基等；进一步优 选为PSA培养基或酵母浸出粉-复合氨基酸-蔗糖培养基；更进一步，PSA培养基各成分比 例为：马铃薯15-25 %、蔗糖1-5 %、琼脂1-5% ;酵母浸出粉-复合氨基酸-蔗糖培养基各 成分比例为：酵母浸出粉0.5-2%、复合氨基酸0.2-1%、蔗糖2-5%。更进一步，PSA培养 基各成分比例为：马铃薯20%、蔗糖2%、琼脂2%;酵母浸出粉-复合氨基酸-蔗糖培养基 各成分比例为：酵母浸出粉1 %、复合氨基酸0. 5%、蔗糖3. 5%。
[0017] 本发明还提供了 一种蝉花固体培养基，其特征在于，所述固体培养基中加入 L-硒-甲基硒代半胱氨酸。
[0018] 进一步，所述L-硒-甲基硒代半胱氨酸的加入量为0.004-0. 04% ;更进一 步，加入量为0.008-0. 035 % ;更进一步，加入量为0.02-0. 035 % ;更进一步，加入量为 0.03-0. 035%;其中，所述百分比为L-硒-甲基硒代半胱氨酸占固体培养基重量的百分比。
[0019] 进一步，所述固体培养基为本领域常规固体培养基，如谷物培养基，农作物秸杆培 养基，农作物皮壳培养基，经济林木树枝培养基，植物茎杆培养基等；其中优选谷物培养基； 所述谷物可选自小麦、玉米、大米、小米、黄豆粉、荞麦、大麦、燕麦、糙米、粳米中的任意一种 或几种。
[0020] 本发明中所用蝴花（Isaria cicadae Miquel)是广布种，广泛分布在我国秦 岭-淮河以南的18个省、市、区。在我国长江以南的亚热带和热带地区，且多在低洼地带 及滇藏高原的金沙江、怒江、澜沧江和雅鲁藏布江等河谷地带。只要在其生长季节，每年的 6-8月，按照一般中药材的采集方法都可采到，是现有技术中已知菌种，并可以从商业途径 购买获得。本发明优选CN102851353A公开的蝴拟青霉菌株[Paecilomyces cicadae(Miq.) Samson]，已于2009年11月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简 称CGMCC)注册保藏，保藏号为CGMCC No. 3453。
[0021] 本发明人工培养方法采用在蝉花固体培养基中添加定量的L-硒甲基硒代半胱氨 酸，通过微生物转化后，制成富硒蝉花，所得产品中有机硒和多糖的含量高，食用安全、方 便，可满足各类人群的补硒要求。
【具体实施方式】：
[0022] 实施例1蝉花菌种的扩大培养
[0023] 斜面培养：将蝉花菌种接种于斜面试管中，再将接种菌种的斜面试管放入22°C培 养箱，培养时间为7天，待菌丝长满试管；
[0024] 摇瓶培养：在500ml三角瓶中装入200ml液体培养基，在0· IlMpa压力下高压灭菌 30分钟，待冷却至室温，将1支斜面试管的菌种接种到500ml三角瓶培养基上，并置于恒温 振荡培养箱，温度22±1°C，150转/分钟条件下培养，培养时间为3天；
[0025] 种子罐培养：在50L气升式发酵罐中装入20L液体培养基，培养基温度大于95°C， 加入食用消泡剂，加入量为培养基重量的0.03%，在0.1 lMpa压力下，通入蒸汽加热到 121 °C，并保压30-45分钟；灭菌后，冷却至20°C时，将4瓶上述培养好的500ml摇瓶菌种接 入培养基，培养温度为22±1°(：，通气量为1 :0.5￥/^1^11，保压4.903-7.0845\104?3，经3 天通气培养，达到对数生长期后即可，终培养体积为20L ;
[0026] 发酵罐培养：在500L气升式发酵罐中装入200L液体培养基，培养基温度大于 95°C，加入食用消泡剂，加入量为培养基重量的0. 03%，在0.1 lMpa压力下，通入蒸汽加热 到121°C，并保压30-45分钟；灭菌后，冷却至20°C时，将上述培养好的200L种子罐种子全 部接入培养，培养温度为22 ± I °C，通气量为I :0. 5V/V min，保压4. 903-7. 0845 X IO4Pa,经 3天通气培养，达到对数生长期后即可。终培养体积为200L。
[0027] 斜面试管培养基：每1升液体含有200克土豆煮汁，20克蔗糖，20克琼脂，余补水 至1000毫升，pH值为6.5 ;
[0028] 摇瓶、种子罐及发酵罐中的液体培养基：含有酵母浸出粉1%，复合氨基酸0. 5%， 白砂糖3. 5%，余量补水至100%，pH值为6. 5。
[0029] 实施例2蝉花菌种的扩大培养
[0030] 斜面培养：将蝉花菌种接种于斜面试管中，再将接种菌种的斜面试管放入22°C培 养箱，培养时间为7天，待菌丝长满试管；
[0031] 摇瓶培养：在500ml三角瓶中装入200ml液体培养基，在0· IlMpa压力下高压灭菌 30分钟，待冷却至室温，将1支斜面试管的菌种接种到500ml三角瓶培养基上，并置于恒温 振荡培养箱，温度22±1°C，150转/分钟条件下培养，培养时间为3天；
[0032] 种子罐培养：在50L气升式发酵罐中装入20L液体培养基，培养基温度大于 95°C，加入食用消泡剂，加入量为培养基重量的0. 03%，在0.1 lMpa压力下，通入蒸汽加热 到 121 °C，并保压30-45分钟；灭菌后，冷却至20°C时，将4瓶上述培养好的500ml摇瓶菌种 接入培养基，培养温度为22±1°(：，通气量为1 :0.5￥/￥1^11，保压4.903-7.0845\104?3，经 3天通气培养，达到对数生长期后即可，终培养体积为20L。
[0033] 斜面试管培养基：每1升液体含有200克土豆煮汁，20克蔗糖，20克琼脂，余补水 至1000毫升，pH值为6.5 ;
[0034] 摇瓶及种子罐培养基：每1升液体含有30克酵母浸出粉，30克白砂糖，5克大豆水 解蛋白，加水补至1000毫升，pH值为6. 5。
[0035] 实施例3蝉花菌种的扩大培养
[0036] 斜面培养：将分离纯化的菌种接种于斜面试管中，再将接种菌种的斜面试管放入 22°C培养箱，培养时间为7天，待菌丝长满试管；
[0037] 种子罐培养：在50L气升式种子罐中装入20L液体培养基，培养基温度大于95°C， 加入食用消泡剂，加入量为培养基重量的0.03%，在0.1 lMpa压力下，通入蒸汽加热到 121°C，并保压30-45分钟；灭菌后，冷却至20°C时，将4支斜面试管的菌种接入培养基，培 养温度为22 ± I °C，通气量为I :0. 5V/V min，保压4. 903-7. 0845 X 104Pa，经3天通气培养， 达到对数生长期后即可，终培养体积为20L。
[0038] 发酵罐培养：在500L气升式发酵罐中装入200L液体培养基，培养基温度大于 95°C，加入食用消泡剂，加入量为培养基重量的0. 03%，在0.1 lMpa压力下，通入蒸汽加热 到121°C，并保压30-45分钟；灭菌后，冷却至20°C时，将上述培养好的200L种子罐种子全 部接入培养，培养温度为22 ± I °C，通气量为I :0. 5V/V min，保压4. 903-7. 0845 X IO4Pa,经 3天通气培养，达到对数生长期后即可。终培养体积为200L。
[0039] 斜面试管培养基：每1升液体含有200克土豆煮汁，20克蔗糖，20克琼脂，余补水 至1000毫升，pH值为6.5 ;
[0040] 种子罐及发酵罐培养基：每1升液体含有40克麸皮煮汁，30克白砂糖，余补水至 1000毫升，pH值为6. 5。
[0041 ] 实施例4固体发酵培养
[0042] 固体培养基的制备：将小麦清洗控水后，加入适量的水，其重量比为小麦：水为1 : 1. 4,混合均匀；按照小麦重量0. 03%的量加入L-硒-甲基硒代半胱氨酸，拌匀后装入密封 的聚丙烯盒子中（盒子上方盖打孔，孔上贴中有透气膜）；将装好培养基的培养容器放置灭 菌锅内，121°C下灭菌30-50min ;灭菌后，培养容器移置缓冲室内，自然冷却至24°C以下移 置接种室内。
[0043] 接种：接种前培养容器先在超净工作台或百级层流罩内（下）用紫外光照射 0. 5h ;每个培养容器按7%的接种量接种实施例1得到的菌种，接种后的容器放入培养室培 养。
[0044] 培养条件：培养室温度为22_24°C，空气相对湿度65% -70% ;首先要将培养室遮 光，使发菌室基本黑暗。待菌丝体长满料面时（室内培养3~5天），转入光照培养。接种 后定期检查，及时剔除生长势差、感染杂菌的培养容器。此后为诱导形成孢梗束时期，保持 培养室温度为20-22°C，相对空气湿度65 %~70 %，保证有散射光（IOOLx~200Lx)诱导孢 梗束形成。培养室要适时通风换气，保持发菌室空气新鲜。
[0045] 采收及处理：当孢梗束成熟，尚未大量产生孢子时（约25~28天），及时采收；采 收后的孢梗束（富含硒）在相对湿度45% -50%的除湿间除湿40h-50h，进入烘干室准备 烘干。烘箱设置温度60°C，干燥时间8h-10h。干燥结束后装入PE袋中，扎口放置阴凉干燥 处。干燥结束测定孢梗束（富含硒）水分，其应< 6%。
[0046] 实施例5固体发酵培养
[0047] 固体培养基的制备：将大米清洗控水后，加入适量的水，其重量比为大米：水为1 : 1. 3,混合均匀；按照大米重量0. 04%的量加入L-硒-甲基硒代半胱氨酸，拌匀后装入密封 的聚丙烯盒子中（盒子上方盖打孔，孔上贴中有透气膜）；将装好培养基的培养容器放置灭 菌锅内，121°C下灭菌30-50min ;灭菌后，培养容器移置缓冲室内，自然冷却至24°C以下移 置接种室内。
[0048] 接种：接种前培养容器先在超净工作台或百级层流罩内（下）用紫外光照射 0. 5h ;每个培养容器按5%的接种量接种实施例2得到的菌种，接种后的容器放入培养室 培养。
[0049] 培养条件和采收同实施例4。
[0050] 实施例6固体发酵培养
[0051] 固体培养基的制备：将糙米清洗控水后，加入适量的水，其重量比为糙米：水为1 : 1. 5,混合均匀；按照糙米重量0. 02%的量加入L-硒-甲基硒代半胱氨酸，拌匀后装入密封 的聚丙烯盒子中（盒子上方盖打孔，孔上贴中有透气膜）；将装好培养基的培养容器放置灭 菌锅内，121°C下灭菌30-50min ;灭菌后，培养容器移置缓冲室内，自然冷却至24°C以下移 置接种室内。
[0052] 接种：接种前培养容器先在超净工作台或百级层流罩内（下）用紫外光照射 0. 5h ;每个培养容器按15%的接种量接种实施例3得到的菌种，接种后的容器放入培养室 培养。
[0053] 培养条件和采收同实施例4。
[0054] 实施例7固体发酵培养
[0055] 固体培养基的制备：将小米清洗控水后，加入适量的水，其重量比为小米：水为1 : 1. 3,混合均匀；按照小米重量0. 035%的量加入L-硒-甲基硒代半胱氨酸，拌匀后装入密 封的聚丙烯盒子中（盒子上方盖打孔，孔上贴中有透气膜）；将装好培养基的培养容器放置 灭菌锅内，121°C下灭菌30-50min ;灭菌后，培养容器移置缓冲室内，自然冷却至24°C以下 移置接种室内。
[0056] 接种：接种前培养容器先在超净工作台或百级层流罩内（下）用紫外光照射 0. 5h ;每个培养容器按10%的接种量接种实施例1得到的菌种，接种后的容器放入培养室 培养。
[0057] 培养条件和采收同实施例4。
[0058] 实施例8固体发酵培养
[0059] 固体培养基的制备：玉米芯69%、棉籽壳16%、木肩11%、石膏3%、石灰1%，固 体物料：水=I :1. 5 (视原料含水量而定），按照物料重量0. 004%的量加入L-硒-甲基硒 代半胱氨酸，
[0060] 接种：接种前培养容器先在超净工作台或百级层流罩内（下）用紫外光照射 0. 5h ;每个培养容器按10%的接种量接种实施例2得到的菌种，接种后的容器放入培养室 培养。
[0061 ] 培养条件和采收同实施例4。
[0062] 实施例9硒添加量对菌丝生长及孢梗束有效成分含量影响
[0063] 按实施例1、4的方法对蝉花进行液体和固体发酵培养，其中实施例4固体发酵培 养基按表1添加不同量的亚硒酸钠和L-硒-甲基硒代半胱氨酸（其他培养条件同实施例 4)，考察不同类型的硒源和不同添加量对孢梗束生长的影响和孢梗束有效成分含量。结果 见表1。
[0064] 表1不同硒源及添加量对菌丝生长及有效成分含量的影响
[0065]
[0066] 注：HEA即N6-(2_羟乙基）腺苷，又名茧草菌素，是虫草的特有成分，已作为虫草 制品的质量控制指标之一。
[0067] 从实验结果看，首先，在培养及中加入硒源会促进菌丝生长并提高孢梗束中硒以 及有效成分多糖和HEA的含量。但通过比较可以看出，加入L-硒-甲基硒代半胱氨酸对菌 丝体生长和有效成分的累积明显优于亚硒酸钠，且L-硒-甲基硒代半胱氨酸的加入量远小 于亚硒酸钠的加入量。
[0068] 其次，随着培养基中硒添加量的不断增加，孢梗束中富集硒的量也在不断增加，整 体线性基本呈正相关。当硒添加量达到〇. 035%时，孢梗束的硒含量达到峰值，再增加硒源 的量也不会对孢梗束中硒的含量带来显著提高。
[0069] 中国营养学会现推荐成人剂量为60微克/天，添加20mg/kg的处理组，孢梗束中 硒含量为53微克/克。经三批次生产验证，其平均含硒量达到60. 059微克。若按每天1 克服用量计，也基本达到中国营养学会推荐剂量（60微克），基本可达到补硒的水平。因此， 确定最佳的硒添加量为0. 02-0. 035%。
[0070] 实施例10接种量对菌丝生长和孢梗束含硒量的影响
[0071] 按实施例1、4的方法对蝉花进行液体和固体发酵培养，按表2所示不同接种量进 行接种（其他培养条件同实施例4)，考察固体发酵培养过程中接种量对菌丝生长和孢梗束 含硒量的影响。结果见表2。
[0072] 表2接种量对孢梗束含硒量的影响
[0074] 从实验结果看，接种量在5% -15%范围内时，均能实现促进菌丝体生长和富硒的 目的。因此，确定接种量为5-15%。
[0075] 实施例11
[0076] 取实施例4-8发酵得到的孢梗束，测定其中硒及活性成分的含量，结果见表3。
[0077] 表3实施例4-8所得的孢梗束硒含量
[0079] 从结果可以看出，实施例4-8均能实现本发明的目的，其得到的孢梗束中硒含量 显著高于培养基中不加硒的对照组。由此可见，本发明在固体培养基中加入L-硒-甲基硒 代半胱氨酸的步骤是实现富硒这一发明目的的必要技术特征，采用常规液体培养过程、液 体和固体培养基均能够实现本发明的效果。
【主权项】
1. 一种蝉花的人工培养方法，其特征在于，该方法包括如下步骤： 步骤1，蝉花菌种通过液体培养进行扩增； 步骤2,将步骤1扩增后的菌种接种到固体培养基中进行固体培养，其中所述固体培养 基中加入L-硒-甲基硒代半胱氨酸； 步骤3,对孢梗束进行采收。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中所述L-硒-甲基硒代半胱氨酸的 加入量为〇. 004-0. 04% ;所述百分比为L-硒-甲基硒代半胱氨酸占固体培养基的百分比。3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2中所述L-硒-甲基硒代半胱氨酸的 加入量为0.02-0· 035%。4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中所述固体培养基为谷物培养基；所 述谷物选自小麦、玉米、大米、小米、黄豆粉、荞麦、大麦、燕麦、糙米、粳米中的任意一种或几 种。5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2接种量为5 % -15%。6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2接种量为7%。7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2固体培养过程中，在菌丝体生长阶 段采用遮光培养，培养温度22-24Γ ;从孢梗束始发至采收阶段采用光照培养，培养温度为 20-22°C ;培养过程中相对湿度为60-70%。8. -种蝉花固体培养基，其特征在于，所述固体培养基中加入L-硒-甲基硒代半胱氨 酸。9. 如权利要求8所述的固体培养基，其特征在于，所述L-硒-甲基硒代半胱氨酸的加 入量为0. 02-0. 035% ;其中，所述百分比为L-硒-甲基硒代半胱氨酸占固体培养基的百分 比。10. 如权利要求8所述的固体培养基，其特征在于，所述固体培养基为谷物培养基；所 述谷物选自小麦、玉米、大米、小米、黄豆粉、荞麦、大麦、燕麦、糙米、粳米中的任意一种或几 种。
【文档编号】A01G1/04GK105981581SQ201510044551
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年1月28日
【发明人】纪伟, 董琼, 张忠亮, 彭国杰, 陈奇超, 胡建峰, 陈昳丽, 高敏逸, 吴迪芬, 孙长胜
【申请人】浙江泛亚生物医药股份有限公司