一种花生离体定向筛选和鉴定抗乙草胺体的方法
【专利摘要】本发明提供了一种花生离体定向筛选和鉴定抗乙草胺体的方法，主要步骤是将诱变后培养获得的花生外植体在添加了乙草胺的培养基上，进行抗乙草胺体的定向筛选。4周后将存活的外植体转移到恢复生长培养基上培养。经筛选获得的再生植株，取其叶片置于乙草胺溶液中，进行抗乙草胺的鉴定。本发明利用离体培养定向筛选和鉴定抗乙草胺体，操作方便，不受季节限制，可节省大量的人力、物力、财力。
【专利说明】
一种花生离体定向筛选和鉴定抗乙草胺体的方法
技术领域
[0001]本发明涉及花生离体定向筛选和鉴定方法，具体地说，是涉及一种花生离体定向筛选和鉴定抗乙草胺体的方法。
【背景技术】
[0002]花生是我国重要的油料作物和经济作物之一，花生是一种抗旱耐瘠、适应性强的作物，在世界各地种植极其广泛。随着科学技术的不断发展，农业劳动力逐步向城市转化，农业机械化逐步代替人工作业，除草剂代替了人工锄草。乙草胺是一种广泛应用的除草剂。在花生上的应用是在花生播种后出苗前喷施，出苗以后及生育期喷施乙草胺会杀伤花生苗。然而，在花生生育期，杂草会不断发芽生长，尤其是雨水较多的季节和地区，杂草生长非常快且茂盛，严重影响花生的产量。因此，筛选抗乙草胺体非常重要。
[0003]通常抗性筛选和鉴定是在大田进行，而离体诱变获得的突变体，必须经过植株再生，驯化移栽成活后才能进行筛选和鉴定，如此需花费大量的人力、物力、财力。
[0004]国内外尚未见离体定向筛选抗乙草胺体的报道。
[0005]此外，花生再生植株的驯化移栽也是重要的一步，无菌嫁接技术能解决花生再生苗生根难的困难，但一般嫁接的再生苗首先在驯化室培养，等成活后才能移栽田间。驯化室中驯化占用空间大，时间长，并且嫁接的再生苗生长缓慢、容易染菌，造成成活率降低。
【发明内容】
[0006]本发明提供了一种花生离体定向筛选和鉴定抗乙草胺体的方法，可以解决花生转基因植株或离体诱变抗乙草胺突变体必须经过再生植株、驯化移栽大田成活后才能筛选和鉴定，从而耗费大量人力、物力、财力等问题。
[0007]为达到解决上述问题的目的，本发明采用以下技术方案予以实现:
1、一种花生离体定向筛选和鉴定抗乙草胺体的方法，包括如下步骤:
(I)将发生突变或遗传转化形成体胚/不定芽的外植体转移至体胚萌发/植株再生及筛选培养基上培养，进行抗乙草胺体的定向筛选;所述体胚萌发/植株再生及筛选培养基以MS培养基为基本培养基，并添加4mg/L乙草胺和4?6mg/L BAP。
[0008](2)在体胚萌发/植株再生及筛选培养基上培养4周后，将存活的外植体转移到恢复生长培养基上培养，得到抗乙草胺苗;所述恢复生长培养基以MS培养基为基本培养基，并添加4?6mg/L BAP。
[0009](3)在恢复培养基上获得的抗乙草胺苗叶片完全展开后，取下叶片，放于乙草胺溶液中，进行抗乙草胺的鉴定。
[0010](4)经鉴定抗乙草胺的小苗，生长至1.5?2.5cm时，以抗乙草胺苗为接穗，无菌萌发的花生实生苗为砧木，进行无菌嫁接。
[0011](5)无菌嫁接苗转回到盛有沙子的培养瓶中，在培养室培养2?3天，使伤口愈合。
[0012](6)搭建临时塑料弓棚，宽度1.8?2.7米，高度1.2?1.5米，浇足水，保持空气湿度。
[0013](7)抗乙草胺的嫁接瓶苗直接移栽塑料弓棚的土壤中，移栽的株距为40?45cm，株距为16?20cm，嫁接口在土壤表面以上，移栽后随即浇水，保证根系需水。
[0014](8)嫁接苗移栽最初的2个周每天上午九点至下午4点搭遮荫网，防止太阳直晒。
[0015](9)移栽2周后，撤去遮荫网，并通风。
[0016](10)移栽3周后，撤去塑料弓棚。
[0017]优选地，所述步骤(I)中发生突变的形成体胚/不定芽的外植体，可以是任何形式诱变，可以是辐照诱变花生种子后，取胚小叶进行培养，诱导形成体胚/不定芽;也可以利用花生种子胚小叶作为外植体，在添加诱变剂的体胚诱导培养基上培养，诱导形成体胚;只要发生了突变均可以进行定向筛选。
[0018]优选地，所述步骤(I)和(2)中培养基均添加30g/L蔗糖，8g/L琼脂，pH5.8;培养温度均为24?26°C、光照强度为2000?3000Lx、光照时间为12-14h/d。
[0019]优选地，所述步骤(3)中用浓度为12mg/L的乙草胺溶液浸泡再生植株叶片3天，进行抗乙草胺的鉴定。
[0020]优选地，所述步骤(4)中作为砧木的实生苗是在灭菌的沙子中催芽苗龄10?13天的幼苗;沙子的灭菌是将沙子放于培养瓶中，加水漫过沙子，然后在高压灭菌锅中120°C灭菌20分钟;嫁接操作过程在超净工作台内进行，砧木嫁接口在下胚轴。
[0021]优选地，所述步骤(5)中培养温度为24?26 °C、光照强度为2000?3000Lx、光照时间为12-14h/d。
[0022]与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是:
1、本发明可以对利用任何方法获得抗乙草胺突变或遗传转化形成体胚/不定芽的外植体在培养基中进行定向筛选抗乙草胺体，淘汰非抗体，可节省大量的人力、物力、财力。
[0023]2、本发明在培养基中离体筛选抗乙草胺体，可以不受季节限制，常年可以进行离体定向筛选，操作方便。
[0024]3、本发明采用组培苗鉴定，在恢复培养基上获得的抗乙草胺苗叶片完全展开后，取下叶片，放于12mg/L乙草胺溶液中浸泡3天，进行抗乙草胺的鉴定。
[0025]4、将嫁接的再生苗直接栽植大田(移栽最初3个周搭建临时塑料弓棚，加遮荫网)，可明显提高成活率。以往是先将再生苗移栽于营养基质中置于驯化室培养，在营养基质中，由于嫁接的再生苗较弱，抵抗力差，很易染菌，从而降低成活率。本发明将嫁接的再生苗直接移栽大田，可避免移栽于基质中容易染菌，成活率低的困难。因为土壤中的微生物处于平衡状态，有益菌能抑制有害菌的繁衍。本发明成活率可达95%。
[0026]5、将嫁接的再生苗直接栽植大田(移栽最初3个周搭塑料弓棚，加遮荫网)，可缩短培养时间。以往是先将再生苗在驯化室培养3周后，再移至大田。本发明将嫁接的再生苗直接移栽大田，可节省培养时间20天以上。
[0027]6、将嫁接的再生苗直接移栽大田，减少了 I次移栽，也即减少了移栽对小苗生长的影响。并且由于嫁接的再生苗直接栽植土壤，根系伸展空间大，促使地上部分生长健壮。
[0028]7、将嫁接的再生苗直接移栽大田，减少了操作程序，不需要经过驯化室驯化的过程，节省空间，节省人力物力财力。
【具体实施方式】
[0029]下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但是这些实例并不限制本发明的范围。此外相关领域的普通技术人员对本发明做的任何改动，只要不脱离本发明的实质，都将等价落在本发明权利要求书所限定的范围内。
[0030]实施例1
本发明所述一种花生离体定向筛选和鉴定抗乙草胺体的方法具体包括如下步骤:
1、培养基的制备。
[0031 ] (I)制备体胚诱导培养基:选取MS培养基为基本培养基，在此MS培养基中添加2，4_D配制成体胚诱导培养基，2，4-D的浓度为5?15mg/L。本案例中体胚诱导培养基为MS+10mg/L 2，4-0+308/1蔗糖+88/1琼脂，将所述体胚诱导培养基的?!1调至5.8。在培养室温度为24?260C、光照强度为2000?3000Lx、每日光照为12?14h的条件下进行培养，诱导体胚形成。
[0032](2)制备诱变培养基:在体胚诱导培养基中添加3?4mg/L平阳霉素，形成诱变培养基。本案例中诱变培养基为MS+10mg/L 2，4-D+4mg//L平阳霉素+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，将所述诱变培养基的pH调至5.8。在培养室温度为24?26°C、光照强度为2000?3000Lx、每日光照为12?14h的条件下进行培养，诱导基因或染色体发生突变。
[0033](3)制备体胚萌发及筛选培养基:选取MS培养基为基本培养基，在此MS培养基中添加乙草胺和6-苄氨基嘌呤(BAP)形成体胚萌发及抗乙草胺定向筛选培养基，乙草胺的添加量为1、2、3、4、5、6、7、81^/1，84?的添加量为3?611^/1。本实施例中体胚萌发及筛选培养基为MS+乙草胺+4mg/L BAP+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，将所述体胚萌发及筛选培养基的pH调至
5.8。在培养室温度为24?26 °C、光照强度为2000?3000Lx、每日光照为12?14h的条件下进行培养。抗乙草胺定向筛选和体胚萌发同时进行
(4)制备体胚萌发(恢复生长)培养基:选取MS培养基为基本培养基，在此MS培养基中添加BAP形成恢复生长培养基，BAP的添加量为4?8mg/L。本实施例中恢复生长培养基为MS+4mg/L BAP+30g/L蔗糖+8g//L琼脂，将所述恢复生长培养基的pH调至5.8。在培养室温度为24?26°C、光照强度为2000?3000Lx、每日光照为12?14h的条件下进行培养。
[0034]2、抗乙草胺筛选浓度的确定。
[0035]选用推广栽培的花生品种花育25号，取成熟种子的种胚，进行表面消毒后，取胚小叶置于添加2，4-D( 10mg/L)的体胚诱导培养基上培养4周，诱导体胚形成。
[0036]将形成体胚的外植体转移到添加4mg/L BAP和不同浓度的乙草胺(1、2、3、4、5、6、
7、8mg/L)的体胚萌发及筛选培养基上培养4周，然后转移到恢复培养基上进行培养。
[0037]试验结果表明，在含有乙草胺3mg/L的培养基上培养过的外植体仍有体胚萌发再生植株;而在6mg/L以上，外植体全部褐化;在添加4?5mg/L情况下，外植体生长受抑制，但保持活性，因此，确定体胚萌发和筛选培养基中适宜的乙草胺筛选浓度为4?5mg/L。
[0038]3、乙草胺鉴定浓度的确定。
[0039]选用花生品种花育25号胚小叶为外植体，置于添加2，4-D(10mg/L)的体胚诱导培养基上培养4周，诱导体胚的形成。然后，将形成体胚的外植体转移到添加4mg/L BAP的体胚萌发培养基上，体胚萌发长成小苗。取再生小苗的叶片，浸泡于含有不同浓度(4，6，8，10，12，14，16，18，20mg/L)的乙草胺溶液中处理3天，以不加乙草胺为对照，进行叶片褪绿的比较。试验结果表明，与对照相比，在添加乙草胺浓度超过12mg/L以上，叶片明显褪绿，因此，确定抗乙草胺适宜的鉴定浓度为12mg/L。。
[0040]4、抗乙草胺体的筛选与鉴定
选用花生品种花育25号胚小叶为外植体，置于添加10mg/L 2，4-D和4mg//L平阳霉素的体胚诱导及诱变培养基上培养4周后，将形成体胚的外植体转移到添加4mg/L BAP和4mg/L乙草胺的体胚萌发和筛选培养基上进行培养。转移4周后，大部分外植体褐化，仅有少部分存活。将存活的外植体转移到添加4mg/L BAP的恢复培养基上进行培养，部分体胚萌发长成小苗。
[0041]取上述定向筛选再生小苗的展开叶片浸泡于12mg/L乙草胺的溶液中处理3天，以花育25正常再生小苗(未经过诱变及定向筛选)的叶片为对照。结果显示，对照叶片褪绿严重，而大部分定向筛选再生小苗的叶片无明显变化，也有少部分经筛选获得的再生小苗叶片褪绿严重，这可能是由于生理反应表现出抗性，而非遗传物质发生改变。
[0042]5、乙草胺抗性苗的嫁接。
[0043]上述经鉴定的抗性苗作为砧木，灭菌沙子中无菌萌发10-13天苗龄的实生苗作为砧木，本案例中利用12天苗龄的实生苗作为砧木，在超净工作台内进行无菌嫁接，砧木的嫁接口在下胚轴。嫁接苗转回到盛有沙子的培养瓶中，在培养室培养2?3天，使嫁接伤口愈合，本案例培养3天。培养室温度为24?26°C、光照强度为2000?3000Lx、每日光照为12?14h的条件下进行培养。
[0044]6、乙草胺抗性嫁接苗的移栽。
[0045](I)嫁接抗性苗栽植前，先把大田施足底肥，每亩复合肥(N: P: K比例约为1:1:1)40斤，或每亩猪粪2车，并耕翻整平，本案例施用猪粪2车。
[0046](2)搭建塑料弓棚，宽度1.8?2.7米，高度1.2?1.5米。
[0047](3)塑料弓棚内浇足水，以保证棚内空气湿度。
[0048](4)培养瓶中培养3天的嫁接抗性苗，直接移栽塑料弓棚的土壤中，嫁接口在土壤表面以上，移栽的株距为40?45cm，株距为16?20cm。
[0049](5)移栽后随即浇水，保证嫁接苗根系需水。
[0050]7、嫁接苗移栽最初的2个周上午九点至下午4点搭遮荫网，防止太阳直晒，嫁接苗移栽于塑料弓棚后生长迅速，成活率达90 %以上。
[0051]8、移栽2周后，撤去遮荫网，并通风。
[0052]9、移栽3周后，撤去塑料弓棚，嫁接的乙草胺抗性苗在自然环境下生长。取上部幼嫩叶片，浸泡于30mg/L乙草胺溶液中进行抗乙草胺鉴定，以花育25叶片为对照。结果显示，乙草胺抗性苗大部分叶片无明显变化，仅有极少数叶片斑点褪绿，而对照全部叶片褪绿严重。
[0053]说明经离体定向筛选和培养瓶中叶片抗乙草胺鉴定具有抗性的再生苗对乙草胺不敏感，具有乙草胺抗性;本发明能够离体筛选和离体鉴定出抗乙草胺体。
【主权项】
1.一种花生离体定向筛选和鉴定抗乙草胺体的方法，其特征在于包括如下步骤: (1)将发生突变或遗传转化形成体胚/不定芽的外植体转移至体胚萌发/植株再生及筛选培养基上培养，进行抗乙草胺体的定向筛选;所述体胚萌发/植株再生及筛选培养基以MS培养基为基本培养基，并添加4mg/L乙草胺和4?6mg/L BAP; (2)在体胚萌发/植株再生及筛选培养基上培养4周后，将存活的外植体转移到恢复生长培养基上培养，得到抗乙草胺苗;所述恢复生长培养基以MS培养基为基本培养基，并添加4?6mg/L BAP； (3)在恢复培养基上获得的抗乙草胺苗叶片完全展开后，取下叶片，放于乙草胺溶液中，进行抗乙草胺的鉴定； (4)经鉴定抗乙草胺的小苗，生长至1.5?2.5cm时，以抗乙草胺苗为接穗，无菌萌发的花生实生苗为砧木，进行无菌嫁接； (5)无菌嫁接苗转回到盛有沙子的培养瓶中，在培养室培养2?3天，使伤口愈合； (6)搭建临时塑料弓棚，宽度1.8?2.7米，高度1.2?1.5米，浇足水，保持空气湿度； (7)抗乙草胺的嫁接瓶苗直接移栽塑料弓棚的土壤中，移栽的株距为40?45cm，株距为16?20cm，嫁接口在土壤表面以上，移栽后随即浇水，保证根系需水； (8)嫁接苗移栽最初的2个周上午九点至下午4点搭遮荫网，防止太阳直晒； (9)移栽2周后，撤去遮荫网，并通风； (10)移栽3周后，撤去塑料弓棚。2.根据权利要求1所述的一种花生离体诱变定向筛选抗乙草胺体的方法，其特征在于:所述步骤(I)中发生突变的形成体胚/不定芽的外植体，可以是任何形式诱变，可以是辐照诱变花生种子后，取胚小叶进行培养，诱导形成体胚/不定芽；也可以利用花生种子胚小叶作为外植体，在添加诱变剂的体胚诱导培养基上培养，诱导形成体胚;只要发生了突变均可以进行定向筛选。3.根据权利要求1所述的花生离体诱变定向筛选抗乙草胺体的方法，其特征在于:所述步骤(I)和(2)中培养基均添加30g/L蔗糖，8g/L琼脂，pH 5.8;培养温度均为24?26°C、光照强度为2000?3000Lx、光照时间为12-14h/d。4.根据权利要求1所述的花生离体诱变定向筛选抗乙草胺体的方法，其特征在于:所述步骤(3)中用浓度为12mg/L的乙草胺溶液浸泡再生植株叶片3天，进行抗乙草胺的鉴定。5.根据权利要求1所述的花生离体诱变定向筛选抗乙草胺体的方法，其特征在于:所述步骤(4)中作为砧木的实生苗是在灭菌的沙子中催芽苗龄10?13天的幼苗，沙子的灭菌是将沙子放于培养瓶中，加水漫过沙子，然后在高压灭菌锅中120°C灭菌20分钟。6.根据权利要求1所述的花生离体诱变定向筛选抗乙草胺体的方法，其特征在于:所述步骤(4)中嫁接操作过程在超净工作台内进行，砧木嫁接口在下胚轴。7.根据权利要求1所述的花生离体诱变定向筛选抗乙草胺体的方法，其特征在于:所述步骤(5)中培养温度为24?26°C、光照强度为2000?3000Lx、光照时间为12-14h/d。
【文档编号】A01H4/00GK105993936SQ201610312428
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月12日
【发明人】王晶珊, 隋炯明, 乔利仙, 姜德锋, 纪瑞瑞, 王鹏, 谭业杰, 孙世孟, 陈立涛
【申请人】青岛农业大学