一种植物组织培养支持物的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，具体涉及一种植物组织培养支持物。该支持物包括干水苔和去离子水，干水苔与去离子水的体积比为(0.5～1):1。与现有技术相比本发明的有益效果是：操作简单；组织培养的成本低；节约能源；缩短工作时间，减轻工作强度，提高接种效率，减少污染机率；外植体生长健壮，移栽成活率高；固定效果好；透气性好；培养基使用周期长；可使组培环境更接近植物的生理需求。
【专利说明】
一种植物组织培养支持物
技术领域
[0001 ]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种植物组织培养支持物。
【背景技术】
[0002]用于植物组织培养的培养基物理状态有液体和固体两种类型。液体培养基适于细胞培养，促进细胞生物产量或代谢产物的增加。固体培养基多用于愈伤组织和试管苗等培养。支持物是指为了有利于植物外植体的生长，人为添加到培养基中的、对外植体起支持作用的一些物质。目前培养基的支持物多用琼脂。琼脂为多糖，本身并不提供任何营养，它是一种从海藻中提取的高分子化合物。琼脂仅溶于90°C以上的热水，成为溶胶，40°C以下开始凝固，成为固体状凝胶。琼脂的凝固程度与高温灭菌的时间、温度及培养基PH值等因素也有关系，长时间的高温灭菌会使琼脂的凝固能力下降，过酸过碱加之高温均会使琼脂发生水解，从而失去凝固能力，通常，培养基的pH值在5.8时，琼脂的凝固效果较好。近年来，有一些报道提到采用琼脂糖、聚氨酯海绵、脱脂棉、玻璃球、玻璃棉、石英砂、蛭石、珍珠岩、壤土、河沙、滤纸、明胶、硅胶、丙烯酰胺、泡沫塑料等，甚至南瓜和马铃薯等做为植物组织培养的支持物。琼脂糖的特点是，其属于多糖，制备过程复杂，成本远远高于琼脂。琼脂糖的凝胶强度高，一般用于单细胞或原生质体培养。脱脂棉易吸水、透气效果好，其做支持物的培养基中愈伤组织生长情况较好，也正是由于脱脂棉吸水性好，往往导致培养液量不足的现象而使外植体后期生长不良；聚氨酯海绵做支持物时，外植体生长旺盛，且成本低、省工省力，培养物根部无需用水冲洗可直接移入荫棚，因此成活率较高，但也存在着由于吸收能力强而造成后期营养液不足而影响外植体生长的情况，且发现有玻璃体苗产生;蛭石、珍珠岩做支持物具有成本低、操作简单、外植体生长基本良好等特点，但其不足是对外植体的固定效果不很好，这一点与玻璃球、玻璃棉、石英砂、壤土、河沙等相同。因此，本领域亟需一种透气性好，移栽成活率高的培养基支持物。
【发明内容】
[0003]本发明为解决现有技术的不足，提供了一种植物组织培养支持物，采用水苔做为植物组织培养之培养基的支持物具有:外植体生长健壮、移栽成活率高;成本低;操作简单；固定效果好;透气性好等优点。
[0004]为达到本发明的目的，采用的技术方案是:一种植物组织培养支持物，包括干水苔和去离子水，干水苔与去离子水的体积比为(0.5?I):1。优选地，干水苔与去离子水的体积比为1:1。
[0005]采用上述支持物制作培养基，用如下方法:将干水苔与去离子水按一定比例放入容器中以使干水苔膨胀，备用;将膨胀水苔放置于培养瓶中，加入培养液，培养液的加入量以刚没过水苔即可。作为本发明一个优选的实施例，所述的膨胀水苔的添加量为培养瓶体积的五分之一。
[0006]采用上述培养基支持物进行植物组织培养的步骤如下:
[0007]S1.取预培养的植物外植体，使用大蒜水溶液进行灭菌处理；
[0008]S2.将灭菌后的外植体进行初代培养，并进行培养基的筛选，确定最佳初代培养基;
[0009]S3.在初代培养的基础上，进行继代培养，并进行培养基的筛选，确定最佳继代培养基；
[0010]S4.在继代培养的基础上，进行生根培养，并进行培养基的筛选，确定最佳生根培养基；
[0011 ] S5.筛选适宜的驯化移栽基质及条件；
[0012]上述初代、继代、生根培养基中均添加有膨胀水苔支持物，操作步骤如下:
[0013]a.制备膨胀水苔支持物，先在培养瓶中加入1/5体积量的膨胀水苔；
[0014]b.再向培养瓶中加入初代、继代、生根培养基；
[0015]c.最后在培养基上接种外植体，封口，于培养室中培养。
[0016]上述培养基可用于双子叶植物的组织培养，单子叶植物的组织培养，生长季和休眠季的叶芽、茎段、种子以及生长季的嫩梢作外植体进行组织培养，采用叶片作外植体进行组织培养，外植体的初代培养、继代培养、生根培养，愈伤组织的悬浮培养。
[0017]进一步地，上述初代培养基或继代培养基或生根培养基是在MS基本培养基中添加6-BA、NAA、IBA、GA、蔗糖中一种或几种。
[0018]优选地，大蒜水溶液质量浓度为30?50%。
[0019]在植物组织培养的科学研究和实际应用中，发明人发现水苔也可以作为植物组织培养时培养基的支持物，并取得了很好的效果。水苔是一种天然的苔藓，又名泥炭藓(HerbaSphagni)，为泥炭藓科植物。采用水苔作为培养基支持物可以带来如下效果:
[0020]1.外植体生长健壮，移栽成活率高。无论初代培养、继代培养还是生根培养，以水苔为支持物时，外植体的生长均很健壮，移栽时成活率很高。
[0021]2.成本低。两方面原因:一、与植物组培常用支持物琼脂相比，水苔售价低。目前，市场价格，琼脂的价格是水苔价格的3?5倍。而常规固体培养基，每100ml培养基，水苔的使用量在15?20g左右，琼脂的使用量在7?1g左右。二、水苔还可以多次重复使用。琼脂对存储温度和时间等条件因素有一定的要求，有的琼脂会因存储不适，发生一定的理化性质改变，高温高压后其酸度增加，导致培养基不凝固，无法正常使用，从而产生浪费，而水苔理化性质稳定，对存储温度和时间无严格要求，高温高压后PH无变化，不会导致培养基性状的改变。因此可以降低组培成本。
[0022]3.操作简单。与琼脂做支持物相比，水苔做支持物时，可以减少溶解琼脂的环节，亦可减少移栽前自组培苗根系清洗掉琼脂的环节。
[0023]4.节省时间，减少污染。以琼脂做支持物的培养基，无菌接种时，需将外植体扦插在培养基上，扦插工作的耗时一般约占整个接种时间的1/2?1/3。由于水苔培养基，介于固态和液态之间，接种时，只需将外植体均匀放置在培养基表面即可，这不仅可以节约接种时间，提高接种效率，还可以减少污染机率。
[0024]5.节约能源，缩短工作时间，减轻工作强度。制作琼脂为支持物的培养基时，琼脂需温度在95°C以上，熬煮15min以后，才能较好的融化，熬煮过程还需时刻观察，否则容易潜。而制作水苔为支持物的培养基时，不需要熬煮，不仅可以节约能源，缩短工作时间，还可以减轻工作强度。
[0025]6.固定效果好。与玻璃球、玻璃棉、石英砂、壤土、河沙等相比，水苔做支持物对外植体的固定效果更好。发明人以烟草、黄芪为外植体，在玻璃球、玻璃棉、石英砂、壤土、河沙为支持物的培养基上做过实验，发现接种完毕后，在从超净工作台移到培养室时，由于轻微的晃动，以玻璃球、玻璃棉、石英砂、壤土、河沙为支持物中的外植体形成了倾斜，而以水苔为支持物的外植体则固定得很好。7.透气性好。与琼脂等支持物相比，水苔的透气性更好，有利于外植体的生长发育。发明人以蝴蝶兰为外植体接种在分别以水苔和琼脂为支持物的培养基上，结果以水苔为支持物时，蝴蝶兰生长势要远好于琼脂。因为蝴蝶兰属于好氧植物，在透气性不良的介质中生长势差，由此可以判断水苔的透气性好，更适合作为支持物。
[0026]8.使用水苔做支持物的培养基使用周期长。与琼脂做支持物的培养基相比，组培苗在需长时间保存时，水苔支持物的培养基失水慢，明显优于琼脂培养基。
[0027]9.水苔做支持物的培养基可使组培环境更接近植物的生理需求。琼脂培养基需调节pH值在5.8左右，pH低于5.6则培养基不凝固，所以，对于有些生长环境要求较高pH值的植物，在组培时，利用琼脂培养基，其长势会受到影响。而利用水苔培养基时，可以根据植物对生长环境的要求，调节培养基的PH值，使组培环境更接近植物的生理需求。
[0028]10.无菌接种时，琼脂培养基，需将培养物扦插在培养基上，而常规操作下，扦插工作的耗时，一般约占整个接种时间的1/2?1/3ο由于水苔培养基，介于固态和液态之间，接种时，只需将培养物均匀放置在培养基表面即可，这不仅可以节约接种时间，提高接种效率，还可以减少污染机率。
[0029]与现有技术相比本发明的有益效果是:水苔是一种天然的泥炭藓，理化性质稳定，透气性好，以水苔为支持物的移栽成活率可以达到95%以上，而以琼脂为支持物的成活率只能达到90%左右。对植物无害，采用水苔作为植物组织培养的培养基支持物具有综合优势，表现为:操作简单;组织培养的成本低;节约能源;缩短工作时间，减轻工作强度，提高接种效率，减少污染机率;外植体生长健壮，移栽成活率高；固定效果好;透气性好;培养基使用周期长;可使组培环境更接近植物的生理需求。
【具体实施方式】
[0030]下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中如无特殊说明，所采用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从化学公司购买。
[0031]下述初代、继代、生根培养基中均添加有膨胀水苔支持物，操作步骤如下:
[0032]a.制备膨胀水苔支持物，将干水苔与去离子水按体积比为1:1放入容器中以使干水苔膨胀，备用;将膨胀水苔放置于培养瓶中，添加量为培养瓶体积的五分之一；
[0033]b.再向培养瓶中加入初代、继代、生根培养基，加入量以刚没过水苔即可；
[0034]c.在制作好的培养基上接种外植体，封口，于培养室中培养。
[0035]实施例1:
[0036]选双子叶植物短茎藤本月季的叶芽，流水冲洗后，剥去叶芽外的鳞片，将芽放在1:1 (W/V)大蒜水溶液灭菌30min，然后立即接种在短茎藤本月季的最适初代培养培养基中(MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+3 %蔗糖)。30d后将萌发出的叶芽茎段扦插在最适继代培养基(MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L+2 %蔗糖)中培养。30d后将继代培养苗移入最佳生根培养基(1/2MS+6-BA0.2mg/L+IBAl.0mg/L+2%蔗糖)中进行生根培养，至长出良好的根系后转移到珍珠岩和沙土上进行驯化，最后移栽在中性壤土中。
[0037]实施例2:
[0038]选双子叶植物“红灯”甜樱桃的具有一个叶芽茎段，流水冲洗后，剥去叶芽外的鳞片和茎段的表皮，将具有叶芽的一段茎放入到1:1 (W/V)大蒜水溶液灭菌30min，然后立即接种在“红灯”甜樱桃的最适初代培养培养基中(MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.lmg/L+3%蔗糖)o30d后将萌发出的叶芽茎段扦插在最适继代培基(2/3MS+6-BA0.5mg/L+IBA0.3mg/L+GAl.5+2%蔗糖)中培养。40d后将继代培养苗移入最佳生根培养基(1/2MS+IBA0.5mg/L+2 %蔗糖)中进行生根培养，至长出良好的根系后转移到珍珠岩和沙土上进行驯化，最后移栽在中性壤土中。实施例3:
[0039]选双子叶植物甘草的种子，经98%浓硫酸处理lh，软化坚硬的种皮，然后用自来水充分冲洗干净。在无菌操作台下用0.1%的氯化汞消毒lOmin，用无菌水冲洗3?4次，然后用75%乙醇消毒40s，再用无菌水冲洗3?4次。初代培养(或接种)的最佳培养基是MS培养基，黑暗条件下培养I?2周，然后再进行光照培养一个月。培养带叶茎段直接生根成苗的最佳培养基是:MS+13.5mg/L KH2P04+3%蔗糖。生根成苗选择直接在继代培养的基础上生长，至长出良好的根系后转移到珍珠岩和沙土上进行驯化，最后移栽在中性壤土中。
[0040]实施例4:
[0041 ]选双子叶植物“晚红珠”甜樱桃的嫩梢，流水下冲洗Ih，在50 %大蒜水溶液浸泡15min，然后接种在最适初代培养基(MS+6-BA0.5mg/L+IBA0.lmg/L+3 %蔗糖)中，30d后将嫩梢萌发出的茎段接种在最适的继代增殖培养基(2/3MS+6-BA0.5mg/L+IBA 0.3mg/L+GAl.5+2%蔗糖)上;40d后将继代培养苗移入最佳生根培养基(MS+6-BA0.lmg/L+IBA0.5mg/L+2%蔗糖)中进行生根培养，至长出良好的根系后转移到珍珠岩和沙土上进行驯化，最后移栽在中性壤土中。
[0042]实施例5:
[0043]选双子叶植物普通烟草的叶片，取叶色正常、生长健康的大叶片，流水冲洗lh，浸泡在50%大蒜溶液中5min。在超净工作台内将叶片剪成Icm2的正方形片状，并在中间叶脉部位切数个伤口(不切断)，之后用镊子将处理好的外植体平放接种在愈伤组织培养基(MS+6-BA 1.0mg/L+IBA0.2mg/L+3 %蔗糖)上，进行愈伤组织增殖培养，待愈伤组织生长到一定大小时，切割并继续接种到愈伤组织培养基上进一步扩大培养。
[0044]实施例6:
[0045]选单子叶植物蝴蝶兰的花梗侧芽(即叶芽)，流水冲洗Ih，浸泡在50%大蒜溶液中20min，接种在适宜的初代培养基(MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.5mg/L+3 %蔗糖)上，30d后将萌发出的花梗侧芽接种在适宜的增殖培养基(1/2MS+6-BA8.0mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖30g/L+香蕉泥30g/L+活性炭2g/L)上，30d后再接种在适宜的生根培养基(1/2MS+6-BA4.0mg/L+NAA
0.8mg/L+蔗糖30g/L+香蕉泥30g/L+活性炭2g/L)上。至长出良好的根系后转移到水苔基质中生长。
[0046]实施例7:
[0047]选单子叶植物胡萝卜的茎段，流水冲洗后，将具芽茎段放入到30%大蒜水溶液灭菌1min，然后立即接种在适宜初代培养培养基中(MS+6-BA 1.0mg/L+NAA0.3mg/L+2 %蔗糖)。20d后将萌发出的叶芽茎段扦插在适宜的继代培基(MS+6-BA0.5mg/L+NAA 0.05mg/L+2 %蔗糖)中培养。20d后将继代培养苗移入适宜生根培养基(MS+6-BA0.lmg/L+NAAl.0mg/L+2%蔗糖)中进行生根培养，至长出良好的根系后转移到珍珠岩和沙土上进行驯化，最后移栽在中性壤土中。
[0048]实施例8:
[0049]选单子叶植物玉米的种子，流水冲洗后浸泡在30%大蒜水溶液中1min，接种在含MS培养液的水苔培养基上，至长出良好的茎叶和根系后转移到珍珠岩和沙土上进行驯化，最后移栽在中性壤土中。
[0050]实施例9:
[0051 ]选单子叶植物芹菜的嫩梢，流水冲洗Ih，在30 %大蒜水溶液浸泡1min，然后接种在初代培养基(MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L+3 %蔗糖)中，20d后将嫩梢萌发出的茎段接种在继代增殖培养基(MS+6-BA 1.0mg/L+NAA0.lmg/L+2 %蔗糖)上;20d后将继代培养苗移入生根培养基(MS+6-BA0.lmg/L+NAAl.0mg/L+2 %蔗糖)中进行生根培养，至长出良好的根系后转移到珍珠岩和沙土上进行驯化，最后移栽在中性壤土中。
[0052]实施例10:
[0053]选单子叶植物蝴蝶兰的叶片，流水冲洗lh，浸泡在30%大蒜溶液中5min。在超净工作台内将叶片剪成Icm2的正方形，然后用将处理好的正方形叶片平放接种在愈伤组织培养基(MS+6-BA 1.5mg/L+IBA0.4mg/L+2%蔗糖)上，进行愈伤组织增殖培养，待愈伤组织生长到一定大小时，切割并继续接种到愈伤组织培养基上进一步扩大培养。
[0054]实施例11
[0055]选双子叶植物“豆瓣绿”的叶片作为外植体，流水冲洗Ih，浸泡在30%大蒜溶液中5min。在超净工作台内将叶片剪成Icm2的正方形，然后用将处理好的正方形叶片平放接种在初代培养基(MS+6-BA0.3mg/L+NAA 0.5mg/L+3%蔗糖)上，培养出愈伤组织后，将愈伤组织转到继代培养基(2/3MS+6-BA 0.5mg/L+IBA0.3mg/L+GAl.5+2%蔗糖)中，进行继代培养。继代培养诱导出芽后，转入到生根培养基(1/2MS+NAA0.5mg/L+蔗糖3% )中，至长出良好的根系后转移到珍珠岩和沙土上进行驯化，最后移栽在中性壤土中。
[0056]实施例12
[0057]选双子叶植物普通烟草的叶片，取叶色正常、生长健康的大叶片，流水冲洗Ih，浸泡在50%大蒜溶液中5min。在超净工作台内将叶片剪成lcm2的正方形片状，并在中间叶脉部位切数个伤口(不切断)，之后用镊子将处理好的外植体平放接种在愈伤组织培养基(MS+6-BA 1.0mg/L+IBA0.2mg/L+3 %蔗糖)上，进行愈伤组织培养，待愈伤组织诱导出来后，转接到继代培养基和生根培养基(MS+6-BA 1.0mg/L+IBA0.2mg/L+蔗糖3%，注:继代培养基和生根培养基相同)上，至长出良好的芽和根系后转移到珍珠岩和沙土上进行驯化，最后移栽在中性壤土中。
[0058]参考文献
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【主权项】
1.一种植物组织培养支持物，其特征在于，包括干水苔和去离子水，干水苔与去离子水的体积比为(0.5?I):1。2.—种用权利要求1所述的支持物制作培养基，其特征在于，方法如下:将干水苔与去离子水按一定比例放入容器中以使干水苔膨胀，备用;将膨胀水苔放置于培养瓶中，加入培养液，培养液的加入量以刚没过水笞即可。3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于，所述的膨胀水苔的添加量为培养瓶体积的五分之一。4.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于，该培养基能用于双子叶植物的组织培养，单子叶植物的组织培养，生长季和休眠季的叶芽、茎段、种子以及生长季的嫩梢作外植体进行组织培养，采用叶片作外植体进行组织培养，外植体的初代培养、继代培养、生根培养和愈伤组织的悬浮培养。5.—种用权利要求1所述的培养基支持物进行植物组织培养的方法，其特征在于，包括如下步骤: 51.取预培养的植物外植体，使用大蒜水溶液进行灭菌处理； 52.将灭菌后的外植体进行初代培养，并进行培养基的筛选，确定最佳初代培养基； 53.在初代培养的基础上，进行继代培养，并进行培养基的筛选，确定最佳继代培养基； 54.在继代培养的基础上，进行生根培养，并进行培养基的筛选，确定最佳生根培养基； 55.筛选驯化移栽基质及移栽条件； 上述初代、继代、生根培养基中均添加有膨胀水苔支持物，具体如下: a.制备膨胀水苔支持物，先在培养瓶中加入1/5体积量的膨胀水苔； b.再向培养瓶中加入初代、继代、生根培养基； c.最后在培养基上接种外植体，封口，于培养室中培养。6.根据权利要求5所述的植物组织培养的方法，其特征在于，所述的初代培养基或继代培养基或生根培养基是在MS基本培养基中添加6-BA、NAA、IBA、GA、鹿糖中一种或几种。7.根据权利要求5所述的植物组织培养的方法，其特征在于，所述步骤SI中，大蒜水溶液质量浓度为30?50 %。
【文档编号】A01H4/00GK105993961SQ201610602204
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月28日
【发明人】侯义龙
【申请人】大连大学