螺雄性四倍体纯系高效育成方法
【专利摘要】本发明公开了一种螺雄性四倍体纯系高效育成方法，包括如下步骤：他莫昔芬喂养料的配备、对母螺进行投喂他莫昔芬喂养料、热休克处理、雌激素抑制剂溶液的配制、雌激素抑制剂溶液泡浴、获得螺的雄性四倍体纯系。通过此方法，可获得100%的螺雄性四倍体纯系。此方法，不仅有效地育成螺的四倍体，而且提高了四倍体的育成率与出苗率，为生产三倍体不育鱼奠定了坚实的基础。
【专利说明】
螺雄性四倍体纯系高效育成方法
技术领域
[0001] 本发明涉及螺的多倍体繁育方法，具体涉及螺雄性四倍体纯系高效育成方法。
【背景技术】
[0002] 螺的分布、种类多，是指腹足类(gastropod)动物，特别是指有一个封闭的壳，可以 完全缩入其中以得保护的腹足类动物，常见的有环棱螺、田螺等等，螺的繁育方式一般为卵 胎生。因螺三倍体的不育特征，使其在生长速度、抗病性、肉质等方面表现出更为显著的优 势。现有技术中，要获得三倍体不育螺，最快捷有效的方法是通过四倍体螺与二倍体螺倍间 杂交获得，那么就需要建立遗传稳定、纯度极高的四倍体螺纯系。但在螺的遗传育种中，到 目前为止还未见四倍体全雄螺育成的报道。
【发明内容】
[0003] 针对上述现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种方法稳定、种群纯度高 达100%的螺雄性四倍体纯系高效育成方法。
[0004] 为达到上述目的，本发明的技术方案如下： 螺雄性四倍体纯系高效育成方法，包括如下步骤： (1) 他莫昔芬喂养料的配备:取纯度为95%以上的他莫昔芬粉剂，加入到螺人工饲养饲 料中，制成喂养料，其中他莫昔芬含量为10~20g/500g喂养料，待用； (2) 投喂:在母螺产卵前5~10天，按常规饲料投喂方法对母螺进行投喂他莫昔芬喂养 料，每天两次，早上8:00每100g母螺投喂5~10g，下午6:00每100g母螺投喂8~10g;至其卵 发育成熟，然后，取公螺放在一起，使其自然产卵受精，得受精怀卵母螺； (3) 热休克处理:观察怀卵母螺受精卵的发育情况，在受精卵第一次卵裂前2~3min，把 步骤⑵中的怀卵母螺放入溶氧达5~8mg/l、温度为39~42°C恒温水中，热休克3~5min，待 用； (4) 雌激素抑制剂溶液的配制:将氯米芬和睾酮一起溶于80%~90%的乙醇中，再加蒸馏 水配制成雌激素抑制剂溶液，其中雌激素抑制剂溶液中氯米芬的浓度为100~200mg/l，睾 酮的浓度为10~50mg/l; (5) 取步骤(3)处理后的怀卵母螺，放入用步骤(4)所制备的雌激素抑制剂溶液中，常温 泡浴60~120S，怀卵母螺与溶液比为1:2，通过充氧，使溶液中的氧气含量达5~10mg/l; (6) 取步骤(5)处理后的怀卵母螺，放入育苗池中进行常规育苗培育;直至产出幼螺，从 而获得1 〇〇%螺的雄性四倍体纯系。
[0005] 本发明的优点：1、本发明中对母本进行添加他莫昔芬饲料投喂，起到抑制DNA分裂 和促雄性的双重作用的同时，将受精卵第一次卵裂的时间推迟了 3~5min，并提高所有受精 卵第一次卵裂的同步程度(可达99%)，为操作下一步提供时间保障和奠定染色体加倍基础； 2、较短的热休克处理，不仅有效减少对受精卵的不良影响，提高受精卵的成活率，而且进一 步加强了四倍体的形成机率;3、雌激素抑制剂溶液浸泡，再一次强化与保证其雄性的转化 率。因而通过此方法，可获得100%的螺雄性四倍体纯系。此方法，不仅有效地育成螺的四倍 体，而且提高了四倍体的育成率与出苗率，为生产三倍体不育鱼奠定了坚实的基础。
【具体实施方式】
[0006] 现结合具体实施例，对本发明作进一步描述。
[0007] 实施例一 螺雄性四倍体纯系高效育成方法，包括如下步骤： (1) 他莫昔芬喂养料的配备:取纯度为95%以上的他莫昔芬粉剂，加入到螺人工饲养饲 料中，制成喂养料，其中他莫昔芬含量为10g/500g喂养料，待用； (2) 投喂:在母螺产卵前5天，按常规饲料投喂方法对母螺进行投喂他莫昔芬喂养料，每 天两次，早上8:00每100g母螺投喂10g，下午6:00每100g母螺投喂8g;至其卵发育成熟，然 后，取公螺放在一起，使其自然产卵受精，得受精怀卵母螺； (3) 热休克处理:观察怀卵母螺受精卵的发育情况，在受精卵第一次卵裂前2min，把上 述怀卵母螺放入溶氧达5mg/l(通过人工充氧）、温度为42°C恒温水中，热休克5min，待用； (4) 雌激素抑制剂溶液的配制:将氯米芬和睾酮一起溶于80%的乙醇中，再加蒸馏水配 制成雌激素抑制剂溶液，其中雌激素抑制剂溶液中氯米芬的浓度为200mg/l，睾酮的浓度为 50mg/l； (5) 取步骤(3)处理后的怀卵母螺，放入用步骤(4)所制备的雌激素抑制剂溶液中，常温 泡浴120S，怀卵母螺与溶液比为1:2，通过充氧，使溶液中的氧气含量达5mg/l; (6) 取步骤(5)处理后的怀卵母螺，放入育苗池中进行常规育苗培育;直至产出幼螺，从 而获得1 〇〇%螺的雄性四倍体纯系。
[0008] 实施例二 螺雄性四倍体纯系高效育成方法，包括如下步骤： (1) 他莫昔芬喂养料的配备:取纯度为95%以上的他莫昔芬粉剂，加入到螺人工饲养饲 料中，制成喂养料，其中他莫昔芬含量为20g/500g喂养料，待用； (2) 投喂:在母螺产卵前10天，按常规饲料投喂方法对母螺进行投喂他莫昔芬喂养料， 每天两次，早上8:00每100g母螺投喂5~5g，下午6:00每100g母螺投喂10g;至其卵发育成 熟，然后，取公螺放在一起，使其自然产卵受精，得受精怀卵母螺； (3) 热休克处理:观察怀卵母螺受精卵的发育情况，在受精卵第一次卵裂前3min，把步 骤(2)中的怀卵母螺放入溶氧达8mg/l(通过人工充氧）、温度为39°C恒温水中，热休克3min， 待用； (4) 雌激素抑制剂溶液的配制:将氯米芬和睾酮一起溶于90%的乙醇中，再加蒸馏水配 制成雌激素抑制剂溶液，其中雌激素抑制剂溶液中氯米芬的浓度为180mg/l，睾酮的浓度为 30mg/l； (5) 取步骤(3)处理后的怀卵母螺，放入用步骤(4)所制备的雌激素抑制剂溶液中，常温 泡浴60S，怀卵母螺与溶液比为1:2，通过充氧，使溶液中的氧气含量达10mg/l; (6) 取步骤(5)处理后的怀卵母螺，放入育苗池中进行常规育苗培育;直至产出幼螺，从 而获得1 〇〇%螺的雄性四倍体纯系。
[0009] 上述两个实施例仅为本发明的优选方案之二，并不能限制本发明的保护范围，任 意与本发明等同或相似的技术手段视为本发明的保护范围。以下附上本发明部分处理方式 及结果统计。
[0010]附:螺雄性四倍体育成结果统计
注:上述结果是母螺产卵前10天投喂他莫昔芬，一次卵裂前3min热休克保持3min，雌激 素抑制剂浸泡60s所取得的结果。
【主权项】
1.螺雄性四倍体纯系高效育成方法，包括如下步骤： (1) 他莫昔芬喂养料的配备：取纯度为95%以上的他莫昔芬粉剂，加入到螺人工饲养饲 料中，制成喂养料，其中他莫昔芬含量为10~20g/500g喂养料，待用； (2) 投喂：在母螺产卵前5~10天，按常规饲料投喂方法对母螺进行投喂他莫昔芬喂养 料，每天两次，早上8:00每100g母螺投喂5~10g，下午6:00每100g母螺投喂8~10g;至其卵 发育成熟，然后，取公螺放在一起，使其自然产卵受精，得受精怀卵母螺； (3) 热休克处理:观察怀卵母螺受精卵的发育情况，在受精卵第一次卵裂前2~3min，把 步骤⑵中的怀卵母螺放入溶氧达5~8mg/l、温度为39~42°C恒温水中，热休克3~5min，待 用； (4) 雌激素抑制剂溶液的配制:将氯米芬和睾酮一起溶于80%~90%的乙醇中，再加蒸馏 水配制成雌激素抑制剂溶液，其中雌激素抑制剂溶液中氯米芬的浓度为100~200mg/l，睾 酮的浓度为10~50mg/l; (5) 取步骤(3)处理后的怀卵母螺，放入用步骤(4)所制备的雌激素抑制剂溶液中，常温 泡浴60~120S，怀卵母螺与溶液比为1:2，通过充氧，使溶液中的氧气含量达5~10mg/l; (6) 取步骤(5)处理后的怀卵母螺，放入育苗池中进行常规育苗培育;直至产出幼螺，从 而获得1 〇〇%螺的雄性四倍体纯系。
【文档编号】A01K61/00GK105994077SQ201610496053
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月30日
【发明人】杨品红, 黄海洪, 类延菊
【申请人】湖南文理学院