半野生棉萌发期复合盐碱抗性鉴定方法
【专利摘要】本发明涉及植物抗逆生理学，具体涉及半野生棉萌发期复合盐碱抗性鉴定方法。所述方法包括以下步骤：1)对半野生棉种子进行浓硫酸脱绒，然后消毒；2)制备复合盐碱培养基质；3)播种；4)统计与结果分析，评价棉花半野生棉材料的抗性水平。该方法可以迅速准确的筛选出高抗盐碱的半野生棉材料，抗性稳定，不仅能忍受单一的盐胁迫，更能适应复杂多变的实际逆境，因而更有实践利用价值和意义。
【专利说明】
半野生棉萌发期复合盐碱抗性鉴定方法
技术领域
[0001] 本发明涉及植物抗逆生理学，具体涉及半野生棉萌发期复合盐碱抗性鉴定方法。
【背景技术】
[0002] 半野生棉（semi-wild cotton)是陆地棉野生种系，未经人工驯化过，产于中美洲 的墨西哥高地和加勒比海地区，存在有丰富的抗逆基因源。
[0003] 现如今关于棉花抗盐性的研究大多集中在单一盐(NaCl)上，然而自然界的环境中 往往是多种盐复合存在，并且盐与碱混合伴生，这样造成了单一盐研究的结果在实践中收 不到预期的结果，不能解决实践问题。我国新疆地区存在很大面积的盐碱土，并且具有复杂 的盐碱环境，其特点是盐碱离子成分多、积盐重、面积大。
[0004]目前棉花栽培品种耐盐碱性筛选方法主要为萌发期出苗率鉴定方法，此方法为大 田筛选法且主要针对栽培棉种，半野生棉材料中存在有部分材料的种壳坚硬，自然萌发率 低的现象。同时大田鉴定方法存在大田盐分分布不均匀、受环境影响大、鉴定周期长(45天 左右)等缺点，造成实验结果重复性差。而且仅用发芽率作为评价标准，过于单一，结果受主 观影响大。因此，探索一种适合半野生棉萌发期盐碱抗性的标准方法和评价体系，以迅速准 确的筛选出高抗盐碱的半野生棉材料，抗性稳定、可靠，不仅能忍受单一的盐胁迫(NaCl)， 更能适应复杂多变的实际逆境(如多离子毒害、碱胁迫），因而更有实践利用价值和意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供半野生棉萌发期复合盐碱抗性鉴定方法，用来弥补棉花盐碱 抗性筛选方法的不足，以期能够快速准确的对棉花半野生种质资源的进行客观鉴定，为棉 花抗盐碱育种的培育提供依据。
[0006] 根据本发明的半野生棉萌发期复合盐碱抗性鉴定方法，其特征在于，所述方法包 括以下步骤：
[0007] 1)对半野生棉种子进行浓硫酸脱绒，然后消毒，清水冲洗晾干，加热干燥以打破种 子休眠，在种子珠孔端切一个小口，以不伤害胚根为准；
[0008] 2)制备复合盐碱培养基质:选择直径为0.05mm~0.80mm的沙子，洗涤，灭菌，烘干， 配制复合盐碱溶液，按照复合盐碱溶液/干沙子质量比16 %混匀，作为复合盐碱培养基质， 其中所述复合盐碱溶液配制方法如下：
[0009] 1L复合盐碱溶液按质量包括2.67g CaCl2,〇.18g NaHC03,5.01g Na2S〇4,〇.42g K2S04,3.59g MgS04 · 7H20,PH=7.5；
[0010] 3)播种:在上述步骤2)制备的复合盐碱培养基质上培养步骤1)处理过的半野生棉 棉种，置于温度28°C，湿度85%，光照12h，黑暗12h的条件的温室中，培养14天；
[0011] 4)统计与结果分析:待生长至14天时，统计发芽数，对每株棉苗的受害情况调查和 评分，评价棉花半野生棉材料的抗性水平。
[0012] 根据本发明的【具体实施方式】，半野生棉萌发期复合盐碱抗性鉴定方法，包括以下 步骤：
[0013] 1、种子的前处理:种子硫酸脱绒，NaCIO消毒处理种子并置40度烘箱24h打破种子 休眠，选择籽粒饱满成熟的种子，用单面刀片在种子合点端(钝端)切小口，大小ImmX 1mm， 种壳切破露出种仁即可。
[0014] 2、制备复合盐碱培养基质:选择直径为0.05mm~0.80mm的沙子，洗涤，灭菌，烘干； 配置盐碱处理液，按照质量比16% (水/干沙子）的含水量与配制的复合盐碱溶液混匀作为 盐碱培养基质；对照基质按照质量比16% (水/干沙子）加入无菌水，混匀作为对照培养基 质；
[0015] 3、播种并培养棉苗:发芽盒下层铺合适厚度的沙子，每盒播种6行，每行5粒，每两 行一个材料(或重复），盖上合适厚度的沙子，置于温度28°C，湿度85%，光照12h，黑暗12h的 条件下，培养14天；
[0016] 现有的鉴定棉花盐碱抗性的方法未有关于温室之内进行棉花盐碱抗性鉴定的报 道，本发明为专门针对半野生棉材料中有部分材料存在种壳较硬的情况进行的特别优化， 如果采用生产上棉花常规育苗方法，部分半野生棉不能正常发芽;本发明专门为温室内鉴 定盐碱抗性设计的复合盐碱培养基质。因为目前的鉴定方法均为大田鉴定方法，没有进行 温室之内鉴定盐碱抗性的先例，该复合盐碱培养基质法为针对大田中土壤盐分含量不均的 情况;本发明采用的发芽盒种植方法是针对大田中气候变化无常，水分散失过快的情况做 的优化;抗性分级评分标准是专门根据本专利方法进行的数字化指数标准。
[0017] 4、统计与结果分析:最后一天统计每一个半野生棉材料的出苗率以及针对每一株 棉苗进行评分。对每一株棉苗进行客观分级评分是实验的关键。根据出苗率和评分结果对 半野生棉抗性进行评价。
[0018] 本发明为半野生棉萌发期复合盐碱抗性鉴定方法，具有以下优点：
[0019] 1、首次进行室内半野生棉复合盐碱抗性的鉴定，这种鉴定方法更贴近大田盐碱地 的真实情况，而且材料和沙子经过前期灭菌处理，避免了细菌的干扰，实验中对照材料出苗 均匀一致，根系发育完整，萌发期一致，保证了鉴定的准确性。
[0020] 2、首次选用化合物配方模拟大田盐碱地的盐碱环境和完全混匀一致的复合盐碱 培养基，这样相较于大田鉴定来说减少了因为田地的盐碱含量不均匀所导致的鉴定结果不 准确性，结果稳定可靠。
[0021] 3、该方法不受季节控制，鉴定周期短，可短时间鉴定棉花材料或品种的盐碱抗性。 半野生棉萌发期复合盐碱抗性鉴定方法，鉴定周期为14天，播种后第14天统计发芽率，统计 每株棉苗的生长状况进行评分。较大田鉴定(45天左右)缩短30天，可快速进行材料萌发期 盐碱抗性筛选，为加速抗逆育种提供技术支持。
[0022] 4、投入的人力物力小，省工又经济。半野生棉萌发期复合盐碱抗性鉴定方法，使用 商品河沙、分析纯试剂和种子发芽盒，而且都是经过高温消毒，省去大量的人力和物力的投 入，可进行大批量材料的鉴定;易于推广和利用。
【附图说明】
[0023]图1棉苗抗性分级评分标准。
[0024]图2对照处理组和复合盐碱处理组半野生棉材料的萌发情况对比：l_a，陆地棉（中 16)正常萌发。1-b，半野生棉(玛丽加朗特棉85)正常萌发。1-c，半野生棉（阔叶棉40)正常萌 发。2-a，陆地棉（中16)发芽率为70%，然而仅有3株幼苗生长正常，其余四株受害严重，综合 重复情况耐盐碱水平为抗，2-b，半野生棉(玛丽加朗特棉85)没有明显的受害特征，生长良 好，耐盐碱水平为高抗。2-c，半野生棉（阔叶棉40 )，仅有一粒种子发芽，受害严重，耐盐碱水 平为高感。
【具体实施方式】
[0025]实施例1采用半野生棉萌发期复合盐碱抗性鉴定方法对半野生棉（阔叶棉40、阔叶 棉27、尖斑棉25、阔叶棉32、阔叶棉120、玛丽加朗特棉85)以及栽培棉（中12、中16、鄂荆一 号、7124)的耐盐碱水平进行鉴定和评价。
[0026] 1、棉花材料：
[0027] 半野生棉（阔叶棉40、阔叶棉27、尖斑棉25、阔叶棉32、阔叶棉120、玛丽加朗特棉 85 )，陆地棉（中12、中16、鄂荆一号），海岛棉(7124)为栽培棉对照材料。
[0028] 2、种子的前处理：
[0029] 将所有带短绒的种子进行硫酸脱绒，挑选大小一致，乌黑饱满、无虫害的完整的成 熟种子再用5 %次氯酸钠溶液浸泡10分钟，清水洗净，晾干，置40度烘箱中加热干燥24h以打 破种子休眠，然后单面刀片将半野生棉的种子珠孔端(尖端)切小口，露出种仁即可在切一 小口，以不伤害胚根为准。
[0030] 3、制备复合盐碱培养基质：
[0031 ] 选择直径为0.05mm~0.80mm的沙子，洗涤，灭菌，烘干;配置盐碱处理液，用NaOH调 整PH至7.5，按照质量比16% (水/干沙子)的含水量与设计好的混合盐碱溶液混匀作为盐碱 培养基质;对照处理按照质量比16% (水/干沙子)加入无菌水，混匀作为对照培养基质。 [0032]混合盐碱溶液配制方法如下：
[0033]
[0034] 4、置床培养：
[0035]选用12Cm*19Cm*13cm的发芽盒，首先在发芽盒底部铺上一层厚度约为（10-20)mm 的基质，抹平，种子均匀播在湿砂上，每盒6排，每排5粒，粒与粒之间保持一定的距离，每两 排一个材料，最后上部加盖（10-15)mm湿砂，抹平，盖上盖子，置于温度28°C，湿度85%，光照 12h，黑暗12h的条件下，培养14天；
[0036]按同样的方法设置对照组。
[0037] 5、统计与抗性分级：
[0038] 第14日调查半野生棉萌发情况，统计发芽率。同时根据评分标准度每一株棉苗进 行评分。耐盐碱水平分级:按照本发明的评分标准，对每个材料进行评分，依据
[0039] 公式计算耐盐碱指数，对材料的耐盐碱水平进行分级，结果见表2:
[0041]
[0040] 表2:半野生棉耐盐碱水平评价结果
[0043] 2013年新疆盐碱次生盐碱地块筛选结果[0044]
[0042]
[0045]~2015年新疆盐碱次生盐碱地块筛选结果
[0046]
[0047]
[0048] 田间数据只有出苗率一种指标作为评价抗性的标准，同时由于地块中的盐分变 化、气候、土壤含水量等的不确定性往往会造成每年重复之间出苗率不一样，但是按照抗性 排名进行抗性分级的抗性趋势是一致的。
[0049] 本试验的方法为进过多次改进优化的方法，优化配方过程如下：
[0050] (第一次优化）1L复合盐碱溶液按质量包括5.66g Ca(N〇3)2 · 4H20 2， 0.152gNaHC03,5.01g Na2S〇4,7.99g K2S〇4,5.94g MgS〇4.7H20，PH = 8;此配方造成了阔叶 棉32发芽率十分低、中S9612出苗率十分高，无法与大田抗性趋势一致。
[0051]
[0052] (第二次优化）1L复合盐碱溶液按质量包括0.46g NaCl，0.152g NaHC03， 2.73gNa2S〇4,2.67g CaCl2,5.44g MgS〇4· 7H20，PH=8;此配方造成了阔叶棉32发芽率十分 低，无法与大田抗性趋势一致。此次试验发现每个材料的相对发芽率均偏高，无法进行准确 判断。
[0053]
[0054]
【主权项】
1. 半野生棉萌发期复合盐碱抗性鉴定方法，其特征在于，所述方法包括W下步骤： 1) 对半野生棉种子进行浓硫酸脱绒，然后消毒，清水冲洗惊干，加热干燥W打破种子休 目民，在种子珠孔端切一个小口，W不伤害胚根为准； 2) 制备复合盐碱培养基质:选择直径为0.05mm~0.80mm的沙子，洗涂，灭菌，烘干，配制 复合盐碱溶液，按照复合盐碱溶液/干沙子质量比16 %混匀，作为复合盐碱培养基质，其中 所述复合盐碱溶液配制方法如下： 1L复合盐碱溶液按质量包括2.67g CaCl2,0.18g 化HC〇3,5.01g 化2S〇4,0.42g K2SO4， 3.59g MgS〇4 · 7出0，PH=7.5; 3) 播种：在上述步骤2)制备的复合盐碱培养基质上培养步骤1)处理过的半野生棉棉 种，置于溫度28°C，湿度85%，光照12h，黑暗12h的条件下，培养14天； 4) 统计与结果分析:待生长至14天时，统计发芽数，对每株棉苗的受害情况调查和评 分，评价棉花半野生棉材料的抗性水平。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤4)中，按照W下标准对棉花受害情 况调查和评分： 0分-未萌发种子； 1分-种子刚破上、未破壳； 2分-种子未破壳，但已生长至正常高度和种子刚破±，但已破壳； 3分-棉苗未至正常高度，子夜卷曲、发黄； 4分-棉苗正常生长，子叶展开。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤4)中，W耐盐碱指数评价棉花半野 生棉材料的抗性水平， 耐盐碱指数计算公式为： 耐盛碱騰数=其中，Στ康示处理组，Σ〇(表示对照组，f为该级别的株数，X为相应级别的分值，范围为 0-4, η为播种数。
【文档编号】A01C1/02GK106069243SQ201610395489
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月6日 公开号201610395489.6, CN 106069243 A, CN 106069243A, CN 201610395489, CN-A-106069243, CN106069243 A, CN106069243A, CN201610395489, CN201610395489.6
【发明人】韦洋洋, 李振庆, 许艳超, 周忠丽, 刘方, 蔡小彦, 王星星, 王玉红, 王春英, 张振梅, 王坤波
【申请人】中国农业科学院棉花研究所