一种大麦花药诱导培养方法
【专利摘要】本发明公开一种大麦花药诱导培养方法，包括供体取穗、消毒、冷藏、提取小孢子、黑暗处理、接种、诱导培养等步骤，并对其培养基组分优化。本发明涉及的大麦花药诱导培养方法提高大麦花药愈伤组织分化率、降低白化率，对大麦品种甘啤3号、金川3号的愈伤组织诱导率高达63.5％和72.8％，显著提高大麦花药培养效率，具有较高的产业推广前景。
【专利说明】
一种大麦花药诱导培养方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种大麦育种方法，具体涉及一种大麦花药诱导培养的方法，属于现 代农业高新技术领域。
【背景技术】
[0002] 大麦栽培历史悠久，是第一个被驯化的谷类作物，以其适应性广、抗逆性强(包括 耐寒、耐旱、耐盐碱等）、用途广泛而在全世界种植。大麦的种植面积和总产仅次于小麦、水 稻、玉米，为第四大谷物，其主要应用为啤酒生产原料和动物饲料。
[0003] 大麦新品种选育中应用单倍体技术可以简化和加速育种程序，缩短育种时间，因 而受到国内外育种家的青睐。早在1971年和1973年Clapham就报道首次得到了大麦花药愈 伤组织和花粉植株，大麦花药培养技术自此受到各国学者的普遍重视，花粉植株不仅是遗 传研究的良好群体，而且对单倍体育种也有实践意义。现有技术的花药培养集成了杂交育 种、诱变育种、细胞学、遗传学等各种生物科学的内容，是大麦育种学发展的趋势之一。
[0004] 然而，迄今为止，大麦花药培养的去分化和分化频率仍然较低，加之各基因型之间 的差异很大，从而限制了该技术在育种上的应用。因此，进一步提高大麦花药离体培养效率 有非常重要的科学价值和实践意义。影响大麦花药培养效果的因素多种多样，既包括由植 株本身所决定的从基因型差异、花药的发育时期及供体植株的生理状态等内在条件;也包 括基本培养基成分、激素及培养温度等外界因素。从花培育种角度考虑，对于优良品种的改 良和培育，往往需要从大量的花培后代中筛选优良家系，需要更大规模的培育花培子代，所 以改善培养条件、提高花培效率是花培育种的最现实的需求。
【发明内容】
[0005] 在大麦花药培养过程中，愈伤组织分化是很重要的一步，花药愈伤组织分化率和 白化率水平极大地影响着花药培养的效率。本发明目的是提供一种大麦花药诱导培养方 法，并通过组合和优化提供实用的大麦花药诱导、分化培养基组分。
[0006] 具体方法为:选取大麦的花药培养供体，正季播种，从大田中选取中部小花小孢子 发育处于单核早期、中期的小穗，取穗后用70%乙醇表面消毒，然后用塑料薄膜包住整个大 麦穗，保持大麦穗湿润放入冰箱中，在4°C下低温预处理3天;每个试管接5个穗子，倒入30ml 提取液，用高速分散器超速旋切，用300目筛网过滤，滤液离心2~lOmin，重复3~5次，收集 小孢子。所述小孢子用提取液于25°C、黑暗预处理2d。
[0007] 培养前将小孢子先用20%麦芽糖纯化，再用培养基洗涤1次，然后将小孢子悬浮液 接种于培养基中，进行诱导培养，在22~28°C下暗培养2~3天后，环境条件控制为25~29 °C、光周期16h75001x光照8h黑暗。
[0008] 所述提取液的成分为：10~15%甘露醇、1~2g/L CaCl2、1.2~1.5g/L N-吗啡乙 烷磺酸MES，15~20 %蔗糖，优选为：12 %甘露醇、1.5g/L CaCl2、1.3g/L N-吗啡乙烷磺酸 MES，17% 蔗糖。
[0009] 所述大麦花药分化培养基的组分为：
[0010] KN〇3 3000~3500mg/L，NH4N〇3 2500~2800mg/L，KH2P〇4 360~400mg/L，CaCl2 · 2H20 580~640mg/L，MgS04.7H20 250~300mg/L，Na2-EDTA50~80mg/L，FeS04.7H20 35~ 45mg/L，MnS〇4*4H2〇30~45mg/L，ZnS〇4*7H2〇15~20mg/L，H3B〇3 8.5~10.0mg/L，KI1.5 ~2.0mg/L，CuS〇4 · 5H20 0.05~0.08mg/L，Na2Mo〇4 · 2H20 0.5~0.8mg/L，CoCl2 · 6H2O 0 · 05 ~0 · 08mg/L，肌醇30~60mg/L，甘氛酸2 · 5~3 · 5mg/L，维生素 B1 0 · 65 ~0 · 85mg/L，维生 素 B6 0.65~0.85mg/L，烟酸0.85~0.90mg/L，蔗糖 16~20g/L，琼脂4~5g/L，激动素 KT 2.8 ~3.2mg/L，蔡乙酸ΝΑΑ 0.65~0.85mg/L，山梨醇32~40g/L，生物素0· 15~0.20mg/L;
[0011 ] 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷0~600mg/L，水解蛋白0~1.5g/L，植物硫化激动素 PSK-αΟ~0 · 2mg/L，胰岛素0~4 · Omg/L，脱落酸ΑΒΑ 0~0 · 5mg/L，赤霉素 GA30~1 · 2mg/L，调 环酸1丐〇~1. 〇mg/L。
[0012] 所述大麦花药分化培养基的优选组分为：
[0013] KN〇3 3200mg/L，NH4N03 2730mg/L，KH2P〇4 385mg/L，CaCl2 · 2H20610mg/L，MgS〇4 · 7H2O 280mg/L，Na2-EDTA 67.5mg/L，FeS〇4 · 7H2O 40mg/L，MnS〇4 · 4H2O 35mg/L，ZnS〇4 · 7H2O 18mg/L，H3B〇3 9mg/L，KI 1.8mg/L，CuS〇4.5H2〇 0.065mg/L，Na2Mo〇4.2H2〇 0.65mg/L， &3(312,6!12〇0.0611^凡，肌醇4〇11^凡，甘氨酸3.〇11^凡，维生素1310.711^凡，维生素136 0.711^/ L，烟酸0 · 86mg/L，蔗糖18g/L，琼脂4 · 5g/L，激动素 KT 3 · Omg/L，萘乙酸NAA 0 · 7mg/L，山梨醇 35g/L，生物素 0· 17mg/L;
[0014] 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷300~600mg/L，水解蛋白0.75~1.5g/L，植物硫化激动 素 PSK-αΟ · 1 ~0 · 2mg/L，胰岛素2 · 0~4 · Omg/L，脱落酸ΑΒΑ 0 · 25~0 · 5mg/L，赤霉素 GA3 0 · 6 ~1 · 2mg/L，调环酸|丐0 · 5 ~1 · Omg/L。
[0015] 更进一步优选，所述大麦花药分化培养基的组分为：KN〇3 3200mg/L，NH4N03 2730mg/L，KH2P〇4 385mg/L，CaCl2.2H2〇 610mg/L，MgS〇4.7H2〇280mg/L，Na2_EDTA 67.5mg/ L，FeS〇4.7H20 40mg/L，MnS〇4.4H20 35mg/L，ZnS〇4.7H20 18mg/L，H3B03 9mg/L，KI 1.8mg/ L，CuS〇4 · 5H20 0.065mg/L，Na2Mo〇4 · 2H20 0.65mg/L，CoCl2 · 6H2O 0.06mg/L，肌醇40mg/L， 甘氨酸3.〇11^凡，维生素1310.711^凡，维生素136 0.711^凡，烟酸0.8611^凡，鹿糖18〖凡，琼脂 4.5g/L，激动素 KT 3.0mg/L，萘乙酸NAA 0.7mg/L，山梨醇35g/L，生物素0.17mg/L;
[0016] 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷320mg/L，水解蛋白0.85g/L，植物硫化激动素 PSK-a 0 · 12mg/L，胰岛素2 · 6mg/L，脱落酸ΑΒΑ 0 · 28mg/L，赤霉素 GA3 0 · 8mg/L，调环酸|丐0 · 5mg/L。
[0017] 本发明涉及的一种大麦花药诱导培养方法及其培养基的组分，提高大麦花药愈伤 组织分化率和降低白化率，大大提高大麦花药培养的效率。本发明涉及的大麦花药分化培 养方法及其培养基对大麦品种甘啤3号、金川3号的愈伤组织诱导率高达63.5%和72.8%， 对大麦单倍体育种和大麦花药培养技术在遗传转化中的应用具有较大的实用价值，具有较 高的产业推广前景。
【具体实施方式】
[0018] 下面通过具体实施例，进一步对本发明的技术方案进行具体说明。应该理解，下面 的实施例只是作为具体说明，而不限制本发明的范围，同时本领域的技术人员根据本发明 所做的显而易见的改变和修饰也包含在本发明范围之内。
[0019] 下面实施例1~10的区别为大麦花药分化培养基不同，而培养供体的选择、愈伤组 织的诱导培养方法、操作方法相同，具体方法为：
[0020] 选取大麦品种甘啤3号和金川3号的花药培养供体，正季播种，从大田中选取中部 小花小孢子发育处于单核早期、中期的小穗，取穗后用70%乙醇表面消毒，然后用塑料薄膜 包住整个大麦穗，保持大麦穗湿润放入冰箱中，在4°C下低温预处理3天;每个试管接5个穗 子，倒入30ml提取液，用高速分散器超速旋切，用300目筛网过滤，滤液离心2~lOmin，重复3 ~5次，收集小孢子。小孢子用提取液于25°C、黑暗预处理2d。
[0021] 培养前将小孢子先用20%麦芽糖纯化，再用培养基洗涤1次，然后将小孢子悬浮液 接种于培养基中，进行诱导培养，在22~28°C下暗培养2~3天后，环境条件控制为25~29 °C、光周期16h75001x光照8h黑暗。
[0022] 绿苗产生后（长到2cm左右），计算愈伤组织分化率和白化苗率。愈伤组织分化率 (绿苗分化率）（％ )=分化绿苗数/转移的愈伤块数X 100% (本发明所述的分化率除特别指 明均认为是绿苗分化率）；白化苗率（％ )=白化苗数/转移的愈伤块数X 100%。
[0023] 以下实施例1~9中为大麦花药分化培养基的组分。
[0024] 实施例1
[0025] KN〇3 3200mg/L，NH4N03 2730mg/L，KH2P〇4 385mg/L，CaCl2 · 2H20610mg/L，MgS〇4 · 7H20 280mg/L，Na2-EDTA 67.5mg/L，FeS〇4 · 7H20 40mg/L，MnS〇4 · 4H20 35mg/L，ZnS〇4 · 7H20 18mg/L，H3B〇3 9mg/L，KI 1.8mg/L，CuS〇4.5H2〇 0.065mg/L，Na2Mo〇4.2H2〇 0.65mg/L， CoCl2,6H2〇 0.06mg/L，肌醇40mg/L，甘氨酸3.0mg/L，维生素B1 0.7mg/L，维生素B6 0.7mg/ L，烟酸0 · 86mg/L，蔗糖18g/L，琼脂4 · 5g/L，激动素KT 3 · Omg/L，萘乙酸NAA 0 · 7mg/L，山梨醇 35g/L，生物素 0· 17mg/L;
[0026] 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷320mg/L，水解蛋白0.85g/L，植物硫化激动素 PSK-a 0 · 12mg/L，胰岛素2 · 6mg/L，脱落酸ΑΒΑ 0 · 28mg/L，赤霉素 GA3 0 · 8mg/L，调环酸|丐0 · 5mg/L。
[0027] 实施例2
[0028] 变量为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷添加浓度：
[0029] KN〇3 3200mg/L，NH4N03 2730mg/L，KH2P〇4 385mg/L，CaCl2 · 2H20610mg/L，MgS〇4 · 7H20 280mg/L，Na2-EDTA 67.5mg/L，FeS〇4 · 7H20 40mg/L，MnS〇4 · 4H20 35mg/L，ZnS〇4 · 7H20 18mg/L，H3B〇3 9mg/L，KI 1.8mg/L，CuS〇4.5H2〇 0.065mg/L，Na2Mo〇4.2H2〇 0.65mg/L， &3(312,6!12〇0.0611^凡，肌醇4〇11^凡，甘氨酸3.〇11^凡，维生素1310.711^凡，维生素136 0.711^/ L，烟酸0 · 86mg/L，蔗糖18g/L，琼脂4 · 5g/L，激动素KT 3 · Omg/L，萘乙酸NAA 0 · 7mg/L，山梨醇 35g/L，生物素 0· 17mg/L;
[0030] 水解蛋白0 · 85g/L，植物硫化激动素 PSK-aO · 12mg/L，胰岛素2 · 6mg/L，脱落酸ABA 0 · 28mg/L，赤霉素 GA3 0 · 8mg/L，调环酸钙0 · 5mg/L。
[0031 ] 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的添加浓度设置以下7种:0,100mg/L，200mg/L，300mg/ L，400mg/L，500mg/L，600mg/L。
[0032] 实施例3
[0033] 变量为水解蛋白添加浓度：
[0034] KN〇3 3200mg/L，NH4N03 2730mg/L，KH2P〇4 385mg/L，CaCl2 · 2H20610mg/L，MgS〇4 · 7H20 280mg/L，Na2-EDTA 67.5mg/L，FeS〇4 · 7H20 40mg/L，MnS〇4 · 4H20 35mg/L，ZnS〇4 · 7H20 18mg/L，H3B〇3 9mg/L，KI 1.8mg/L，CuS〇4.5H2〇 0.065mg/L，Na2Mo〇4.2H2〇 0.65mg/L， CoCl2,6H2〇 0.06mg/L，肌醇40mg/L，甘氨酸3.0mg/L，维生素 B1 0.7mg/L，维生素 B6 0.7mg/ L，烟酸0 · 86mg/L，蔗糖18g/L，琼脂4 · 5g/L，激动素 KT 3 · Omg/L，萘乙酸NAA 0 · 7mg/L，山梨醇 35g/L，生物素 0· 17mg/L;
[0035] 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷320mg/L，植物硫化激动素 PSK_a〇.12mg/L，胰岛素 2.6mg/L，脱落酸ABA 0.28mg/L，赤霉素 GA3 0.8mg/L，调环酸l^jO.Smg/L。
[0036] 水解蛋白设置为以下 6种:0，0 · 3g/L，0 · 6g/L，0 · 9g/L，1 · 2g/L，1 · 5g/L。
[0037] 实施例4
[0038] 变量为植物硫化激动素 PSK-a添加浓度：
[0039] KN〇3 3200mg/L，NH4N03 2730mg/L，KH2P〇4 385mg/L，CaCl2 · 2H20610mg/L，MgS〇4 · 7H20 280mg/L，Na2-EDTA 67.5mg/L，FeS〇4 · 7H20 40mg/L，MnS〇4 · 4H20 35mg/L，ZnS〇4 · 7H20 18mg/L，H3B〇3 9mg/L，KI 1.8mg/L，CuS〇4.5H2〇 0.065mg/L，Na2Mo〇4.2H2〇 0.65mg/L， &3(312,6!12〇0.0611^凡，肌醇4〇11^凡，甘氨酸3.〇11^凡，维生素1310.711^凡，维生素136 0.711^/ L，烟酸0 · 86mg/L，蔗糖18g/L，琼脂4 · 5g/L，激动素 KT 3 · Omg/L，萘乙酸NAA 0 · 7mg/L，山梨醇 35g/L，生物素 0· 17mg/L;
[0040]异丙基-β-D-硫代半乳糖苷320mg/L，水解蛋白0 · 85g/L，胰岛素2 · 6mg/L，脱落酸 ABA 0.28mg/L，赤霉素 GA3 0.8mg/L，调环酸钙0.5mg/L。
[0041 ] 植物硫化激动素 PSK-α的添加浓度设置以下5种:0，0 · 05mg/L，0 · 10mg/L，0 · 15mg/ L，0.20mg/L。
[0042] 实施例5
[0043] 变量为植物硫化激动素 PSK-α添加浓度：
[0044] KN〇3 3200mg/L，NH4N03 2730mg/L，KH2P〇4 385mg/L，CaCl2 · 2H20610mg/L，MgS〇4 · 7H20 280mg/L，Na2_EDTA67.5mg/L，FeS〇4*7H2〇 40mg/L，MnS〇4.4H20 35mg/L，ZnS〇4.7H20 18mg/L，H3B〇3 9mg/L，KI 1.8mg/L，CuS〇4.5H2〇 0.065mg/L，Na2Mo〇4.2H2〇 0.65mg/L， &3(312,6!12〇0.0611^凡，肌醇4〇11^凡，甘氨酸3.〇11^凡，维生素1310.711^凡，维生素136 0.711^/ L，烟酸0 · 86mg/L，蔗糖18g/L，琼脂4 · 5g/L，激动素 KT 3 · Omg/L，萘乙酸NAAO · 7mg/L，山梨醇 35g/L，生物素 0· 17mg/L;
[0045]异丙基-β-D-硫代半乳糖苷320mg/L，水解蛋白0 · 85g/L，胰岛素2 · 6mg/L，脱落酸 ABAO · 28mg/L，赤霉素 GA3 0 · 8mg/L，调环酸钙0 · 5mg/L。
[0046] 植物硫化激动素 PSK-α添加浓度设置以下4种:0，0 · 08mg/L，0 · 14mg/L，0 · 18mg/L。
[0047] 实施例6
[0048] 变量为胰岛素添加浓度：
[0049] KN〇3 3200mg/L，NH4N03 2730mg/L，KH2P〇4 385mg/L，CaCl2 · 2H20610mg/L，MgS〇4 · 7H20 280mg/L，Na2_EDTA67.5mg/L，FeS〇4*7H2〇 40mg/L，MnS〇4.4H20 35mg/L，ZnS〇4.7H20 18mg/L，H3B〇3 9mg/L，KI 1.8mg/L，CuS〇4.5H2〇 0.065mg/L，Na2Mo〇4.2H2〇 0.65mg/L， &3(312,6!12〇0.0611^凡，肌醇4〇11^凡，甘氨酸3.〇11^凡，维生素1310.711^凡，维生素136 0.711^/ L，烟酸0 · 86mg/L，蔗糖18g/L，琼脂4 · 5g/L，激动素 KT 3 · Omg/L，萘乙酸NAA 0 · 7mg/L，山梨醇 35g/L，生物素 0· 17mg/L;
[0050] 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷320mg/L，水解蛋白0.85g/L，植物硫化激动素 PSK-a 0.12mg/L，脱落酸ABA 0.28mg/L，赤霉素 GA3 0.8mg/L，调环酸l^jCUmg/L。
[0051 ] 胰岛素添加浓度设置以下5种:Ο，lmg/L，2mg/L，3mg/L，4mg/L。
[0052] 实施例7
[0053] 变量为脱落酸ABA添加浓度：
[0054] KN〇3 3200mg/L，NH4N03 2730mg/L，KH2P〇4 385mg/L，CaCl2 · 2H20610mg/L，MgS〇4 · 7H20 280mg/L，Na2-EDTA 67.5mg/L，FeS〇4 · 7H20 40mg/L，MnS〇4 · 4H20 35mg/L，ZnS〇4 · 7H20 18mg/L，H3B〇3 9mg/L，KI 1.8mg/L，CuS〇4.5H2〇 0.065mg/L，Na2Mo〇4.2H2〇 0.65mg/L， CoCl2,6H2〇 0.06mg/L，肌醇40mg/L，甘氨酸3.0mg/L，维生素 B1 0.7mg/L，维生素 B6 0.7mg/ L，烟酸0 · 86mg/L，蔗糖18g/L，琼脂4 · 5g/L，激动素 KT 3 · Omg/L，萘乙酸NAA 0 · 7mg/L，山梨醇 35g/L，生物素 0· 17mg/L;
[0055] 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷320mg/L，水解蛋白0.85g/L，植物硫化激动素 PSK-a 0 · 12mg/L，胰岛素2 · 6mg/L，赤霉素 GA3 0 · 8mg/L，调环酸|丐0 · 5mg/L。
[0056]脱落酸ΑΒΑ添加浓度设置以下5种:0，0 · lmg/L，0 · 3mg/L，0 · 4mg/L，0 · 5mg/L。
[0057] 实施例8
[0058] 变量为赤霉素 GA3添加浓度：
[0059] KN〇3 3200mg/L，NH4N03 2730mg/L，KH2P〇4 385mg/L，CaCl2 · 2H20610mg/L，MgS〇4 · 7H20 280mg/L，Na2-EDTA 67.5mg/L，FeS〇4 · 7H20 40mg/L，MnS〇4 · 4H20 35mg/L，ZnS〇4 · 7H20 18mg/L，H3B〇3 9mg/L，KI 1.8mg/L，CuS〇4.5H2〇 0.065mg/L，Na2Mo〇4.2H2〇 0.65mg/L， &3(312,6!12〇0.0611^凡，肌醇4〇11^凡，甘氨酸3.〇11^凡，维生素1310.711^凡，维生素136 0.711^/ L，烟酸0 · 86mg/L，蔗糖18g/L，琼脂4 · 5g/L，激动素 KT 3 · Omg/L，萘乙酸NAA 0 · 7mg/L，山梨醇 35g/L，生物素 0· 17mg/L;
[0060] 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷320mg/L，水解蛋白0 · 85g/L，植物硫化激动素 PSK-a 0 · 12mg/L，胰岛素2 · 6mg/L，脱落酸ΑΒΑ 0 · 28mg/L，调环酸|丐0 · 5mg/L。
[0061 ]赤霉素 GA3添加浓度设置以下 5种:0，0 · 3mg/L，0 · 6mg/L，0 · 9mg/L，1 · 2mg/L。
[0062] 实施例9
[0063] 变量为调环酸钙添加浓度：
[0064] KN〇3 3200mg/L，NH4N03 2730mg/L，KH2P〇4 385mg/L，CaCl2 · 2H20610mg/L，MgS〇4 · 7H20 280mg/L，Na2-EDTA 67.5mg/L，FeS〇4 · 7H20 40mg/L，MnS〇4 · 4H20 35mg/L，ZnS〇4 · 7H20 18mg/L，H3B〇3 9mg/L，KI 1.8mg/L，CuS〇4.5H2〇 0.065mg/L，Na2Mo〇4.2H2〇 0.65mg/L， &3(312,6!12〇0.0611^凡，肌醇4〇11^凡，甘氨酸3.〇11^凡，维生素1310.711^凡，维生素136 0.711^/ L，烟酸0 · 86mg/L，蔗糖18g/L，琼脂4 · 5g/L，激动素 KT 3 · Omg/L，萘乙酸NAAO · 7mg/L，山梨醇 35g/L，生物素 0· 17mg/L;
[0065] 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷320mg/L，水解蛋白0 · 85g/L，植物硫化激动素 PSK-a 0 · 12mg/L，胰岛素2 · 6mg/L，脱落酸ABA0 · 28mg/L，赤霉素 GA3 0 · 8mg/L。
[0066]调环酸|丐添加浓度设置以下6种：0，0 · 2mg/L，0 · 4mg/L，0 · 6mg/L，0 · 8mg/L，1 · Omg/ L〇
[0067] 培养基对比实验
[0068] 将实施例2-9分别与实施例1进行对比，对比的结果如表1-8所示：
[0069] 表1异丙基-β-D-硫代半乳糖苷添加浓度效果对比
[0070]
[0071] 表2水解蛋白添加浓度效果对比
[0072]
[0074]表3植物硫化激动素 PSK-α添加浓度效果对比 [0075]
[0076]表4植物硫化激动素 PSK-a添加浓度效果对比
[0077]
[0078] 表5胰岛素添加浓度效果对比
[0079]
[0080] 表6脱落酸ΑΒΑ添加浓度效果对比
[0081]
[0082] 表7赤霉素GA3添加浓度效果对比
[0083]
[0084] 表8调环酸钙添加浓度效果对比
[0085]
[0086] 从表1-8可以看出，使用本发明所提供的培养基比使用其它任何对比培养基诱导 大麦花药愈伤组织的效率更高，表明本发明提供的技术方案中培养基的组分及配比是经过 大量单因子、多因子试验所筛选的最优组合，多年来我们亦围绕本发明的组合配比做了小 范围单因子改变优化组合试验。使用本发明所提供的培养基对大麦品种甘啤3号、金川3号 的愈伤组织诱导率高达63.5%和72.8%，充分说明了本发明提供的技术方案及其培养基是 对大麦花药诱导培养具有显著的技术效果，具有较高的产业推广价值和理论研究价值。
[0087] 实施例10
[0088]为了比较本发明所提供的培养基与现有技术采用的培养基对大麦愈伤组织诱导 培养效果的差异，本发明将实施例1与现有技术的2种大麦花药愈伤诱导培养基组分，配成 花药愈伤诱导培养基，同样选取大麦品种甘啤3号、金川3号作为花药供体诱导花药愈伤，计 算愈伤组织诱导率。
[0089]根据现有技术的文献1:孙月芳等《NaCl胁迫对不同基因型大麦花药离体培养的影 响》，配制的培养基为MS培养基:MS基本培养基+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+1.5mg/L KT+0.5mg/L BA+0.05mg/L NAA〇
[0090] 根据现有技术的文献2:何玉池等《大麦花药培养力的遗传模式分析》，配制的培养 基为M2培养基：FHG+IAAO . 5mg/L+KT 2.0mg/L+脯氨酸500mg/L+多效唑 1.5mg/L+麦芽糖 3.0%+琼脂 0.6%。
[0091] 培养基对比实验
[0092] 将实施例10与实施例1进行对比，对比的结果如下表所示：
[0093] 表9培养基对比实验
[0094]
[0095] 从不同培养基的诱导效果可以发现，实施例1提供的技术方案对大麦花药愈伤组 织的诱导率要显著高于基于其他2种诱导培养基的技术方案。
[0096]以上10个实施例可以说明本发明涉及的大麦花药诱导培养方法以及培养基，在大 麦花药愈伤组织的诱导方面具有明显的优势。
【主权项】
1. 一种大麦花药诱导培养方法，其特征在于:选取大麦的花药培养供体，正季播种，从 大田中选取中部小花小孢子发育处于单核早期、中期的小穗，取穗后用70%乙醇表面消毒， 然后用塑料薄膜包住整个大麦穗，保持大麦穗湿润放入冰箱中，在4°C下低温预处理3天;每 个试管接5个穗子，倒入30ml提取液，用高速分散器超速旋切，用300目筛网过滤，滤液离心2 ~lOmin，重复3~5次，收集小孢子;小孢子用提取液于25°C、黑暗预处理2d; 培养前将小孢子先用20%麦芽糖纯化，再用培养基洗涤1次，然后将小孢子悬浮液接种 于培养基中，进行诱导培养，在22~28°C下暗培养2~3天后，环境条件控制为25~29 °C、光 周期16h75001x光照8h黑暗； 所述提取液的成分为：1〇~15%甘露醇、1~28/1〇&(：12、1.2~1.58/11吗啡乙烷磺酸 MES，15~20 % 蔗糖； 其中，所述大麦花药分化培养基的组分为： KN〇3 3000~3500mg/L，NH4N〇3 2500~2800mg/L，KH2P〇4 360~400mg/L，CaCl2.2H20 580~640mg/L，MgS〇4 · 7H2〇 250~300mg/L，Na2-EDTA 50~80mg/L，FeS〇4 · 7H2〇 35~45mg/ L，MnS〇4.4H2〇30~45mg/L，ZnS〇4*7H2〇15~20mg/L，H3B〇3 8.5~10.0mg/L，KI1.5~ 2.0mg/L，CuS〇4 · 5H2O 0.05~0.08mg/L，Na2Mo〇4 · 2H2O 0.5~0.8mg/L，CoCl2 · 6H2O 0.05 ~0 · 08mg/L，肌醇30 ~60mg/L，甘氛酸2 · 5~3 · 5mg/L，维生素 B1 0 · 65~0 · 85mg/L，维生素 B6 0 · 65~0 · 85mg/L，烟酸0 · 85~0 · 90mg/L，蔗糖 16~20g/L，琼脂4~5g/L，激动素 KT 2 · 8~ 3.2mg/L，蔡乙酸NAA 0.65~0.85mg/L，山梨醇32~40g/L，生物素0· 15~0.20mg/L; 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷0~600mg/L，水解蛋白0~1.5g/L，植物硫化激动素 PSK-αΟ ~0 · 2mg/L，胰岛素0~4 · Omg/L，脱落酸ΑΒΑ 0~0 · 5mg/L，赤霉素 GA30~1 · 2mg/L，调环酸钙0 ~1·0mg/L〇2. 根据权利要求1所述的一种大麦花药诱导培养方法，其特征在于:所述提取液的成分 为：12%甘露醇、1.5g/L CaCl2、1.3g/L N-吗啡乙烷磺酸MES，17%蔗糖。3. 根据权利要求1或2所述的一种大麦花药诱导培养方法，其特征在于:所述大麦花药 分化培养基的组分为： KN〇3 3200mg/L，NH4N〇3 2730mg/L，KH2P〇4 385mg/L，CaCl2 · 2H20610mg/L，MgS〇4 · 7H20 280mg/L，Na2-EDTA 67.5mg/L，FeS〇4.7H20 40mg/L，MnS〇4.4H20 35mg/L，ZnS〇4.7H20 18mg/L，H3B〇3 9mg/L，KI 1.8mg/L，CuS〇4.5H2〇 0.065mg/L，Na2Mo〇4.2H2〇 0.65mg/L， CoCl2,6H2〇 0.06mg/L，肌醇40mg/L，甘氨酸3.0mg/L，维生素 B1 0.7mg/L，维生素 B6 0.7mg/ L，烟酸0 · 86mg/L，蔗糖18g/L，琼脂4 · 5g/L，激动素 KT 3 · Omg/L，萘乙酸NAA 0 · 7mg/L，山梨醇 35g/L，生物素 0· 17mg/L; 异丙基硫代半乳糖苷300~600mg/L，水解蛋白0.75~1.5g/L，植物硫化激动素 PSK-a〇 · 1 ~0 · 2mg/L，膜岛素2 · 0~4 · 0mg/L，脱落酸ΑΒΑ 0 · 25~0 · 5mg/L，赤霉素 GA3 0 · 6~ 1 · 2mg/L，调环酸|丐0 · 5~1 · 0mg/L。4. 根据权利要求3所述的一种大麦花药诱导培养方法，其特征在于:所述异丙基-β-D-硫代半乳糖苷为320mg/L。5. 根据权利要求3所述的一种大麦花药诱导培养方法，其特征在于：所述水解蛋白为 0.85g/L〇6. 根据权利要求3所述的一种大麦花药诱导培养方法，其特征在于:所述植物硫化激动 素 PSK-α为〇.12mg/L。7. 根据权利要求3所述的一种大麦花药诱导培养方法，其特征在于：所述胰岛素为 2·6mg/L〇8. 根据权利要求3所述的一种大麦花药诱导培养方法，其特征在于:所述脱落酸ΑΒΑ为 0.28mg/L〇9. 根据权利要求3所述的一种大麦花药诱导培养方法，其特征在于:所述赤霉素 GA3为 0.8mg/L〇10. 根据权利要求3所述的一种大麦花药诱导培养方法，其特征在于:所述调环酸钙为 0·5mg/L〇
【文档编号】A01H4/00GK106069768SQ201610495901
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月29日
【发明人】许建中, 安剑石, 林少会
【申请人】无锡南理工科技发展有限公司