一种三七胚性愈伤组织诱导培养方法
【专利摘要】本发明公开了一种三七胚性愈伤组织诱导培养方法，以三七植株幼嫩的茎、叶、花或花药作为外植体，经过灭菌、接种、及诱导培养，得到三七胚性愈伤组织；所述的诱导培养基为MS+0.1～2mg/L 2,4?D+0.1～2mg/L BA+0.002～2mg/L TDZ。本发明通过对光照时间、培养基、湿度、温度等条件控制，培养出诱导率较高的胚性愈伤组织。本发明通过光照的控制有效的促进胚性愈伤组织的形成，并在培养基中加入TDZ及与其他植物激素的搭配，使三七胚性愈伤组织的诱导率明显提高，并有助于愈伤组织的生长。
【专利说明】
一种三七胚性愈伤组织诱导培养方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物领域，具体涉及一种三七胚性愈伤组织诱导培养方法。
【背景技术】
[0002] 三七为五加科人参属植物，有"金不换"、"南国神草"、"参中之王"等美誉，是云南 特有的名贵中药材，也是我国中医药中一颗璀璨的明珠。
[0003] 根据组织学观察、外观特征及其再生性、再生方式等，愈伤组织分成两大类:胚性 愈伤组织和非胚性愈伤组织。一般胚性愈伤组织质地较坚实，颜色有乳白色或黄色，表面具 球形颗粒，其生长缓慢;从细胞学来看，胚性愈伤组织由等直径细胞组成，细胞较小，原生质 浓厚，无液泡，常富含淀粉粒，核大，分裂活性强。胚性愈伤组织更有利于在后续组培工作 中，在分化培养基上再生完整植株。
[0004] 因此，诱导培养胚性愈伤组织是利用组培技术培养三七植株的技术关键。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是根据提供一种通过组织培养手段培养出三七胚性愈伤组织，为分 化为三七完整植株提供基础。
[0006] 本发明提供的技术方案：
[0007] 一种三七胚性愈伤组织诱导培养方法，以三七植株幼嫩的茎、叶、花或花药作为外 植体，经过灭菌、接种、及诱导培养，得到三七胚性愈伤组织;所述的诱导培养基为MS+0.1~ 2mg/L 2,4-D+0.1 ~2mg/L M+0.002~2mg/L TDZ(即：在每一升的MS培养基中添加0.1 ~ 211^2,4-0、0.1~211^8八和0.002~111^丁02)。
[0008] 所述MS为MS培养基，2，4-D为2，4-二氯苯氧乙酸，BA为苄氨基腺嘌呤，TDZ为噻苯 隆。
[0009] 优选的，所述诱导培养的培养基为MS+0.5mg/L 2,4-D+0.1mg/L BA+0.008mg/L TDZ(即在每一升的MS培养基中添加0.5mg 2,4-D、0.1mg BA和0.008mg TDZ)。
[0010] 进一步的，所述诱导培养的光照控制为10~15小时光照、10~15小时黑暗，交替进 行。
[0011] 优选的，所述的光照控制的光强度为1500-20001x。
[0012]进一步的，所述的诱导培养的环境控制为温度：22°C - 25°C;空气相对湿度：50- 80% 〇
[0013] 进一步的，所述三七茎、叶、花作为外植体的灭菌方法为:选取健康的三七植株幼 嫩的茎、叶、花为外植体，用清水冲洗5~6次，将冲洗后的外植体置于浓度为0.1 %的升汞 中，浸泡灭菌后用无菌去离子水冲洗6~8次。
[0014] 进一步的，所述三七茎、叶、花作为外植体的接种方法为：在无菌环境中将经过灭 菌的茎、叶、花切割大小为0.5cm2的块状外植体;在无菌的条件下进行接种，每瓶培养基接 种3~5块外植体。
[0015] 进一步的，所述三七茎、叶、花作为外植体的诱导培养的周期为4~5周。
[0016] 进一步的，所述三七花药作为外植体的接种方法为:在无菌滤纸上剥取花药;在无 菌的条件下进行接种，将花药接种到组培瓶中，每瓶15~20粒；
[0017] 进一步的，所述三七花药作为外植体的诱导培养的周期为6~7周。
[0018]本发明的有益效果：
[0019] 本发明通过对光照时间、培养基、湿度、温度等条件控制，培养出诱导率较高的胚 性愈伤组织。本发明通过光照的控制有效的促进胚性愈伤组织的形成，并在培养基中加入 TDZ及与其他植物激素的搭配，使三七胚性愈伤组织的诱导率明显提高，并有助于愈伤组织 的生长。
[0020] 本发明利用组织培养繁殖效率高、生长周期短的优点，建立适合三七胚性愈伤组 织生长的组培条件，从而提供大量的优质的三七胚性愈伤组织，为从三七胚性愈伤组织分 化为三七植株提供基础，有利于自动化、规模化生产，提高生产效率。
【具体实施方式】
[0021] 实施例1
[0022] 一种三七胚性愈伤组织诱导培养方法，包括以下步骤：
[0023]选取健康的三七植株幼嫩的茎、叶、花作为外植体，用清水冲洗5次，先用70 %的酒 精灭菌l〇s，用无菌水冲洗3次后，再将冲洗后的外植体置于浓度为0.1 %的升汞中，浸泡灭 菌，无菌去离子水冲洗6次，备用。
[0024] 在无菌环境中将经过灭菌的茎、叶、花切割为0.5cm2的块状外植体;在无菌的条件 下，在酒精灯火焰附近打开组培瓶，瓶口在火焰上灼烧一下，将切好的外植体接种到培养基 上，每瓶培养基接种3~5块外植体。
[0025] 在MS+O.lmg/L 2,4-D+O.lmg/L BA+0.002mg/L TDZ的培养基中进行诱导培养。
[0026] 其中，光照控制为4小时光照条件和4小时黑暗条件交替进行，光照强度为15001x; 温度:22 °C ;空气相对湿度:50%。培养周期为4一5周。
[0027] 实施例2
[0028] 一种三七胚性愈伤组织诱导培养方法，包括以下步骤：
[0029]选取健康的三七植株幼嫩的茎、叶、花作为外植体，用清水冲洗6次，先用70 %的酒 精灭菌l〇s，用无菌水冲洗3次后，再将冲洗后的外植体置于浓度为0.1 %的升汞中，浸泡灭 菌，无菌去离子水冲洗8次，备用。
[0030] 在无菌环境中将经过灭菌的茎、叶、花切割为0.5cm2的块状外植体;在无菌的条件 下，在酒精灯火焰附近打开组培瓶，瓶口在火焰上灼烧一下，将切好的外植体接种到培养基 上，每瓶培养基接种5块外植体。
[0031] 其中的诱导培养基为MS+2mg/L 2,4-D+2mg/L BA+2mg/L TDZ。
[0032] 其中，光照控制为8小时光照条件和8小时黑暗条件交替进行，光照强度为20001x; 温度:25°C ;空气相对湿度:80% ;培养周期为5周。
[0033] 实施例3
[0034] 一种三七胚性愈伤组织诱导培养方法，包括以下步骤：
[0035]选取健康的三七的花药作为外植体，将三七花清水冲洗5次，先用70 %的酒精灭菌 l〇s，再将冲洗后的外植体置于浓度为0.1 %的升汞中，浸泡灭菌，无菌去离子水冲洗6次，备 用。
[0036] 在无菌滤纸上剥取花药;在无菌的条件下，在酒精灯火焰附近打开组培瓶，瓶口在 火焰上灼烧一下，将花药接种到组培瓶中，每瓶15粒；
[0037] 在MS+0.5mg/L 2,4-D+O.lmg/L BA+0.008mg/L TDZ的培养基中进行诱导培养。
[0038] 其中，光照控制为6小时光照条件和6小时黑暗条件交替进行，光照强度为16001x; 温度:22°C ;空气相对湿度:50%，培养周期为6周。
[0039] 实施例4
[0040] -种三七胚性愈伤组织诱导培养方法，包括以下步骤：
[0041 ]选取健康的三七的花药作为外植体，将三七花清水冲洗6次，先用70 %的酒精灭菌 10S，再将冲洗后的外植体置于浓度为0.1 %的升汞中，浸泡灭菌，无菌去离子水冲洗8次，备 用。
[0042] 在无菌滤纸上剥取花药;在无菌的条件下，在酒精灯火焰附近打开组培瓶，瓶口在 火焰上灼烧一下，将花药接种到组培瓶中，每瓶20粒；
[0043] 在MS+lmg/L 2,4-D+lmg/L BA+lmg/L TDZ的培养基中进行诱导培养。
[0044] 其中，光照控制为5小时光照条件和5小时黑暗条件交替进行，光照强度为17001x; 温度:25°C ;空气相对湿度:80%，培养周期为7周。
[0045] 不同植物激素对三七胚性愈伤组织的诱导率的影响试验：
[0046]选取5组健康的三七植株幼嫩的茎作为外植体，经过相同的灭菌处理，分别接种于 4组诱导培养基（l)MS+0.1mg/L 2,4-D、（2)MS+0.1mg/L BA、（3)MS+0.1mg/L TDZ、（4)MS+ O.lmg/L 2,4-D+O.lmg/L BA^(5)MS+0.lmg/L 2,4-D+O.lmg/L BA+O.lmg/L TDZ.
[0047]在相同的环境下进行培养，其中光照控制为12小时光照条件和12小时黑暗条件交 替进行，光照强度为20001x;温度:25°C ;空气相对湿度:80 % ;培养5周后对其胚性愈伤组织 的诱导率进行测试。
[0048]表1，不同植物激素对三七胚性愈伤组织的诱导率的影响 [0049]
[0050]从表1的结果可以看出，TDZ的添加能明显有利于三七的胚性愈伤组织的诱导。TDZ 与NAA和BA的协同作用明显的促进胚性愈伤组织的诱导及生长。
[0051]不同光照条件对胚性愈伤组织的诱导率的影响试验：
[0052]选取6组健康的三七植株幼嫩的茎作为外植体，经过相同的灭菌处理，接种于相同 的诱导培养基 MS+0. lmg/L 2,4-D+O. lmg/L BA+O.lmg/L TDZ 中。
[0053] 对其进行不同的光照处理，分别为（1)5小时光照条件和5小时黑暗条件交替进行， (2) 10小时光照条件和10小时黑暗条件交替进行，（3) 12小时光照条件和12小时黑暗条件交 替进行，（4) 15小时光照条件和15小时黑暗条件交替进行，（5)20小时光照条件和20小时黑 暗条件交替进行，（5)20小时光照条件和20小时黑暗条件交替进行。
[0054] 6组的光照强度为20001x;温度:25°C ;空气相对湿度:80% ;培养5周后对其胚性诱 导率进行测试。
[0055] 表1，不同光照条件对三七胚性愈伤组织的诱导率的影响
[0056]
[0057]从表2的结果可以看出，使用光照与黑暗交替的光照条件与三七愈伤组织中紫色 素的形成有影响，其中12小时光照条件和12小时黑暗条件最有利于胚性愈伤组织的形成， 提高诱导率及促进愈伤组织的生长。
[0058]不同光照强度对胚性愈伤组织的诱导率的影响试验：
[0059]选取5组健康的三七植株幼嫩的茎作为外植体，经过相同的灭菌处理，接种于相同 的诱导培养基MS+0.1mg/L 2,4-D+0.1mg/L BA+0.1mg/L TDZ中，置于温度：25°C;空气相对 湿度:80% ;6小时光照条件和6小时黑暗条件交替进行的环境中，。
[0060] 其中，5组的光照强度分别为8001x，10001x，20001x，25001x;培养5周后对其胚性 愈伤组织诱导率进行测试。
[0061] 表3,不同光照强度对三七胚性愈伤组织的诱导率的影响
[0062]
[0063] 从表3的结果可以看出，光照强度为
15001x~20001x的条件下有利于提高三七胚 性愈伤组织的诱导及形成。
【主权项】
1. 一种三七胚性愈伤组织诱导培养方法，其特征在于，以三七植株幼嫩的茎、叶、花或 花药作为外植体，经过灭菌、接种、及诱导培养，得到三七胚性愈伤组织;所述的诱导培养基 为MS+0.1~2mg/L 2,4-D+0.1~2mg/L BA+0.002~2mg/L TDZ。2. 根据权利要求1所述的一种三七胚性愈伤组织诱导培养方法，其特征在于，所述诱导 培养的培养基为MS+0.5mg/L 2,4-D+0.1mg/L BA+0.008mg/L TDZ。3. 根据权利要求1所述的一种三七胚性愈伤组织诱导培养方法，其特征在于，所述诱导 培养的光照控制为10~15小时光照、10~15小时黑暗，交替进行。4. 根据权利要求1所述的一种三七胚性愈伤组织诱导培养方法，其特征在于，所述的光 照控制的光强度为1500-20001x。5. 根据权利要求1所述的一种三七胚性愈伤组织诱导培养方法，其特征在于，所述的诱 导培养的环境控制为温度:22°C - 25°C ;空气相对湿度:50-80%。6. 根据权利要求1所述的一种三七胚性愈伤组织诱导培养方法，其特征在于，所述三七 茎、叶、花作为外植体的灭菌方法为:选取健康的三七植株幼嫩的茎、叶、花为外植体，用清 水冲洗5~6次，将冲洗后的外植体置于浓度为0.1 %的升汞中，浸泡灭菌后用无菌去离子水 冲洗6~8次。7. 根据权利要求1所述的一种三七胚性愈伤组织诱导培养方法，其特征在于，所述三七 茎、叶、花作为外植体的接种方法为：在无菌环境中将经过灭菌的茎、叶、花切割大小为 0.5cm2的块状外植体;在无菌的条件下进行接种，每瓶培养基接种3~5块外植体。8. 根据权利要求1所述的一种三七胚性愈伤组织诱导培养方法，其特征在于，所述三七 茎、叶、花作为外植体的诱导培养的周期为4~5周。9. 根据权利要求1所述的一种三七胚性愈伤组织诱导培养方法，其特征在于，所述三七 花药作为外植体的接种方法为:在无菌滤纸上剥取花药;在无菌的条件下进行接种，将花药 接种到组培瓶中，每瓶15~20粒。10. 根据权利要求1所述的一种三七胚性愈伤组织诱导培养方法，其特征在于，所述三 七花药作为外植体的诱导培养的周期为6~7周。
【文档编号】A01H4/00GK106069791SQ201610725884
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月25日
【发明人】陈中坚, 王勇, 魏富刚, 余育启
【申请人】文山苗乡三七科技有限公司