华鲮鱼雄性四倍体纯系高效育成方法
【专利摘要】本发明公开了一种华鲮鱼雄性四倍体纯系高效育成方法，包括如下步骤：他莫昔芬抑制剂配备、他莫昔芬注射液的配制、注射处理母本、冷休克+静水压处理、雌激素抑制剂溶液的配制、获得华鲮鱼雄性四倍体纯系。通过此方法，可获得100%的华鲮鱼雄性四倍体纯系，有效提高了四倍体的育成率及出苗率，相比杂交而言，能获得纯度更高、后代更为稳定的雄性四倍体鱼系，为不育三倍体华鲮鱼的育成奠定了坚实的基础。
【专利说明】
华鲮鱼雄性四倍体纯系高效育成方法
技术领域
[0001] 本发明涉及华鲮鱼的多倍体繁育方法，具体涉及华鲮鱼雄性四倍体纯系高效育成 方法。
【背景技术】
[0002] 华鲮属鲤形目，鲤科，野鲮亚科，华鲮属。俗称:青龙棒，桃花棒，野鲮鱼，青衣子。体 长，略呈棒状，尾柄高而宽厚。吻钝圆而突出，口下位，横裂。上唇前部光滑，为游离的吻皮所 遮盖，两侧则有细小的乳突；下唇游离部分的内缘有许多小乳状突，下唇与下颂分离，其间 有一深沟相隔，上颂为上唇所包。体背及体侧青黑色，鳞片紫绿色夹有红色，并具金属光泽； 腹部微黄，各鳍灰黑色。三倍体华鲮鱼的不育特征，使其在生长速度、抗逆性、抗病性以及肉 质等方面表现出更为显著的优势。现有技术中，要获得三倍体不育华鲮鱼，最快捷有效的方 法是通过四倍体华鲮鱼与二倍体华鲮鱼倍间杂交获得，那么就需要建立遗传稳定、纯度极 高的四倍体纯系。但在华鲮鱼的遗传育种中，到目前为止还未见四倍体全雄华鲮鱼高效育 成的报道。
【发明内容】
[0003] 针对上述现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种方法稳定、种群纯度高 达1 〇〇%的华鲮鱼雄性四倍体纯系高效育成方法。
[0004] 为达到上述目的，本发明的技术方案如下： 华鲮鱼雄性四倍体纯系高效育成方法，包括如下步骤： (1) 他莫昔芬抑制剂配备:取纯度为95%以上的他莫昔芬粉剂，加入90%的乙醇溶液进行 溶解，制成母液，其中他莫昔芬含量约为50~100mg/ml，待用； (2) 他莫昔芬注射液的配制:取上述母液直接加入到已配制好的催产剂溶液中，其比例 为lml他莫昔芬母液加入到400~500ml的已配制好的催产剂溶液中，制成注射液待用;催产 剂溶液是将绒毛膜促性腺激素用〇. 9%生理盐水稀释配制，催产剂溶液中绒毛膜促性腺激素 的剂量为5-12 IU/g; (3) 注射处理母本:在母本人工产卵前，按常规人工催产方法对母本进行人工注射他莫 昔芬注射液，其中他莫昔芬注射液的用量约为65~125yg/kg; (4) 冷休克+静水压处理:在一次卵裂时，采用冷休克与静水压相结合的方法，把经过注 射处理的母本与不经过任何处理的父本杂交获得的受精卵放入温度为-1~〇°C的冷水中， 静水压压力为220~280Kg/cm 2,持续时间为3~5min; (5) 雌激素抑制剂溶液的配制:将氯米芬和睾酮一起溶于80%~90%的乙醇中，再加蒸馏 水配制成雌激素抑制剂溶液，其中雌激素抑制剂溶液中氯米芬的浓度为80~160mg/l，睾酮 的浓度为20~50mg/l; (6) 取步骤(4)处理后的受精卵放入按步骤(5)所制备的雌激素抑制剂溶液中，常温浸 泡10~30s，然后取出放于孵化器中正常孵化;从而获得100%华鲮鱼雄性四倍体纯系。
[0005] 本发明的优点：1、本发明中在母本中注射他莫昔芬，起到抑制DNA复制和促雄性的 双重作用的同时，推延了受精卵第一次卵裂的时间（3-5min)、提高了所有受精卵第一次卵 裂的同步程度(可达99%)，为操作下一步提供时间保障和奠定了染色体加倍的基础;2、在受 精卵一次卵裂采用冷休克与较低的静水压(低于常用的350kg/cm 2)，以及较短的处理时间 (低于5min)，不仅有效减少对受精卵的不良影响，提高受精卵的成活率，而且进一步强化四 倍体的转化率;3、雌激素抑制剂溶液浸泡，再一次强化与保证雄性转化率。因而通过此方 法，可获得100%的华鲮鱼雄性四倍体纯系，有效提高了四倍体的育成率及出苗率，相比杂交 而言，能获得纯度更高、后代更为稳定的雄性四倍体鱼系，为不育三倍体华鲮鱼的育成奠定 了坚实的基础。
【具体实施方式】
[0006] 现结合具体实施例，对本发明作进一步描述。以下实施例仅为本发明优选的实施 方式，而并非限制本发明的保护范围，任何与本发明相同或相似的方案均视为本发明的保 护内容。
[0007] 实施例一 华鲮鱼雄性四倍体纯系高效育成方法，包括如下步骤： (1) 他莫昔芬抑制剂配备:取纯度为95%以上的他莫昔芬粉剂，加入90%的乙醇溶液进行 溶解，制成母液，其中他莫昔芬含量约为50mg/ml，待用； (2) 他莫昔芬注射液的配制:取上述母液直接加入到已配制好的催产剂溶液中，其比例 为lml他莫昔芬母液加入到400ml的已配制好的催产剂溶液中，制成注射液，注射液中他莫 昔芬的浓度约为〇. 125mg/ml，待用； (3) 注射处理母本:在母本人工产卵前，按常规人工催产方法对母本进行人工注射他莫 昔芬注射液，其中他莫昔芬注射液的用量约为105yg/kg; (4) 冷休克+静水压处理:在一次卵裂时，采用冷休克与静水压相结合的方法，把经过注 射处理的母本与不经过任何处理的父本杂交获得的受精卵放入温度为〇°C的冷水中，静水 压压力为280Kg/cm 2,持续时间为5min; (5) 雌激素抑制剂溶液的配制:将氯米芬和睾酮一起溶于90%的乙醇中，再加蒸馏水配 制成雌激素抑制剂溶液，其中雌激素抑制剂溶液中氯米芬的浓度为120mg/l，睾酮的浓度为 40mg/l； (6) 取步骤(4)处理后的受精卵放入按步骤(5)所制备的雌激素抑制剂溶液中，常温浸 泡30s，然后取出放于孵化器中正常孵化;从而获得100%华鲮鱼雄性四倍体纯系。
[0008] 实施例二 华鲮鱼雄性四倍体纯系高效育成方法，包括如下步骤： (1) 他莫昔芬抑制剂配备:取纯度为95%以上的他莫昔芬粉剂，加入90%的乙醇溶液进行 溶解，制成母液，其中他莫昔芬含量约为l〇〇mg/ml，待用； (2) 他莫昔芬注射液的配制:取上述母液直接加入到已配制好的催产剂溶液中，其比例 为lml他莫昔芬母液加入到500ml的已配制好的催产剂溶液中，制成注射液，注射液中他莫 昔芬的浓度为〇. 2mg/ml，待用； (3) 注射处理母本:在母本人工产卵前，按常规人工催产方法对母本进行人工注射他莫 昔芬注射液，其中他莫昔芬注射液的用量约为125yg/kg; (4) 冷休克+静水压处理:在一次卵裂时，采用冷休克与静水压相结合的方法，把经过注 射处理的母本与不经过任何处理的父本杂交获得的受精卵放入温度为-1°C的冷水中，静水 压压力为220Kg/cm 2,持续时间为3min; (5) 雌激素抑制剂溶液的配制:将氯米芬和睾酮一起溶于90%的乙醇中，再加蒸馏水配 制成雌激素抑制剂溶液，其中雌激素抑制剂溶液中氯米芬的浓度为160mg/l，睾酮的浓度为 50mg/l； (6) 取步骤(4)处理后的受精卵放入按步骤(5)所制备的雌激素抑制剂溶液中，常温浸 泡l〇s，然后取出放于孵化器中正常孵化;从而获得100%华鲮鱼雄性四倍体纯系。
[0009] 上述两个实施例仅为本发明的优选方案之二，并不能限制本发明的保护范围，任 意与本发明等同或相似的技术手段视为本发明的保护范围。以下附上本发明部分处理方式 及结果统计。
[0010] 附:华鲮鱼雄性四倍体育成结果统计
注:上述结果是在注射液中他莫昔芬的浓度为〇.2mg/ml的条件下常温浸泡10S，静水压 处理3分钟所取得的结果。
【主权项】
1.华鲮鱼雄性四倍体纯系高效育成方法，包括如下步骤： (1) 他莫昔芬抑制剂配备:取纯度为95%以上的他莫昔芬粉剂，加入90%的乙醇溶液进行 溶解，制成母液，其中他莫昔芬含量约为50~100mg/ml，待用； (2) 他莫昔芬注射液的配制:取上述母液直接加入到已配制好的催产剂溶液中，其比例 为lml他莫昔芬母液加入到400~500ml的已配制好的催产剂溶液中，制成注射液待用;催产 剂溶液是将绒毛膜促性腺激素用〇. 9%生理盐水稀释配制，催产剂溶液中绒毛膜促性腺激素 的剂量为5-12 IU/g; (3) 注射处理母本:在母本人工产卵前，按常规人工催产方法对母本进行人工注射他莫 昔芬注射液，其中他莫昔芬注射液的用量约为65~125yg/kg; (4) 冷休克+静水压处理:在一次卵裂时，采用冷休克与静水压相结合的方法，把经过注 射处理的母本与不经过任何处理的父本杂交获得的受精卵放入温度为-1~〇°C的冷水中， 静水压压力为220~280Kg/cm 2,持续时间为3~5min; (5) 雌激素抑制剂溶液的配制:将氯米芬和睾酮一起溶于80%~90%的乙醇中，再加蒸馏 水配制成雌激素抑制剂溶液，其中雌激素抑制剂溶液中氯米芬的浓度为80~160mg/l，睾酮 的浓度为20~50mg/l; (6) 取步骤(4)处理后的受精卵放入按步骤(5)所制备的雌激素抑制剂溶液中，常温浸 泡10~30s，然后取出放于孵化器中正常孵化;从而获得100%华鲮鱼雄性四倍体纯系。
【文档编号】A01K61/00GK106069939SQ201610496055
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月30日
【发明人】杨品红, 刘飞, 夏虎
【申请人】湖南文理学院