一种雌雄单一配对构建缢蛏家系的方法
【专利摘要】本发明涉及一种雌雄单一配对缢蛏家系的构建方法。其特征是首先选择性腺成熟的健康亲贝，然后通过针刺取性腺的方法进行雌雄性别的鉴定，再将上述个体按照一雌对一雄的方式单一配好对之后，放置在60L海水中催产，并结合的阴干?流水刺激和注射5?羟色胺的方法，促进缢蛏排卵产精并完成受精，并将受精发育良好的家系分别单独培育至成贝，即得无污染的缢蛏家系。本发明大大提高了家系的构建效率和纯度。实现了大规模的构建高纯度缢蛏家系，和传统的构建缢蛏家系的方法相比，由原来的30％提高到了70％左右，而且操作简单方便，节省人力和时间，并为缢蛏开展分子标记辅助育种提供了足够的无污染的纯家系。
【专利说明】
一种雌雄单一配对构建缢蛏家系的方法
技术领域
[0001]本发明属于贝类水产养殖的育种技术，尤其是涉及一种雌雄单一配对缢蛏家系的构建方法。
【背景技术】
[0002]溢経(SinonovaculaConstrictaLamarck)俗称経子，属软体动物门(Mollusca)，瓣鲍纲(Lamel Iibranchia)竹経科(solenidae)溢経属(sinonovacula)贝类。溢経为广温广盐性海产双壳贝类，具有重要的经济价值，是我国四大养殖贝类之一。缢蛏养殖历史悠久，过去主要集中在福建和浙江一带，随着缢蛏养殖业的不断扩展，山东、天津沿海地区开始从福建、浙江等地区引进苗种。由于无序的养殖以及盲目引种和移养等使缢蛏种质资源混淆不清，很容易引发缢蛏的种质退化，因此，应该加快开展缢蛏新品种的选育，但目前有关缢蛏的选育工作主要以传统的选育方法为主，现代化的分子标记辅助育种至今鲜有报道，其主要原因之一就是缺乏无污染的纯缢蛏家系，因此无法开展缢蛏遗传连锁图谱的构建，更无法在此基础上进行QTL定位研究。
[0003]已有专利“一种缢蛏家系的建立和良种选育方法”(申请号CN201310503970.9)中缢蛏家系的构建采用阴干加流水刺激的方法进行大群体集中催产，当群体开始排精产卵时，通过肉眼鉴别的方法将正在排精的雄性缢蛏和正在产卵的雌性缢蛏挑出来，用淡水冲洗一下后，再将其分别单个放入盛有海水的烧杯里继续让其排精产卵，分别收集精卵后混合授精构建家系；但在缢蛏群体催产时闭壳不完全，其体壁和外套膜上会沾有大量其它个体排出的精卵，用淡水无法将这些精卵冲洗干净，造成构建的家系不纯；同时由于冲洗时的流水刺激打断了缢蛏连续的排精和产卵活动，对其造成了应激反应，从而导致后续产卵的比例大大下降，因此使该方法获得家系的效率低下，成功率仅为30?40%，自然也无法有效获得没有任何污染的纯缢蛏家系。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种雌雄单一配对构建高纯度无污染缢蛏家系的方法，以弥补现有技术的不足。
[0005]本发明的另一目的是为分子标记辅助育种提供充足的无污染的缢蛏纯家系。
[0006]本发明为了保证构建家系的纯度和效率，首先必须进行缢蛏雌雄性别的鉴别，将鉴定好的雌雄个体分别置放，并按照一雌对一雄的方式单一配对后放入盛有海水的催产用整理箱中，并考虑到提高催产率，采用阴干-流水刺激和注射5-羟色胺的方法;又为了进一步提高催产效率，将催产用海水比重调至l.0llg/cm3，温度设为25°C，以进一步提高家系的构建效率和纯度。
[0007]本发明的方法是，其特征是首先选择性腺成熟的健康亲贝，然后通过针刺取性腺的方法进行雌雄性别的鉴定，再将上述个体按照一雌对一雄的方式单一配好对之后，放置在60L海水中催产，并结合的阴干-流水刺激和注射5-羟色胺的方法，促进缢蛏排卵产精并完成受精，并将受精发育良好的家系分别单独培育至成贝，日常管理中谨防家系间的污染，即获得到无污染的缢蛏家系。
[0008]本发明的具体步骤:
[0009]亲贝的选择:挑选性腺发育成熟，健康、无伤残、活力好，体重大于平均体重15?20 %的亲贝，用淡水冲洗干净；
[0010]鉴别亲贝的雌雄，并将雌、雄亲贝分开放置；
[0011]亲贝的阴干和流水催产:于傍晚将雌、雄亲贝放置在通风避光处阴干30?60分钟，用注射器分别向雌、雄缢蛏亲贝的腹足注射0.015?0.02mM的5-羟色胺0.05?0.15ml；然后按照一雄配一雌的方式，将缢蛏单一配对并放入60L的整理箱的海水中，连续充氧刺激雌雄缢蛏亲贝产卵排精直至受精，并将受精发育良好的家系分别单独培育至成贝，日常管理中防止家系间的污染。
[0012]本发明的优点和积极效果:
[0013](I)和传统的构建缢蛏家系的方法相比，本发明是在先鉴别缢蛏性别的前提下，采用雌雄单一配对，再通过阴干-流水刺激以及注射5-羟色胺的方法，完成缢蛏家系的高效无污染的人工构建，由原来的30%提高到了70%左右，大大提高了家系的构建效率和纯度。
[0014](2)本发明操作简单方便，节省人力和时间，以实现大规模的构建高纯度缢蛏家系;并为缢蛏开展分子标记辅助育种提供了无污染的纯家系。
【具体实施方式】
[0015]实施例1
[0016](I)在2000个性腺发育成熟的缢蛏中，优选出活力强、健康无损伤，体重大于平均体重15?20 %的亲贝200个，作为备选亲贝，用淡水冲洗干净，于上午7:00用Iml塑料注射器抽取缢蛏的性腺组织0.3ml，注入盛有清水的表面皿中，雄性缢蛏的精子在水中成雾状，雌性缢蛏的卵子呈颗粒状并在水中迅速散开，分别获得雄性缢蛏96个和雌性缢蛏104个;将雌、雄亲贝分开放置成2个群体养殖于海水中(温度25°C，比重1.011g/cm3)，并且避免流水刺激，以防流产；
[0017](2)于傍晚17:30将雌、雄亲贝群体分开放置在通风避光处，阴干30?60分钟，然后按照一雄对一雌的方式将缢蛏单一配成96对分别放入到96个盛有60L海水的整理箱中，考虑到提高催产效率事先将催产用海水的比重调至1.011g/cm3，水温控制在25°C，连续充氧刺激过夜；
[0018](3)至次日上午6:00将亲贝取出，取少许海水通过显微镜检受精发育情况，统计家系构建的情况，共成功构建家系58个，构建成功率为61.70%，和常规的方法相比，大大提高了家系的纯度以及效率，满足了缢蛏高密度遗传连锁图谱的构建和QTL定位的需求，为缢蛏分子标记辅助选育的开展提供了的无污染家系。
[0019]实施例2
[0020](I)在2000个性腺发育成熟的缢蛏中，优选出活力强、健康无损伤，体重大于平均体重15?20 %的亲贝200个，作为备选亲贝，用淡水冲洗干净，与上午7:00用Iml塑料注射器抽取缢蛏的性腺组织约0.3ml，注入盛有清水的表面皿中，雄性缢蛏的精子在水中成雾状，雌性缢蛏的卵子呈颗粒状并在水中迅速散开，分别获得雄性缢蛏94个和雌性缢蛏106个;将雌、雄亲贝分开放置成2个群体养殖于海水中(温度25°C，比重1.011g/cm3)，避免混淆和流水刺激，以防止流产；
[0021](2)于傍晚17:30将雌、雄亲贝群体分开放置在通风避光处阴干30?60分钟，用注射器分别向雌、雄缢蛏亲贝的腹足注射0.015?0.02mM的5-羟色胺0.05?0.15ml；然后按照一雄对一雌的方式将缢蛏单一配成94对分别放入到96个盛有60L海水的整理箱中，考虑到提高催产效率事先将催产用海水的比重调至1.011g/cm3，水温控制在25°C，连续充氧刺激过夜；
[0022](3)至次日上午6:00将亲贝取出，取少许海水通过显微镜检受精发育情况，统计家系构建的情况，共成功构建家系68个，构建成功率为72.34%,和常规的方法相比，不仅提高了效率更加提高了家系的纯度，满足了缢蛏高密度遗传连锁图谱的构建和QTL定位的需求，为缢蛏分子标记辅助选育的开展提供了优质的无污染家系。
【主权项】
1.一种雌雄单一配对构建缢蛏家系的方法，其特征是首先选择性腺成熟的健康亲贝，然后通过针刺取性腺的方法进行雌雄性别的鉴定，再将上述个体按照一雌对一雄的方式单一配好对之后，放置在60L海水中催产，并结合常规的阴干-流水刺激和注射5-羟色胺的方法，促进缢蛏排卵产精并完成受精，并将受精发育良好的家系分别单独培育至成贝，即获得到无污染的缢蛏家系。2.—种雌雄单一配对构建缢蛏家系的方法，其特征是它包括以下步骤: 1)亲贝的选择:挑选性腺发育成熟，健康、无伤残、活力好，体重大于平均体重15?20%的亲贝，用淡水冲洗干净； 2)鉴别亲贝的雌雄，并将雌、雄亲贝分开放置； 3)亲贝的阴干和流水催产:于傍晚将雌、雄亲贝放置在通风避光处阴干30?60分钟，用注射器分别向雌、雄缢蛏亲贝的腹足注射0.015?0.02mM的5-羟色胺0.05?0.15ml;然后按照一雄配一雌的方式，将缢蛏单一配对并放入60L的整理箱的海水中，连续充氧刺激雌雄缢蛏亲贝产卵排精直至受精，并将受精发育良好的家系分别单独培育至成贝，日常管理中防止家系间的污染。3.如权利要求1或2所述的一种雌雄单一配对构建缢蛏家系的方法，其特征是上述针刺取性腺鉴别亲贝的方法；用Iml塑料注射器抽取缢蛏的性腺组织0.3ml，注入盛有清水的表面皿中，雄性缢蛏的精子在水中成雾状，雌性缢蛏的卵子呈颗粒状并在水中迅速散开;依次鉴别雌、雄亲贝，并将其分开，避免雌雄混淆。4.如权利要求1或2所述的一种雌雄单一配对构建缢蛏家系的方法，其特征是上述单一配对放入的海水的比重为1.011 g/cm3，水温是25 °C。
【文档编号】A01K61/00GK106069957SQ201610624661
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月29日 公开号201610624661.0, CN 106069957 A, CN 106069957A, CN 201610624661, CN-A-106069957, CN106069957 A, CN106069957A, CN201610624661, CN201610624661.0
【发明人】刘博 , 腾爽爽, 邵艳卿, 柴雪良, 肖国强
【申请人】青岛农业大学