专利名称：番茄花叶病毒弱毒疫苗k基因组全序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物病毒基因工程领域，特别是涉及烟草花叶病毒属的一株番茄花叶病毒弱毒疫苗基因组的全序列以及弱化的突变方式。
植物病毒弱毒疫苗在防治植物病毒病害中发挥着重要的作用，能够在植物体内生存和繁殖，却不危害植物的正常生长、开花和种子生产，而对攻击病毒侵染植物具有防御作用，这种共生和保护宿主的现象是大多数植物弱病毒所具有的共同特征，具有普遍性。Kunkel、Grant、Posnett和Todd曾先后提出利用植物天然弱病毒分离物预防强病毒侵染的设想，并在果树病毒研究中曾以自然界分离的弱病毒作了保护试验。但由于这些果树病毒不容易深入分析其保护作用和进一步研究，后来又转入草本植物病毒的人工诱变弱毒疫苗的研究。
大岛信行等利用高温诱变获得L11系列番茄花叶病毒疫苗，在生产实践中得到广泛应用，80年代后对其进行了分子生物学的研究，对三个克隆的病毒基因组测序发现病毒基因组核苷酸不一致，因而未能得到进一步的研究。Rast曾用亚硝酸诱变得到M-Ⅱ-16弱毒分离物，由于这个分离物还引起花叶症状和遗传性不够稳定，未在生产上应用。
八十年代，人们展开了对弱病毒致弱与交叉保护机理的分子生物学研究，Banerjee发现烟草花叶病毒(TMV)普通株(U1)突变体YSI/1致弱的原因是病毒外壳蛋白基因在5770和6127位点的突变使Val→Asp和Phe→Ser；Nishiguchi认为TMV弱毒疫苗L11和L11A(番茄株)的致弱是由于126kDa复制酶3个氨基酸的突变造成；Shiian对TMV弱毒疫苗V-69(番茄株)54％的基因组分析，发现6个碱基的突变引起了编码蛋白氨基酸的变化，但其中那几个碱基的突变起关键作用，却不清楚，由此可见，植物病毒致弱的分子机理尚无定论。
八十年代初，曾报道过用亚硝酸处理番茄花叶病毒强株而获得了弱毒疫苗，可以防治烟草和番茄免受大多数烟草花叶病毒属成员的侵染，在温室和大田使用具有明显的增产效果，而且遗传性稳定。对其理化性质、感病组织中双链RNA的变化情况和免疫蛋白以及RNA体外翻译产物等进行了研究，然而皆无其弱化机理的明确报导。为进一步揭示番茄花叶病毒弱毒疫苗(以下简称K)致弱的分子机理，通过反转录、PCR、克隆、体外转录和烟草感染获得了侵染性cDNA(infectiouscDNA)克隆pK；测定和分析了其基因组核苷酸全序列，与番茄花叶病毒强株(日本分离物)相比，发现K基因组中复制酶和运动蛋白分别发生了乳石和赭石突变；在普通株和K之间用基因交换法构建了K的重组病毒，体外转录和侵染性分析表明K突变的复制酶和运动蛋白对该病毒的致弱分别起主要和次要作用；用点突变的方法分别研究了普通株和K的3个突变体对烟草的侵染性，并分析了转复制酶和运动蛋白基因植物对部分烟草花叶病毒属成员的交叉保护作用，这些结果均表明K基因组的这种突变是其致弱和交叉保护的根本原因。
K基因组的这种突变方式是目前在植物病毒中发现的特有现象，本发明的意义在于利用这种突变所造成的病毒弱化作用模式将为其他植物病毒(主要是RNA病毒)基因组的改造和基因工程疫苗的研制提供了广阔的应用前景，对植物病毒病的全面防治将起着重要的作用。
具体的说本发明可应用于1．烟草花叶病毒属成员以及其他植物病毒基因组的改造以研制或生产弱毒疫苗或基因工程疫苗，防治植物病毒病。
2．可用于不影响植物的正常生长与繁殖而在相应易感植物中表达外源基因的载体。
3．可用于不对接种植物产生严重危害而在病毒粒子表面展示外源肽段的展示载体。
实施本发明可以达到如下有益效果1．K基因组的突变方式以复制酶基因组在2670-2672的UGA无义突变和运动蛋白基因组在5632-5634的UAA无义突变为特征，这种突变是目前在植物病毒弱毒株系中发现的特有现象。含有这类突变的病毒会致弱植物病毒的侵染，因而能够用于植物病毒的交叉保护。而K致弱的突变方式可用于与K有类似基因组形式的其它植物病毒，特别是正链RNA病毒，如虹豆花叶病毒科(Comoviridae)，马铃薯Y病毒科(Potyviridae)，番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)，线形病毒属(Capillovirus)，香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)，长线形病毒属(Closterovirus)，黄症病毒属(Luteovirus)，玉米褪绿斑驳病毒属(Machomovirus)，坏死病毒属(Necrovirus)，马铃薯X病毒属(Potexvirus)，南方菜豆花叶病毒属(Sobemovirus)，烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的其它成员，毛病毒属(Trichovirus)，芜菁花叶病毒属(Tymovirus)。
2．目前，TMV作为载体已应用于某些外源基因在植物(尤其是烟草)中的表达，其主要方法是将外源基因替代病毒基因组的CP编码区，转录后接种植物，同时接种缺损病毒(如仅含有病毒基因组的复制酶与外壳蛋白)，这样利用辅助病毒的CP来包装嵌合有外源基因的重组病毒基因组，而使外源基因得到表达；另一种方法是在转CP基因的植物上，接种上述嵌合体的转录产物，利用在植物中表达的CP来包装嵌合病毒，从而表达外源基因。这两种方法都会形成重组强病毒而扩散，对被接种植物具有严重的损伤，在田间使用必然会危害其他植物。而K作为弱毒疫苗，其本身就具有抗病毒的作用，以K的基因组作为载体进行外源基因的表达就不会出现上述问题。该病毒的潜在作用还在于针对相应植物可以携带使该植物得到免疫或生长的外源基因。
3．用于外源肽段在病毒颗粒表面的展示时，也存在上述的优点。
实现本发明的技术方案步骤如下将番茄花叶病毒强株(L-TMV)用亚硝酸诱变处理后，用枯斑寄主(心叶烟或枯斑三生烟)获得的单斑，接种普通烟(黄苗榆品种)或番茄(加八品种)。每次挖取几十个单斑，淘汰所有在普通烟和番茄上表现症状的单斑分离物，将不表现症状的单斑分离物回接心叶烟或枯斑三生烟，检查病毒的存在；选取不表现症状而有病毒增殖的单斑分离物，连续进行单斑分离和毒力鉴定3-4次，以获得稳定遗传的弱毒株系。
如上所述，K是用亚硝酸诱变番茄花叶病毒强株后筛选获得的，这种诱变是随机的，但本发明所获得的突变体却具有稳定的遗传性，虽然再用亚硝酸处理番茄花叶病毒强株不一定能得到与K基因组完全相同的突变体，但可用点突变的方式对自然条件下分离和克隆的番茄花叶病毒强株基因组进行改造而获得，并通过体外转录和烟草侵染试验获得稳定遗传的基因工程弱毒疫苗。
实施例1．点突变使番茄花叶病毒基因组cDNA复制酶编码基因在2670-2672核苷酸形成乳石突变(TGA)，运动蛋白编码基因在5632-5634核苷酸形成赭石突变(TAA)。点突变可用PCR(聚合酶链反应)，将突变位点引入到引物中。其方法如下(1)突变引物设计上下游(5′和3′)引物必须包括突变位点，而且在退火后二者完全配对形成双链；复制酶5′突变引物序列为5′-GATGATCAGATGAAGAGCTAATG-3′,3′突变引物5′-CATTAGCTCTTCATCTGATCATC-3′。运动蛋白5′突变引物5′-AGTTTAAAAAGA GTTTAATAATTTGATTAAAGATTAAGC-3′,3′引物5′-GCTTAATCTTTAATCAAATT ATTAAACTCTTTTTAAACT-3′；引物5′端不能磷酸化，但引物必须用多聚核苷酸液相色谱(polynucleotide liquid chromatography,FPLC)或聚丙稀酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)纯化；反应时引物浓度需过量。
(2)PCR在薄壁管中按如下成分和比例加入反应试剂，再按设定的程序在PCR循环仪上进行反应。
5μl 10×突变反应缓冲液10ng克隆质粒(含有全部或部分病毒基因组的)模板125ng上游引物(以34个碱基引物为例，100ng/μl)125ng下游引物(以34个碱基引物为例，100ng/μl)1μldNTP混合物(dATP,dGTP,dCTP,dTTP各25mM)再加双蒸水或去离子水到终体积为50μl1μl Pfu Turbo DNA聚合酶(2.5单位/μl)，混匀覆盖30μl矿物油94℃30s；94℃30s,55℃1min,68℃的时间按每kb质粒长度2min计算，进行12-15个循环；循环结束后在冰上置2min冷却反应。
(3)消化反应取10μl PCR产物加入1μlDpnⅠ限制性内切酶(10U/μl),37℃消化2小时，同时取与10μlPCR产物中等量的模板也进行相同条件的消化。
(4)转化大肠杆菌XL1-BLUEⅠ)XL1-BLUE感受态细胞的制备 采用氯化钙制备法，方法参照《分子克隆实验指南》。
Ⅱ)转化 取消化产物2-5μl加入到制备好的感受态XL1-BLUE中，振荡混匀，置冰中30min，然后42℃热激90s，再在冰中置3-5min，加入0.5mlNZY+broth,37℃225-250rpm摇床振荡1h，取适量菌液均匀涂在有相应抗生素的LB琼脂平板中，37℃培养16hs以上。模板对照的转化数应不大于0-5‰，否则应重新消化和转化。
(5)筛选突变体用荧光素或放射性同位素(32P或35S)标记，双脱氧末端终止法测定突变位点及其附近的核苷酸序列(测序试剂盒T7Kit购自Pharmacia公司)。每个突变点均可按上述方法进行。
2．体外转录与烟草侵染(1)模板的制备碱法提取重组质粒约2μg，用限制性内切酶SphⅠ线性化，Klenow片段(5U/μg DNA)削平3′突出端，酚/氯仿抽提两次，乙醇沉淀。线性化模板溶于DEPC处理的无菌水中。
(2)感染烟草按文献[11]报道的方法，转录产物不经DNase处理，直接用于侵染烟草。先接种枯斑三生烟(Samsun NN)，出现枯斑后，转接普通烟(Nicotiana tabacum cv.黄苗榆品种)和三生烟。观察系统症状和枯斑形成情况。选在三生烟上能出现枯斑，而在普通烟上不表现典型系统症状的突变克隆(pK)。
3．子代病毒的鉴定(1)病毒的分离与纯化以及RNA的提取按文献[8]的方法进行。
(2)反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)A．病毒全基因组cDNA的合成 5′引物5′-GATTTAGGTGACACTATAGTATT TTTACAACAATTAC-3′；3′引物5′-GGTACCTGGGCCCCAACCGGGGGT-3′。RT-PCR(购自德国Boehringer Mannheim公司)操作均按照试剂盒的说明进行RT反应在42℃作用1h。PCR扩增的循环条件为94℃ 2min；94℃ 30s,60℃ 30s,68℃ 6min,35个循环；68℃ 10min。
B．病毒基因组cDNA突变位点的检测 取上述PCR产物约10μg用测序引物5′-CGGGAAGACAAAGGAAATTC-3′和5′-TCAGGCGGAAGGCCTAAACC-3′分别测定2670-2672与5632-5634核苷酸。测序试剂盒及方法同上。
4．K基因组全序列(图1-1～3)弱毒疫苗K基因组结构与强毒株有不同，其98.5kDa/126kDa/183kDa、27kDa(运动蛋白)、17.6kDa(外壳蛋白)蛋白分别起始于核苷酸序列72、4906、5703位；终止于2672/3422/4922、5634、6182；终止密码子分别为TGA/TAG/TAA、TAA、TAA；126kDa蛋白为TGA(UGA)被通读为色氨酸(Trp)或半胱氨酸(Cys)的产物；183kDa蛋白应为98.5kDa和126kDa被通读两次后的产物(表1)。
表1．K基因组结构基因组长度 6384ntG/C 1477/1185G+C(％) 2662(41.70)A/T 1906/1816A+T(％) 3722(58.30)5′非编码区(核苷酸) 1-71(71nt)98.5kDa蛋白(氨基酸残基) 72-2672(867a.a.)126kDa蛋白(氨基酸残基) 72-3422(1115a.a.)183kDa蛋白(氨基酸残基) 72-4922(？)(1615a.a.？)运动蛋白(氨基酸残基) 4906-5634(241a.a.)外壳蛋白(氨基酸残基) 5703-6182(158a.a.)3′非编码区(核苷酸) 6183-6384(202nt)5．KcDNA核苷酸序列与参比序列的比较K与番茄株(强株)日本分离物(TMV-L,Japanese isolate)基因组的核苷酸总数相同，碱基组成的同源率也在99％以上；二者3个ORF(Open Reading-Frame)的起始密码和终止密码相同；但K由于2670-2672nt发生了乳石突变(UGA)，比TMV-L多一个ORF，其翻译形成98.5kDa蛋白；该乳石突变可被通读，形成126kDa蛋白，而183kDa蛋白的形成须通读UGA和UAG，因而产量可能较少；此外K运动蛋白基因在5634bp发生的赭石突变(UAA)致使其正常翻译提前终止，比强株的运动蛋白小约2kDa(表2)。
表2．K与番茄强株(TMV-L)基因组结构比较TMV-L K 序列平均同源率(％)基因组长度)6384nt 6384nt 99.7G/C 1482/11821477/1185G+C(％) 2664(41.73) 2662(41.70)A/T 1903/18171906/1816A+T(％) 3720(58.27) 3722(58.30)5′非编码区(核苷酸)1-71(71nt) 1-71(71nt) 10098.5kDa蛋白(氨基酸残基)… 72-2672(867a.a.)126kDa蛋白(氨基酸残基) 72-3422 72-3422 99.6(1115a.a.) (1115a.a.) (99.1)183kDa蛋白(氨基酸残基) 72-4922 72-4922(？) 99.6(1615a.a)(1615a.a.？)(99.2)运动蛋白(氨基酸残基) 4906-57004906-5634 100(263a.a.)(241a.a.) (100)外壳蛋白(氨基酸残基) 5703-61825703-6182 100(158a.a.)(158a.a.) (100)3′非编码区(核苷酸)6183-63846183-6384(204nt) (202nt) 1006．Kc DNA推断的ORF多肽氨基酸残基序列(图2-6)与参比序列的比较分析K与TMV-L在126kDa/183kDa蛋白共有13个氨基酸变异。34丙氨酸(Ala)-苏氨酸(Thr)；335苏氨酸(Thr)-丙氨酸(Ala)；349酪氨酸(Tyr)-半胱氨酸(Cys)；385天冬酰氨(Asn)-丝氨酸(Ser)；510精氨酸(Arg)-赖氨酸(Lys)；636脯氨酸(Pro)-丝氨酸(Ser)；760天冬氨酸(Asp)-天冬酰氨(Asn)；774精氨酸(Arg)-组氨酸(His)；867无义密码-精氨酸(Arg)；895精氨酸(Arg)-甘氨酸(Gly)；1285甲硫氨酸(Met)-亮氨酸(Leu)；1371酪氨酸(Tyr)-苯丙氨酸(Phe)；1376天冬酰氨(Asn)-丝氨酸(Ser)。
K与TMV-L在运动蛋白除氨基酸残基数不同外，无替代变异发生。预测的等电点分别为9.248和7.998。K运动蛋白等电点变大表明其在PH7.0时，带正电较多。
7．K复制酶基因终止密码子UAG和UGA的渗漏与通读烟草花叶病毒复制酶(126kDa)编码基因的翻译终止子UAG，已被证实可通读为酪氨酸(Tyr)。因为有实验表明在正常烟草组织细胞浆及叶绿体中发现一定数量的无义抑制tRNATyr，通过反密码子GψA识别终止密码UAG及其3′端的基本序列CAAUUA而获得通读，TMV-Cv和K分别在3420-3426和3423-3429处存在该序列，因而可以通读出183kDa蛋白，这种通读的效率可达到30-40％。
弱毒疫苗K复制酶基因由于在2670-2672发生乳石突变(UGA)，产生98.5kDa蛋白，该UGA是否可被通读而产生126kDa/183kDa蛋白？Karin和Carsten先后证明在烟草中带有反密码子CmCA或GCA的无义抑制tRNATrp或tRNACys可以通读UGA为色氨酸(Trp)或半胱氨酸(Cys)，这种通读的机制虽然没有发现规律性的mRNA序列，但在终止密码上下游的氨基酸残基序列似乎有某种特征(表3)。
表3．具有UGA终止子的部分不同植物病毒基因组通读区序列分析病毒种类病毒属 通读区序列烟草脆裂病毒烟草脆裂病毒属E T V L * R F R S(RNA-1)GAG ACC GUC UUA UGA CGG UUU CGG UCU豌豆早枯病毒烟草脆裂病毒属D A M K * R C R S(RNA-1)GAU GCU AUG AAA UGA CGG UGU CGG UCA土传小麦花叶病 真菌传杆状病毒属 E L T K * R F G S毒(RNA-1)GAG CUU ACU AAA UGA CGG UUU GGG UCG花生丛生病毒真菌传杆状病毒属 E Q T K * R F G S(RNA-1)GAA CAG ACC AAA UGA CGG UUU GGG UCA土传小麦花叶病 真菌传杆状病毒属 E G S S * R D G V毒(RNA-2)GAA GGU UCG AGU UGA CGG GAC GGC GUCK(RNA)烟草花叶病毒属E M I R * R A N AGAG AUG AUC AGA UGA AGA GCU AAU GCG从6个含有UGA终止密码的植物病毒mRNA序列分析可见，其通读的氨基酸序列结构为E×××*R×××，其中无义密码5′端以碱性氨基酸(K,R)居多(表4)。tRNATrp在烟草组织细胞浆和叶绿体中的通读效率分别为20-25％和12％，而tRNACys在同样组织中的通读效率为1.2-3％和5％，因此tRNATrp的通读效率比tRNACys要明显高。K要产生183kDa蛋白，必须对98.5kDa和126kDa蛋白连续通读，按tRNATyr和tRNATrp的最大通读效率计算，为10％，产量较少。
为更好地理解本发明，特给出附Ⅰ、附Ⅱ附图进一步予以说明。*附Ⅰ部分试剂的配制*附Ⅱ图1～
图1-1～3K全基因组cDNA序列，下划线部分TGA和TAA分别为乳石突变和赭石突变。图2-1～2.183kDa蛋白一级结构。图3.98.5kDa蛋白一级结构。图4-1～2.126kDa蛋白一级结构。图5.突变的运动蛋白一级结构。图6.外壳蛋白一级结构。
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权利要求
1．番茄花叶病毒弱毒疫苗基因组，其特征在于番茄花叶病毒弱毒疫苗K基因组中，编码复制酶和运动蛋白的核苷酸序列具有乳石突变和赭石突变，该突变具有致弱植物病毒的功能。
2．根据权利要求1所述的编码复制酶的核苷酸序列产生乳石突变，其特征在于乳石突变TGA发生于2670-2672核苷酸序列，其翻译形成98.5kDa蛋白，而且该乳石突变可被通读，形成126kDa蛋白和183kDa蛋白。
3．根据权利要求1所述的编码运动蛋白的核苷酸序列赭石突变，其特征在于赭石突变TAA发生于5632-5634位置，致使正常翻译提前终止。
4．根据权利要求1所述的乳石突变和赭石突变会致弱植物病毒，可以作为模式进行植物病毒基因组的改造，制备基因工程疫苗应用于植物病毒病的防治。
全文摘要
本发明涉及植物病毒基因工程领域。通过点突变的方式把分离和克隆的番茄花叶病毒强株基因组改造为弱毒疫苗K基因组,其编码复制酶和运动蛋白的核苷酸序列具有乳石突变和赭石突变,可以做为模式进行植物病毒基因组的改造,制备基因工程疫苗,有效地用于植物病毒病的防治。
文档编号C12N15/33GK1306090SQ0010021
公开日2001年8月1日 申请日期2000年1月14日 优先权日2000年1月14日
发明者邱并生, 杨恭, 田波 申请人:中国科学院微生物研究所