专利名称：生产木质素酶的方法
技术领域：
本发明属于应用微生物领域，特别涉及生产木质素酶的方法。
木质素是地球上主要的可再生芳香族化合物。估计植物光合作用所固定碳中的25％为木质素，所以木质素在植物从太阳中所捕获的能量中占很大比例。它是地球上仅次于纤维素的第二丰富资源，然而，对它的利用研究却很少，是天然高分子中尚待开发的领城[BusweLL,J.A.et aL.,CRC生物技术评论，1987,6(1):1-10]。八十年代初发现了木质素过氧化物酶(LiP)和锰过氧化物酶(MnP)以后，近十几年来，在木质素酶和木质素生物降解上取得了一定进展。但木质素微生物转化降解研究中仍存在许多问题。(1)由于木质素酶解是一种非专一性的、是以自由基为基础的链反应过程，因此，木质素酶在化学工业，煤化学和环境保护方面具有很大的开发前景；而现有木质素酶的制备方法大多采用合成培养基，以液态发酵法制得[Kirk,TK.,et aL.,酶和微生物技术，1986,8:27-32]，因这种合成培养基中必需添加昂贵的黎芦醇，且发酵周期长，故生产成本很高，离实际应用尚有很大距离，急需研究高效低成本体系。(2)大多研究是以木质素模拟物作白腐菌降解特性研究，很难反映出降解过程，木质素生物降解机制仍不清楚。
本发明的目的是克服现有技术在生产木质素酶时存在的原料昂贵、生产成本高的缺点，提供一种新的生产木质素酶的方法，以期达到有效利用纤维质资源，并实现其生物量全利用的目的。
本发明的技术方案如下以汽爆处理的纤维质原料(以草类为好)为主要培养料，按一定配方制成发酵用培养基，以白腐菌为菌种，用固态发酵的方式生产木质素酶，所产生的木质素酶酶活较高，木质素过氧化物酶(Lip)为2600U/L，锰依赖木质素过氧化物酶(Mnp)为1100U/L,Lip和Mnp生产率分别达到了21.667U/L.h和11.458U/L.h(以汽爆麦草为原料)，推翻了通常文献[AddLeman,K.,and ArchibaLd,F.，应用环境微生物，1993,59:266-273]报道的固态发酵几乎不产生木质素酶的结论。
本发明生产木质素酶的方法，其特征在于该方法为(重量百分比)向75-90％汽爆处理的纤维质原料和10-25％麸皮中，加入水溶液制成发酵培养基，固液比为(W/V)1∶1.5-2.5，其中所述的水溶液含有0-0.2％吐温80,0-0.1％谷氨酸钠，0-0.1％硫酸镁；用无机酸调pH值4.5-6.5；灭菌，接入相对于固体料重10％(V/W)的白腐菌液体种子，以固态发酵方式发酵汽爆处理后的纤维质原料；将固态发酵产物加蒸馏水浸提5小时后，离心去除固形物，上清液为所得酶液即本发明木质素酶。
所说的爆碎处理是指在汽爆罐中装入粗切的纤维质原料，于1.3-1.7MPa的蒸汽压力下对纤维质原料处理5-15分钟，瞬间减压释放；所说的纤维质原料是指麦草、稻草或玉米秆；所说的白腐菌是指黄孢原毛平革菌；所说的固态发酵方式是指浅盘式固态发酵。
本发明所选用的汽爆秸秆不仅为白腐菌提供了易利用的营养物质如半纤维素水解物，且由于木质素已部分被降解，其降解产物具有诱导木质素酶产生的物质，完全可以取代通常液态发酵必需添加的昂贵的黎芦醇。这样由于发酵原料简单廉价，不必添加昂贵的藜芦醇，且所得木质素酶产品酶活高，产率高，从而，大大降低了生产成本。使得木质素酶的工业化生产成为现实。
下面通过实施例及附图对本发明的技术方案作进一步说明。
图1．本发明的工艺流程示意图；图2．本发明固态产酶的动态过程示意图。
图中标号■.LiP●.MnP(1)本工艺流程中，蒸汽爆碎处理是指先将原料粗切至20-30mm长，再装入汽爆罐，于1.3-1.7MPa压力下维压5-15分钟，瞬间减压释放即得汽爆料。
(2)本工艺流程中，发酵用培养基配方是指75-90％汽爆纤维质料，10-25％麸皮，加入水溶液，固液比为1∶1.5-2.5。其中水溶液含有0-0.2％吐温80,0-0.1％谷氨酸钠，0-0.1％硫酸镁，用无机酸调pH值4.5-6.5。
(3)本工艺流程中，灭菌方法为常规蒸汽灭菌方式。
(4)本工艺流程中，菌种为黄孢原毛平革菌(Phanerochate chrysosporiumEM-446)。
(5)本工艺流程中，制备酶液的方法为将固态发酵产物加蒸馏水浸提5小时后，离心去除固形物，上清液为所得酶液。
(6)本工艺流程中，酶活测定按文献[Tiem,M.,et aL.，国家科学学会会刊，1984,81:2280-2284.MichaeL,H.G.,etaL.，酶学方法，1988,161:258-264]。另外，为了消除色素在紫外区干扰酶活测定，我们又采用了天青兰和酚红在可见光测定，结果相同。实施例1汽爆麦草固态发酵生产木质素酶1．汽爆麦草将已粗切至约25mm长的麦草80kg装入1M3汽爆罐中，通入蒸汽，待排出罐内冷空气后，关闭装料阀，升压到1.5MPa，维压10min，打开放料阀，瞬间减压释放即得汽爆麦草。
2．发酵用培养基的制备及灭菌(重量百分比)向80％汽爆纤维质料和20％麸皮中加入水溶液，固液比1∶2，其中水溶液含有0.1％吐温80，0.05％谷氨酸和0.05％硫酸镁，用0.1mol的盐酸调pH值4.5-6.5。于大型灭菌锅中灭菌，在0.1MPa压力下维持50分钟。
3．接种及装盘发酵将已灭菌的培养基打散，于无菌室接入黄孢原毛平革菌液体种子(相对于固体料重为10％的接种量)，混匀，装入已灭菌的搪瓷盘，上面覆盖已灭菌的纱布。移入发酵室，39℃静置培养5天得发酵产物。
4．酶液的制备发酵产物加20倍的蒸馏水浸提5小时，离心除去固形物，上清液为木质素酶液。
5．利用汽爆秸秆为原料发酵生产木质素酶方法的主要条件结论。
(1)．利用汽爆秸秆作发酵原料，其固态发酵产生的木质素酶活远远高于液态发酵(表1)。而且在两种发酵方式中，没有添加黎芦醇。这说明所选用的汽爆麦草不仅为生产菌提供了易利用的营养物质如半纤维素水解物，而且具有诱导木质素酶的物质，完全可以取代黎芦醇。这样，我们就可以用简单培养料生产木质素酶，使生产成本大大降低。
表1利用汽爆秸秆固态与液态发酵木质素酶(39℃，5天)
(2)由于麸皮中含有一定量的淀粉和维生素，有利于菌体生长，加入麸皮量较大时，菌丝生长旺盛，而酶活却最低。说明白腐菌的生长与产酶成反比关系。因此，汽爆麦草与麸皮之比为5∶1，木质素酶活最高。
表2汽爆麦草与麸皮不同比对产酶的影响(39℃，5d，液比1∶2)
(3)利用汽爆秸秆固态发酵生产木质素酶发酵过程如图2所示。MnP酶产生较早，在第四天就达到了高峰(2600U/L)；而LiP在第五天出现了一个产酶高峰(1100U/L)。LiP和MnP生产率分别达到了21.667U/L.h和11.458U/L.h。
实施例2汽爆玉米秸秆固态发酵生产木质素酶1．汽爆玉米秸秆将已粗切至约25mm长的80kg玉米秸秆装入1M3汽爆罐中，通入蒸汽，待排出罐内冷空气后，关闭装料阀，升压到1.7MPa，维压5min，打开放料阀，瞬间减压释放即得汽爆麦草。
2．发酵用培养基的制备及灭菌(重量百分比)向80％汽爆纤维质料和20％麸皮中加入水溶液，固液比1∶2，其中水溶液含有0.1％吐温80和0.05％谷氨酸，用0.1mol的盐酸调pH值4.5-6.5。于大型灭菌锅中灭菌，在0.1MPa压力下维持50分钟。
3．接种及装盘发酵将已灭菌的培养基打散，于无菌室接入黄孢原毛平革菌液体种子(相对于固体料重为10％的接种量)，混匀，装入己灭菌的搪瓷盘，上面覆盖已灭菌的纱布。移入发酵室，39℃静置培养4-5天。
4．酶液的制备发酵产物加20倍的蒸馏水浸提5小时，离心除去固形物，上清液为木质素酶液。利用汽爆玉米秸秆为原料固态发酵生产木质素酶活LiP和MnP分别为1534.08u/L和2006.22u/L。
实施例3汽爆麦草固态发酵生产木质素酶1．汽爆麦草将已粗切至约25mm长的80kg麦草装入IM3汽爆罐中，通入蒸汽，待排出罐内冷空气后，关闭装料阀，升压到1.3MPa，维压15min，打开放料阀，瞬间减压释放即得汽爆麦草。
2．发酵用培养基的制备及灭菌(重量百分比)
向90％汽爆纤维质料和10％麸皮中加入水溶液，固液比1∶2，其中水溶液含有0.1％吐温80，用0.1mol的盐酸调pH值5.5。于大型灭菌锅中灭菌，在0.01MPa压力下维持50分钟。
3．接种及装盘发酵将已灭菌的培养基打散，于无菌室接入黄孢原毛平革菌液体种子(相对于固体料重为10％的接种量)，混匀，装入已灭菌的搪瓷盘，上面覆盖已灭菌的纱布。移入发酵室，39℃静置培养5天。
4．酶液的制备发酵产物加20倍的蒸馏水浸提5小时，离心除去固形物，上清液为木质素酶液。利用汽爆玉米秸秆为原料固态发酵生产木质素酶活LiP和MnP分别为1485.00u/L和1900.00u/L。实施例4汽爆玉米秸秆固态发酵生产木质素酶1．汽爆玉米秸秆将已粗切至约25mm长的80kg玉米秸秆装入1M3汽爆罐中，通入蒸汽，待排出罐内冷空气后，关闭装料阀，升压到1.5MPa，维压10min，打开放料阀，瞬间减压释放即得汽爆麦草。
2．发酵用培养基的制备及灭菌(重量百分比)向80％汽爆纤维质料和20％麸皮中加入水溶液，固液比1∶2。于大型灭菌锅中灭菌，在0.01MPa压力下维持50分钟。
3．接种及装盘发酵将已灭菌的培养基打散，于无菌室接入黄孢原毛平革菌液体种子(相对于固体料重为10％的接种量)，混匀，装入己灭菌的搪瓷盘，上面覆盖已灭菌的纱布。移入发酵室，39℃静置培养4-5天。
4．酶液的制备发酵产物加20倍的蒸馏水浸提5小时，离心除去固形物，上清液为木质素酶液。利用汽爆玉米秸秆为原料固态发酵生产木质素酶活LiP和MnP分别为1600.00u/L和2100.00u/L。
权利要求
1．一种生产木质素酶的方法，其特征在于该方法为(重量百分比)向75-90％汽爆处理的纤维质原料和10-25％麸皮中，加入水溶液制成发酵培养基，固液比为(W/V)1∶1.5-2.5，其中所述的水溶液含有0-0.2％吐温80,0-0.1％谷氨酸钠，0-0.1％硫酸镁；调pH值4.5-6.5；灭菌，接入白腐菌液体种子，以固态发酵方式发酵汽爆处理后的纤维质原料；将固态发酵产物加水浸提并去除固形物，上清液为所得酶液即本发明木质素酶。
2．如权利要求1所述的生产木质素酶的方法，其特征在于所说的爆碎处理是指在汽爆罐中装入粗切的纤维质原料，于1.3-1.7MPa的蒸汽压力下对纤维质原料处理5-15分钟，瞬间减压释放。
3．如权利要求1或2所述的生产木质素酶的方法，其特征在于所说的纤维质原料是指麦草、稻草或玉米秆。
4．如权利要求1所述的生产木质素酶的方法，其特征在于所说的白腐菌是指黄孢原毛平革菌。
5．如权利要求1所述的生产木质素酶的方法，其特征在于所说的固态发酵方式是指浅盘式固态发酵。
6．如权利要求1所述的生产木质素酶的方法，其特征在于所说的白腐菌液体种子的接入量为相对于固体料重的10％。
全文摘要
本发明属于应用微生物领域,特别涉及生产木质素酶的方法。该方法为(重量百分比):向75－90%汽爆处理的纤维质原料和10－25%麸皮中,加入水溶液制成发酵培养基,固液比为1∶1.5－2.5,其中所述的水溶液可含有吐温80、谷氨酸钠及硫酸镁;调pH值后灭菌,接入白腐菌液体种子发酵;将固态发酵产物加水浸提,上清液为本发明木质素酶。本发明所用培养原料廉价,发酵方式简单,木质素酶产率高,大大降低了生产成本。
文档编号C12N9/42GK1307127SQ0010071
公开日2001年8月8日 申请日期2000年2月1日 优先权日2000年2月1日
发明者陈洪章, 刘健, 李佐虎 申请人:中国科学院化工冶金研究所