专利名称：一种呈现载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域中的呈现载体及其应用，特别是由人源肠毒素性大肠杆菌菌毛蛋白的优势血清型抗原蛋白CS3改造成的呈现载体及其应用。
菌毛是细菌表面的一种附属结构，呈毛发状，每个细菌表面有很多根菌毛，每根菌毛由500-1000个拷贝的菌毛蛋白组成。研究发现，菌毛蛋白种类繁多，而且许多种类的菌毛蛋白可作为外源表位的表面呈现载体。CS3是人源肠毒素性大肠杆菌(ETEC)菌毛蛋白的优势血清型抗原蛋白，它由一个60Md的大质粒编码，完整的CS3操纵子存在于一个4.7kb的Hind III酶切片段上，包括一个CS3结构基因和至少三个辅助蛋白基因。CS3结构基因编码168个氨基酸残基，其氨基端为信号肽。CS3具有较强的免疫原性，是一种保护性抗原，含有CS3的死菌疫苗已用于临床，具有免疫保护作用。因此，CS3是一种有应用前景的呈现载体，而国内外对此研究却很少。
本发明的目的是提供一种由CS3改造的表达效率较高的呈现载体。
为实现上述目的，本发明采取以下设计方案一种呈现载体，它是将人源肠毒素性大肠杆菌菌毛蛋白CS3编码基因突变成或插入至少一个酶切位点。
本发明以在CS3编码基因包括信号肽在内的第49、50，第72、73，第101、102位氨基酸残基一组、或两组、或三组对应的核苷酸序列突变成或插入一个酶切位点为优选。
本发明的呈现载体在基因工程中的应用，特别是它在构建活菌疫苗中的应用也是本发明的保护目的。
本发明的呈现载体-～突变后的CS3，其表达效率与野生型CS3相比基本没有差别，表明在所选定位置进行的突变对CS3本身的表达及抗原性影响甚微，仍能形成菌毛；与在野生CS3的82-83位氨基酸残基间进行的插入突变及在第136-137位氨基酸残基间进行的插入突变相比，表达效率要高2～3倍。在72、73位点突变了的CS3呈现载体酶切位点处插入外源表位如口蹄疫病毒VP1的9肽、脊髓灰质炎病毒的C3表位(11肽)、C-myc的10肽表位等后，杂合蛋白仍能得到表达并形成菌毛，表达效率为原来的一半左右，外源表位在细菌表面也能得到呈现。插入15肽的CTP3表位和19肽的ST全基因后，依然能检测到CS3的表达。由此可以证明，本发明的呈现载体--突变的CS3可以用于外源表位的表面呈现，而且具有较高的效率，在基因工程领域将得到广泛的应用，特别是为构建基因工程活菌疫苗及肽库的建立奠定了基础。
下面结合附图对本发明作进一步说明。
图1为本发明pCSX72的序列测定结果图2为本发明DH5α(pCSX72F)的电镜照片图3为本发明DH5α(pCSX72F)的免疫荧光检测图4为本发明DH5α(pCSX72F)的免疫电镜照片图5为本发明DH5α(pCSX72P)的电镜照片实施例1野生的CS3(含信号肽在内)第72、73位氨基酸残基对应的核苷酸序列突变所形成的呈现载体一、呈现载体的获得1、通过对168个氨基酸残基的野生CS3(包括信号肽在内)的亲水性、抗原表位、二级结构、柔韧性等性质进行计算机的预测分析，确定突变位点为第72-73位氨基酸残基处。
2、化学合成一对突变引物正链引物为5＇-CTTTCAAATTCTAGAATTGATACAGTTAGC-3＇反链引物为5＇-TGTATCAATTCTAGAATTTGAAAGAGTCAAAC-3＇3、为方便操作，合成一对两端引物，上游引物为5＇-GTTGTCGACTACATAGTAGG-3＇，从CS3中的HincII位点处开始；下游引物为5＇-GGGGTACCAAGCTTGACTATTTAATG-3＇，在CS3末端HincIII酶切位点后加了一个KpnI酶切位点。
4、采用重叠延伸PCR方法进行定点突变，首先以上游引物和反链引物配对以及以下游引物和正链引物配对分别进行PCR扩增，PCR程序为94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 45s，进行30个循环，72℃延伸10min，4℃保温。
5、将两段扩增产物分别回收，取等分子数混合，95℃变性5min，50℃退火3min，72℃延伸3min，再以上、下游引物配对进行PCR扩增，扩增产物即含有突变位点，完成CS3基因的定点突变。
6、用Hinc II和Kpn I双酶消化后，替代原野生CS3中包括ACCAGT在内的相应片段，即构建成表面呈现载体pCSX72，该呈现载体的第72、73位氨基酸残基对应的核苷酸序列为TCTAGA，是XbaI酶切位点。
二、本发明上述呈现载体的验证1、序列测定采用Qingen公司质粒提取试剂盒提取质粒pCSX72，用自动测序仪测定其核苷酸序列，从CS3的反端测入，结果如
图1所示，说明突变位点正确。
2、酶切鉴定用Xba I酶切pCSX72成7.4kb线状DNA片段；用Hinc II加Xba I双酶消化pCSX72，电泳可见1.1kb和7.3kb两条带。结果表明突变正确引入了Xba I酶切位点。
3、本发明呈现载体--CS3突变体表达水平的检测采用全菌ELISA方法进行测定。挑取DH5a(pCSX72)单菌落接种5ml LB Amp+，37℃振荡培养过液。取适量接种CFA琼脂平板，37℃培养18-20h，收获细菌，用0.2mol/L PBS pH7.4洗两遍，重悬。用0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释至OD 600＝1，以100μl/孔包被酶联板，4℃过液；PBS洗一遍，3％BSA37℃封闭1h；适度稀释的抗CS3单抗，37℃ 1h；含0.05％Tween-20的PBS洗三遍，适度稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗，37℃ 1h；如上洗三遍；OPD显色，2mol/L的H2SO4终止后，测定OD490。以空载体pUC19作为阴性对照，同时测定pUCS3及pMGD293的表达，结果见下表DH5α(pCSX72) DH5α(pUCS3)DH5α(pMGD293)DH5α(pUC19)OD490 2.232.31 0.98 0.16结果显示DH5α(pCSX72)的表达水平与野生的CS3基本没有差别，比CS3的82-83位氨基酸残基基因突变体高2-3倍。
三、外源表位的插入及表面呈现1、FMDV VP1部分片段的表面呈现化学合成FMDV VP1的9肽基因片段及其互补链，基因片段为5＇-CTAGATATAAACAGAAAATCATCGCTCCGGCTT-3＇，其互补链为5＇-CTAGAAGCCGGAGCGATGATTTTCTGTTTATAT-3＇，退火后插入到pCSX72的Xba I位点间，以上游引物和互补链为引物，菌落PCR方法筛选正向插入的重组子DH5α(pCSX72F)。如上所述的全菌ELISA法测定杂和CS3的表达水平和FMDV VP1的表达水平，检测VP1时以抗FMDV单抗取代抗CS3单抗即可。结果CS3仍然得到了表达，表达水平为空载体对照的一半左右；VP1也获得了表达，全菌ELISA呈阳性，说明FMDV VP1在细菌表面得到了呈现。如图2所示，对重组菌株的电镜观察显示，杂和CS3仍能形成菌毛1，说明重组蛋白仍能装配成菌毛。采用免疫荧光检测法检测杂和蛋白的表达，发现用抗CS3单抗和抗FMDV单抗(如图3所示)都能使菌体着染，说明FMDV VP1在细菌表面得到了呈现。如图4所示，用抗FMDV单抗对重组菌进行免疫电镜检测，发现FMDV VP1在细菌表面得到了呈现。
2、脊髓灰质炎病毒C3表位的表面呈现化学合成脊髓灰质炎病毒C3表位的基因序列及其互补序列，基因序列为5＇-CTAGAGATAACCCGGCGTCGACCACCAACAAAGATAAAT-3＇，其互补链为5＇-CTAGATTTATCTTTGTTGGTGGTCGACGCCGGGTTATCT-3＇，退火后插入到pCSX72的Xba I位点间，同上采用菌落PCR方法筛选正向插入的重组子DH5α(pCSX72P)，并检测杂和蛋白CS3的表达水平。结果显示CS3的表达量为插入前的一半左右。如图5所示，电镜观察发现，重组菌也能形成菌毛2，说明重组蛋白仍能装配成菌毛，脊髓灰质炎病毒C3表位得到呈现。
3、霍乱毒素B亚单位CTP3表位、C-myc十肽表位以及ST全基因在细菌表面的呈现同上化学合成霍乱毒素B亚单位CTP3表位、C-myc十肽表位以及ST全基因的核苷酸序列及其互补序列，退火后插入到pCSX72的Xba I位点间，经菌落PCR方法筛选到正向插入的重组子后，全菌ELISA法检测杂和蛋白的表达水平，结果CS3仍然得到了表达。
四、动物免疫实验以插入FMDV VP1的重组菌DH5α(pCSX72F)为例，同上制备细菌，以108个细菌/只腹腔注射免疫Balb/c小鼠，一周后加强免疫一次，间一周后第二次加强免疫。两周后取血，ELISA法检测抗体产生情况。结果显示，机体产生了针对CS3和FMDV VP1的抗体，说明该重组菌可诱导机体产生针对CS3和外源表位的双重免疫应答反应。
在上述实施例中，可以用相同的方法将72-73位氨基酸残基对应的核苷酸序列突变为Bam HI酶切位点GGATCC；SacI酶切位点GAGCTC或SmaI酶切位点CCCGGG等。同时，上述酶切位点还可以插入到72-73位氨基酸残基对应的核苷酸序列中。
在上述实施例中，可以用相同的方法将第71-74位氨基酸残基中两个相邻的氨基酸残基，如71、72；73、74对应的核苷酸序列突变成或插入一个酶切位点。突变或插入的酶切位点除了可以是上述列举的酶切位点外，还可以是其它酶的切点。
实施例2野生的CS3第48-51位氨基酸残基对应的核苷酸序列突变所形成的呈现载体应用实施例1的重叠延伸PCR方法，在设计的突变引物中加入目的序列，即可以将野生CS3编码基因包括信号肽在内的第48-51位氨基酸残基中两个相邻的氨基酸残基对应的核苷酸序列突变成或插入一个酶切位点，如将第49、50位的CAGGAT，突变成Sac I酶切位点GAGCTC。
实施例3野生的CS3第100-103位氨基酸残基对应的核苷酸序列突变所形成的呈现载体应用实施例1的重叠延伸PCR方法，在设计的突变引物中加入目的序列，即可以将野生CS3编码基因包括信号肽在内的第100-103位氨基酸残基中两个相邻的氨基酸残基对应的核苷酸序列突变成或插入一个酶切位点，如将第101、102位的AACTCT，突变成XbaI酶切位点TCTAGA。
应用上述方法，还可以将野生CS3编码基因其它位点的核苷酸序列突变或插入一个酶切位点，如第27-30位，57-60位，112-114位，146-148位及155-158位。
实施例4野生的CS3编码基因中突变或插入两个酶切位点呈现载体是将CS3编码基因包括信号肽在内的第49、50，第72、73，第101、102位氨基酸残基中的任意两组对应的核苷酸序列突变成或插入一个酶切位点。
在该实施例中，突变或插入酶切位点也可以是其它位置。
实施例5野生的CS3编码基因中突变或插入三个酶切位点呈现载体是将CS3编码基因包括信号肽在内的第49、50，第72、73，第101、102位氨基酸残基对应的核苷酸序列突变成或插入一个酶切位点。
在该实施例中，突变或插入酶切位点也可以是其它位置。
权利要求
1.一种呈现载体，其特征在于它是将人源肠毒素性大肠杆菌菌毛蛋白CS3编码基因突变成或插入至少一个酶切位点。
2.根据权利要求1所述的呈现载体，其特征在于该呈现载体是将CS3编码基因包括信号肽在内的第71-74位氨基酸残基中两个相邻的氨基酸残基对应的核苷酸序列突变成或插入一个酶切位点。
3.根据权利要求2所述的呈现载体，其特征在于该呈现载体是将CS3编码基因包括信号肽在内的第72、73位氨基酸残基对应的核苷酸序列突变成或插入一个酶切位点。
4.根据权利要求1所述的呈现载体，其特征在于该呈现载体是将CS3编码基因包括信号肽在内的第48-51位氨基酸残基中两个相邻的氨基酸残基对应的核苷酸序列突变成或插入一个酶切位点。
5.根据权利要求4所述的呈现载体，其特征在于该呈现载体是将CS3编码基因包括信号肽在内的第49、50位氨基酸残基对应的核苷酸序列突变成或插入一个酶切位点。
6.根据权利要求1所述的呈现载体，其特征在于该呈现载体是将CS3编码基因包括信号肽在内的第100-103位氨基酸残基中两个相邻的氨基酸残基对应的核苷酸序列突变成或插入一个酶切位点。
7.根据权利要求6所述的呈现载体，其特征在于该呈现载体是将CS3编码基因包括信号肽在内的第101、102位氨基酸残基对应的核苷酸序列突变成或插入一个酶切位点。
8.根据权利要求1所述的呈现载体，其特征在于该呈现载体是将CS3编码基因突变成或插入两个或三个酶切位点。
9.权利要求1的呈现载体在基因工程中的应用。
10.根据权利要求9所述的权利要求1的呈现载体在基因工程中的应用，它在构建活菌疫苗及肽库的建立中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种呈现载体,它是将人源肠毒素性大肠杆菌菌毛蛋白CS3编码基因突变成或插入至少一个酶切位点,其中优选的是将野生CS3编码基因在包括信号肽在内的第72、73位、第49、50位、101、102位氨基酸残基对应的核苷酸序列突变成或插入酶切位点,本发明的呈现载体——突变的CS3可以用于外源表位的表面呈现,而且具有较高的效率,为构建基因工程活菌疫苗奠定了基础。
文档编号C12N15/70GK1263948SQ0010287
公开日2000年8月23日 申请日期2000年3月6日 优先权日2000年3月6日
发明者高荣凯, 张兆山, 李淑琴, 董自正 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所