专利名称：对hbv表面抗原pre－s1具有特异性的人源化抗体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及对HBV表面抗原pre-S1具有特异性的人源化抗体。
具体地说，本发明涉及对HBV表面抗原pre-S1具有特异性的人源化抗体，该抗体含有人源化的重链和轻链；涉及编码人源化的重链或轻链的基因；涉及含有所说的基因的表达载体和含有所说的表达载体的大肠杆菌转化子；以及涉及含有所说的人源化抗体的药物组合物，它可用于防止HBV感染或治疗慢性乙型肝炎。
HBV(乙型肝炎病毒)是人类慢性或急性肝炎的病因，严重时可导致肝硬化和肝癌。估计世界上大约三亿人患有肝炎(Tiollais和Buendia,Sci.Am.264:48,1991)。
存在三种HBV表面蛋白质，它们含有不同种类的表面抗原。具体地说，这些表面抗原蛋白质包括含有S抗原的主要蛋白质，含有S和pre-S2抗原的中等蛋白质(middle protein)，和含有S,pre-S2和pre-S1抗原的大型蛋白质(large protein)(Neurath和Kent，病毒研究进展，34:65-142,1988)。所有的表面抗原蛋白质可诱导中和HBV的抗体，特别是，针对HBV pre-S抗原的抗体与病毒的清除和HBV感染的康复，克服对S抗原的非响应性相关(Iwarson等，医学病毒学杂志，16:89-96,1985；Itoh等，美国科学院院刊，85:9174-9178,1986；Budkowska等，医学病毒学杂志，20:111-125,1986；Milich等，美国科学院院刊，82:8168-8172,1985；Milich等，免疫学杂志，137:315-322,1986)。
不同于pre-S2和S抗原，pre-S1抗原仅存在于感染的病毒颗粒中(Heerman等，病毒学杂志，52:396-402,1984)并参与对人类肝细胞的感染。因而，已有报道称特异于pre-S1抗原的单克隆抗体可有效中和HBV(Neurath等，细胞(Cell),46:429,1986；Pontisso等，病毒学(Virology,173:533,1989；Neurath等，疫苗(Vaccine),7:234,1989)，并且这种单克隆抗体被认为可用于防止HBV感染以及治疗慢性乙型肝炎。
到目前为止，乙型肝炎免疫球蛋白已被用于防止HBV感染，它可保护，例如，HBV阳性母亲的新生儿，暴露于HBV的医护人员，以及与慢性HBV相关的肝病的肝移植病人(Beasley等，Lancet,2:1099,1983；Todo等，Hepatology,13:619,1991)。但是，乙型肝炎免疫球蛋白具有一些缺点，例如，难以获得，低的比活及其可能被感染原污染。再者，乙型肝炎免疫球蛋白的另一个缺点是必须持续提供血浆。
作为乙型肝炎免疫球蛋白的一种替换物，已经开发出一种针对HBV表面抗原的鼠单克隆抗体。虽然鼠单克隆抗体显示出高的抗原亲和性并可大规模制备，它们在患者体内诱导人抗鼠抗体响应(Shawler等，免疫学杂志，135:1530,1985)。已有制备人单克隆抗体的尝试，但这些抗体中的很少一部分显示出高的亲和性。
然而，人们已经进行了人源化抗体的开发。人源化抗体具有类似于鼠抗体的高的亲和性和特异性，而其免疫原性被大大降低。人源化抗体是一种杂种抗体，其中，鼠抗体的CDR(互补性决定区域)通过遗传工程技术被移植到人抗体中。它可进行大规模地制备，并且在人中很少引起免疫响应，因为编码人源化抗体的大部分DNA序列来自人DNA序列(Riechman等，自然(Nature),332:323,1988)；Nakatani等，蛋白质工程(Protein Engineering),7:435,1994)。
为了克服鼠或人HBV免疫球蛋白的上述的和其它的缺点，本发明的发明人曾经尝试制备出可用于防止HBV感染以及治疗慢性乙型肝炎的人源化抗体。在本发明之前，我们制备出了针对HBV表面抗原pre-S1的鼠单克隆抗体KR127。此外，我们分离了编码KR127抗体的重链和轻链可变区的基因并测定了这些基因的序列(韩国专利申请1997-30696)。本发明是通过筛选与KR127抗体轻链和重链可变区的序列同源的人免疫球蛋白基因；构建人源化抗体的基因；将这些基因插入表达载体；将载体导入宿主细胞；从转化的细胞的培养物中得到人源化抗体；证实该人源化抗体对HV pre-S1抗原具有高的亲和性，类似于鼠单克隆抗体KR127。
本发明的一个目的是提供人源化抗体，它对鼠HBV表面抗原pre-S1的CDR具有特异性，在人中对抗原具有高的亲和性和低的免疫原性。
本发明达到了上述目的。
本发明提供了对HBV表面抗原pre-S1具有特异性的人源化抗体，包括人源化的重链和轻链。
本发明也提供了编码所说的人源化的重链或轻链的可变区的基因。
此外，本发明提供了含有所说的基因的表达载体以及含有所说的表达载体的大肠杆菌(E.Coli)转化子。
本发明还提供了含有所说的人源化抗体的药物组合物，它可用于防止HBV感染或治疗慢性乙型肝炎。
本发明的其它特点将在下文说明。
附图简要说明
图1a和
图1b比较性地描述鼠单克隆抗体KR127和本发明的两个人源化抗体中VH区域(重链的可变区域)的氨基酸和核苷酸序列；图2a描述制备编码本发明的人源化抗体重链的HKR127HC(Ⅰ)基因的过程；图2b描述制备编码本发明的人源化抗体重链的HKR127HC(Ⅲ)基因的过程；图3a和图3b比较性地描述鼠单克隆抗体KR127和本发明的人源化抗体中VL区域(轻链的可变区域)的氨基酸和核苷酸序列；图4描述制备编码本发明的人源化抗体的HKR127KC(Ⅰ)基因的过程；图5a描述含有人源化抗体的重链的基因的表达载体pCMV-HKR127HC；图5b描述含有人源化抗体的轻链的基因的表达载体pKC-dhfr-HKR127；图5c描述含有人源化抗体的重链的基因的表达载体pCMV-HKR127HC(Ⅲ)；图6a比较性地显示人源化抗体(HZKR127Ⅰ)和鼠单克隆抗体(KR127)的结合亲和性；和图6b比较性地显示人源化抗体(HZKR127Ⅲ)和人源化抗体(HZKR127Ⅰ)的结合亲和性。
下文将详细描述本发明。
本发明提供了对HBV表面抗原pre-S1具有特异性的人源化抗体，包括人源化的重链和轻链。
本发明也提供了编码所说的人源化的重链或轻链的可变区的基因。
所说的人源化的重链含有一种可变区域，它来自鼠KR127抗体的VH区域。鼠KR127抗体的VH区域描述于SEQ ID NO:19，本发明的人源化抗体的VH区域可通过将鼠KR127 VH区域的CDR移植到同源的人免疫球蛋白VH区域来制备。
并且所说的人源化轻链含有一种可变区域，它来自鼠KR127抗体的VL区域。鼠KR127抗体的VL区域描述于SEQ ID NO:22，本发明的人源化抗体的VL区域可通过将鼠KR127 VL区域的CDR移植到同源的人免疫球蛋白VL区域来制备。
在优选的实施方案中，我们筛查了与鼠单克隆抗体KR127的重链或轻链的氨基酸序列显示出最高的相似性的人免疫球蛋白。结果，从GenBank数据库中筛查出了人免疫球蛋白细菌品系(germline)基因DP7和DPK12。DP7显示出与鼠抗体KR127的VH区域具有最高的同源性，而DPK12与KR127的VL区域最相似。
本发明的人源化抗体可从编码人源化的VH区域或VL区域的重组基因制备。这些基因是通过将鼠KR127的CDR用人DP7或DPK12抗体的CDR代替来构建的。在构建这些基因中，相应于人源化的CDR的大部分氨基酸序列来自鼠抗体KR127的CDR。但是，一些来自鼠的CDR残基被人中的对应物替换，因为它们的相应的氨基酸残基不被认为参与抗原结合(见
图1)。以同样的方式，可变区的非CDR框架区域(FR)中一些来源于人的氨基酸残基被鼠的对应物替换，因为据认为这些FR残基可影响CDR的构型。
具体地说，编码人源化VH区域的HKR127HCv(HZⅡ)是通过将鼠KR127重链的部分CDR1,2,3和一个FR残基(位点72)移植到人DP7基因上制备的(见
图1)。
但是，从HKR127HCv(HZⅡ)基因表达的抗体对相应的抗原不显示显著的结合能力。为了改善HKR127HCv(HZⅡ)基因，我们也制备了HKR127HCv(HZⅠ)基因和HKR127HCv(HZⅢ)基因，它们比HKR127HCv(HZⅡ)基因含有更多的来自鼠的密码子(见
图1)。
HKR127HCv(HZⅠ)含有CDR1，部分CDR2，和CDR3，和鼠KR127VH的11个FR残基，而HKR127HCv(HZⅢ)含有相同的鼠CDR密码子和2个鼠FR残基(见
图1)。
为了构建编码本发明的人源化抗体的全长重链的HKR127HC(Ⅰ)基因，进行PCR反应，其中，用于扩增的模板是HKR127HCv(HZⅡ)基因或pRC/CMV-HC-HuS(KCTC0229BP)，它含有人类免疫球蛋白重链γ1的重链引导序列以及恒定区序列。
六对寡核苷酸(SEQ ID NO:1和2；3和4；5和6；7和8；9和10；11和12)被用作PCR引物(见图2a)。
将最初的五个PCR产物进行退火反应。然后，含有该五个PCR产物的DNA片段被用作重组PCR的模板，其中使用两个描述于SEQ IDNO:1和10的引物。进行另一个重组PCR，以将扩增的431碱基对的DNA片段与通过使用两个引物(SEQ ID NO:11和12)的PCR得到的DNA片段相连接。该重组PCR使用两个描述于SEQ ID NO:1和12的引物。将编码人源化抗体(HZKR127Ⅰ)重链的最终的1431碱基对的PCR产物，HKR127HC(Ⅰ)，导入pBluescript SK(+)载体(Clontech)，将产生的质粒载体命名为pHKR127HC(Ⅰ)。
引物描述于序列表中的SEQ ID NO:1至12，具体地说，由SEQ IDNO:1描述的引物在5’端含有EcoRⅠ序列，而由SEQ ID NO:12描述的引物在3’端含有SalⅠ序列。
在HKR127HC(Ⅰ)基因中的可变区域含有11个来自鼠的FR残基，其位点是12,28,30,48,67,68,70,72,74,79和95(见
图1)。重链可变区具有87个FR残基，没有变化的残基为76个。因而，HKR127HC(Ⅰ)基因的重链可变区FR的氨基酸序列与人类的DP7基因的重链可变区FR的氨基酸序列具有87％的同源性。
为了更进一步使HZKR127(Ⅰ)人源化，构建了HZKR127(Ⅲ)基因，它含有HKR127HCv(HZⅢ)基因，其72和74位具有2个来自鼠的FR残基(见
图1)。
为了构建编码本发明的人源化抗体的全长重链的HKR127HC(Ⅲ)基因，进行PCR反应，其中，用于扩增的模板是HKR127HCv(HZⅡ)基因或pRC/CMV-HC-HuS(KCTC0229BP)，它含有人类免疫球蛋白重链γ1的重链引导序列以及恒定区序列(见图2b)。
四对寡核苷酸(SEQID NO:1和24；25和26；27和28；11和12)被用作PCR引物(见图2b)。将最初的三个PCR产物进行退火反应。然后，含有该三个PCR产物的DNA片段被用作重组PCR的模板，其中使用两个描述于SEQ ID NO:1和28的引物。进行另一个重组PCR，以将扩增的431碱基对的DNA片段与通过使用两个引物(SEQ ID NO:11和12)的PCR得到的DNA片段相连接。该重组PCR使用两个描述于SEQID NO:1和12的引物。
将编码人源化抗体(HZKR127Ⅲ)重链的最终的1431碱基对的PCR产物，HKR127HC(Ⅲ)，导入pBluescript SK(+)载体(Clontech)，将产生的质粒载体命名为pHKR127HC(Ⅲ)。
在另一个实施方案中，编码人源化VL区域的HKR127KCv(HZⅡ)是通过将鼠KR127轻链的部分CDR1,CDR3和部分CDR2移植到人DPK12基因上制备的(见图3)。
但是，从HKR127KCv(HZⅡ)基因表达的抗体对相应的抗原不显示显著的结合能力。为了改善HKR127KCv(HZⅡ)的结合能力，我们也制备了HKR127KCv(HZⅠ)基因，它比HKR127KCv(HZⅡ)基因含有更多的来自鼠的密码子(见图3)。
为了构建编码本发明的人源化抗体的全长轻链的HKR127KC(Ⅰ)基因，进行PCR反应，其中，用于扩增的模板是HKR127KCv(HZⅡ)基因或pKC-dfhr-HuS(KCTC0230BP)，它含有人类免疫球蛋白轻链κ的轻链引导序列以及恒定区序列。
三对寡核苷酸(SEQ ID NO:13和14；15和16；17和18)被用作PCR引物(见图4)。
将最初的两个PCR产物进行退火反应。然后，含有该两个PCR产物的DNA片段被用作重组PCR的模板，其中使用两个描述于SEQ IDNO:13和16的引物。进行另一个重组PCR，以将扩增的360碱基对的DNA片段与通过使用两个引物(SEQ ID NO:17和18)的PCR得到的DNA片段相连接。该重组PCR使用两个描述于SEQ ID NO:13和18的引物。将编码人源化抗体(HZKR127Ⅰ)轻链的最终的739碱基对的PCR产物，HKR127KC(Ⅰ)，导入pBluescript SK(+)载体(Clontech)，将产生的质粒载体命名为pHKR127KC(Ⅰ)。
引物描述于序列表中的SEQ ID NO:13至18，具体地说，由SEQIDNO:13描述的引物在5’端含有HindⅢ序列，而由SEQ ID NO:18描述的引物在3’端含有SalⅠ序列。
HKR127KC基因的可变区域FR含有5个来自鼠KR127的密码子(见图3)。该轻链具有83个FR残基，没有变化的FR残基为78个。因而，HKR127KC基因的轻链可变区FR的氨基酸序列与人类的DP7基因的轻链可变区FR的氨基酸序列具有94％的同源性。
此外，本发明提供了含有编码人源化的重链(VH)或轻链(VL)的可变区的基因的表达载体以及含有所说的表达载体的大肠杆菌(E.Coli)转化子。
在其它的优选的实施方案中，制备了表达载体，它含有编码人源化抗体的重链或轻链的基因(见图5a,5b或5c)。
具体地说，从质粒pHKR127HC(Ⅰ)和pHKR127HC(Ⅲ)通过用限制酶处理分别得到相应与人源化的重链的两种DNA片段，然后将其插入pRc/CMV(Invitrogen)，分别得到表达载体pCMV-HKR127HC(见图5a)和pCMV-HKR127(Ⅲ)HC(见图5c)。
此外，从pHKR127KC载体分离编码人源化轻链的DNA片段，然后将其导入pCMV-dfhr(KCTC8671P)构建表达载体pKC-dhfr-HKR127(见图5b)。
将大肠杆菌菌株DH5α用表达载体pCMV-HKR127HC,pCMV-HKR127(Ⅲ)HC或pKC-dhfr-HKR127转化。将得到的含有pCMV-HKR127HC和pKC-dhfr-HKR127的大肠杆菌转化子保藏在KCTC(韩国典型培养物保藏中心)(保藏号分别为KCTC0531BP和KCTC0529BP)，保藏日为1998年10月12日。含有pCMV-HKR127(Ⅲ)HC的大肠杆菌转化子于1999年11月15日保藏在KCTC(保藏号KCTC0691BP)。
在另一个优选的实施方案中，对HBV表面抗原pre-S1具有特异性的人源化抗体是在动物细胞中表达的，并从该细胞的培养基中获得。将COS7细胞用表达载体pCMV-HKR127HC和pKC-dhfr-HKR127瞬时共转染，并将得到的转染的细胞进行培养并将培养物上清液用于鉴定本发明的人源化抗体HZKR127Ⅰ。也用表达载体pCMV-HKR127(Ⅲ)HC和pKC-dhfr-HKR127共转染COS7细胞，并将转染的细胞的培养上清液用于鉴定人源化的抗体HZKR127Ⅲ。
本发明还提供了含有所说的人源化抗体的药物组合物。
按照其它优选的实施方案，已经证实，本发明的HZKR127Ⅰ和HZKR127Ⅲ人源化抗体当与鼠单克隆抗体KR127比较时，显示出几乎相同的抗原结合亲和性(见表1,2和图6a,6b)。
该组合物包括治疗有效量的针对HBV抗原pre-S1的人源化抗体，含有/不含有药学上可接受的投送载体。而且，该组合物可包括其它的抗肝炎药物，例如抗-S单克隆抗体或lamivudin。
针对HBV抗原pre-S1的人源化抗体可与药物载体或稀释剂进行配制，用于静脉内，皮下，肌肉内施用。该药物组合物可以传统的方式使用适于所需给药形式的固体的或液体的载体，稀释剂和添加剂配制。
本发明的人源化抗体给药的剂量范围是约1-10mg/kg，优选3-5mg/kg，并且可以每周给药一次。
但是，本领域的普通技术人员将会看到，根据本文的公开可以进行很多的变化和改进而不脱离本发明的范围和精神。实施例1编码人源化重链的基因的制备为了构建人源化重链可变区基因，首先，我们选择出与鼠单克隆抗体KR127的重链可变区具有最高的氨基酸同源性的人免疫球蛋白重链基因。结果，从GenBank数据库中选择出了人免疫球蛋白细菌系(germline)基因DP7。然后，我们通过DNA重组技术构建了人源化的VH区域基因HKR127HCv(HZⅡ)，它是基于鼠KR127 VH区域与人DP7 VH区域的比较。由于人源化的重链不显示显著的抗原结合活性，我们制备了编码另一个VH区域的HKR127HCv(HZⅠ)基因，以改进HKR127HCv(HZⅡ)基因(见
图1)。
具体地说，HKR127HCv(HZⅡ)基因是通过将人DP7基因的VH区域与鼠KR127 VH区域的部分CDR1,2,3和一个FR残基(位点72)进行移植制备的。据认为，人CDR和FR氨基酸残基影响抗体的抗原结合亲和性。
因而，通过使用HKR127HCv(HZⅡ)基因作为模板的PCR构建HKR127HCv(HZⅠ)基因。
另一方面，载体pRc/CMV-HC-Hus(保藏号KCTC0229BP)被用于合成编码人CH区域以及重链引导序列的DNA序列，它对重链的适当的分泌是必需的。
最后，通过将重链引导序列，HKR127HCv(HZⅠ)基因，和人CH基因进行退火的重组PCR构建编码人源化重链的HKR127HC(Ⅰ)(图2a)。
在这些PCR中的引物为合成的寡核苷酸，描述于SEQ ID NO:1至12。PCR反应使用Taq DNA聚合酶，其热循环重复30次，由94℃1分钟，55℃1分钟和72℃1分钟组成。五对寡核苷酸(SEQ ID NO:1和2,3和4,5和6,7和8,9和10)被用作PCR引物，五个PCR产物(分别为113碱基对，96碱基对，120碱基对，78碱基对，和87碱基对)进行退火。然后，含有五个PCR产物的DNA片段被用作重组PCR的模板，其中，使用了描述于SEQ ID NO:1和10的引物。进行另一个重组PCR，以将扩增的431碱基对的DNA片段与通过使用两个引物(SEQ ID NO:11和12)的PCR得到的1015碱基对的DNA片段相连接。该重组PCR使用两个描述于SEQ ID NO:1和12的引物。
将编码人源化抗体的重组重链的最终的PCR产物(HKR127HC(Ⅰ)，约1431碱基对)导入pBluescript SK(+)载体(Clontech)的EcoRⅠ-SalⅠ位点，将产生的质粒载体命名为pHKR127HC(Ⅰ)。将插入的基因的DNA序列通过双脱氧核苷酸方法进行测定。
为了更进一步使HKR127HC(Ⅰ)人源化，构建了另一个人源化的重链基因，HKR127(Ⅲ)，它含有较少数量的鼠FR残基。
为了构建HKR127HC(Ⅲ)，通过使用HKR127HCv(HZⅡ)基因作为模板的PCR构建HKR127HCv(HZⅢ)。另一方面，将载体pRc/CMV-HC-HuS(保藏号KCTC0229BP)用于合成编码人CH区域以及重量引导序列的DNA序列，它对重链的适当的分泌是必需的。
最后，通过将重链引导序列，HKR127HCv(HZⅢ)基因，和人CH基因进行退火的重组PCR构建编码人源化重链的HKR127HC(Ⅲ)(图2b)。
在这些PCR中的引物为合成的寡核苷酸，描述于SEQ ID NO:24至28。PCR反应使用Taq DNA聚合酶，其热循环重复30次，由94℃1分钟，55℃1分钟和72℃1分钟组成。三对寡核苷酸(SEQ ID NO:1和24,25和26,27和28)被用作PCR引物，三个PCR产物(分别为179碱基对，141碱基对，和87碱基对)进行退火。然后，含有三个PCR产物的DNA片段被用作重组PCR的模板，其中，使用了描述于SEQ ID NO:1和28的引物。进行另一个重组PCR，以将扩增的431碱基对的DNA片段与通过使用两个引物(SEQ ID NO:11和12)的PCR得到的1015碱基对的DNA片段相连接。该重组PCR使用两个描述于SEQ ID NO:1和12的引物。
将编码人源化抗体的重组重链的最终的PCR产物(HKR127HC(Ⅲ)，约1431碱基对)导入pBluescript SK(+)载体(Clontech)的EcoRⅠ-SalⅠ位点，将产生的质粒载体命名为pHKR127HC(Ⅲ)。将插入的基因的DNA序列通过双脱氧核苷酸方法进行测定。实施例2编码人源化轻链的基因的制备为了构建含有可变区的人源化轻链，我们设计了编码轻链的基因。首先，我们选择出与鼠单克隆抗体KR127的轻链具有最高的氨基酸序列同源性的人κ免疫球蛋白基因。结果，从GenBank数据库中选择出了人κ免疫球蛋白基因DPK12。然后，我们通过将鼠KR127 VL区域的CDR1，部分CDR2，和CDR3和一个在位点41的FR残基移植到人DPK12VL区域构建编码人源化VL区域的HKR127KCv(HZⅡ)基因。得到的人源化VL不具有抗原结合功能。为了改进HKR127KCv(HZⅡ)基因，我们构建了编码另一个VL区域的HKR127KCv(HZⅠ)基因(见图3)。
通过将人DPK12抗体的VL区域与鼠KR127 VL的几个FR残基和CDR1,CDR2和CDR3移植构建HKR127KCv(HZⅠ)基因。
另一方面，载体pKC-dhfr-Hus(保藏号KCTC0230BP)被用于合成编码人CL区域以及轻链引导序列的DNA序列，它对轻链的适当的分泌是必需的。
最后，通过将PCR产物，轻链引导序列，HKR127KCv(HZⅠ)基因，和人CL基因进行退火的重组PCR制备编码人源化轻链的HKR127KC(Ⅰ)(图4)。
在这些PCR中的引物为合成的寡核苷酸，描述于SEQ ID NO:13至18。PCR反应使用Taq DNA聚合酶，其热循环重复30次，由94℃1分钟，55℃1分钟和72℃1分钟组成。两对寡核苷酸(SEQ ID NO:13和14，和15和16)被用作PCR引物，两个PCR产物(分别为101碱基对和159碱基对)进行退火。然后，含有该两个PCR产物的DNA片段被用作重组PCR的模板，其中，使用了描述于SEQ ID NO:13和16的引物。进行另一个重组PCR，以将扩增的248碱基对的DNA片段与通过使用两个引物(SEQIDNO:17和18)的PCR得到的515碱基对的DNA片段相连接。该重组PCR使用两个描述于SEQID NO:13和18的引物。
将编码人源化抗体的重组轻链的最终的PCR产物(HKR127KC(Ⅰ),736碱基对)导入pBluescript SK(+)载体(Clontech)的HindⅢ-SalⅠ位点，将产生的质粒载体命名为pHKR127KC(Ⅰ)。将插入的基因的DNA序列通过双脱氧核苷酸方法进行测定。实施例3含有人源化重链基因的表达载体的构建将实施例1的pHKR127HC(Ⅰ)或pHKR127HC(Ⅲ)质粒用SalⅠ酶消化，使用Klenow酶进行处理将载体的两个末端平端化。将这一DNA片段用NotⅠ酶进一步消化得到编码人源化重链的基因。
另一方面，将pRc/CMV(Invitrogen)用XbaⅠ酶切割，并将载体的末端通过用Klenow酶处理进行平端化，然后用NotⅠ消化。
将人源化重链基因和线性化的载体连接得到表达载体pCMV-HKR127HC或pCMV-HKR127(Ⅲ)HC。将含有pCMV-HKR127HC或pCMV-HKR127(Ⅲ)HC的大肠杆菌转化子保藏在KCTC(韩国典型培养物保藏中心)(保藏号分别为KCTC0531BP和KCTC0691BP)，表达载体pCMV-HKR127HC和pCMV-HKR127(Ⅲ)HC分别示于图5a和5c。实施例4含有人源化轻链基因的表达载体的构建将实施例2的pHKR127KC载体用HindⅢ和ApaⅠ酶消化，并将得到的片段插入pCMV-dhfr(保藏号KCTC8671P)的HindⅢ-ApaⅠ位点，得到表达载体pKC-dhfr-HKR127。将含有pKC-dhfr-HKR127的大肠杆菌转化子保藏在KCTC(韩国典型培养物保藏中心)(保藏号为KCTC0529BP)，表达载体pKC-dhfr-HKR127示于图5b。实施例5人源化抗体在COS7细胞中的表达COS7细胞在5％二氧化碳条件下在37℃被保持在添加了10％小牛血清的DMEM(Gibco)中。这些细胞被接种在100mm的培养皿中，然后在37℃过夜温浴。
为了表达人源化抗体HZKR127Ⅰ，将5微克的pCMV-HKR127HC或者pKC-dhfr-HKR127用800微升的OPTI MEMⅠ(Gibco)稀释，并将50微升的Lipofectamin(Gibco)也用800微升的OPTI MEMⅠ稀释。将这些在15毫升试管中的混合物在室温下温浴15分钟或更长的时间。同时，将COS7细胞用OPTI MEMⅠ洗涤两次。
将OPTI MEMⅠ(6.4毫升)加入DNA-Lipofectamin混合物中，充分混合，倒在COS7细胞上。在将细胞在二氧化碳培养箱中培养72小时后，将培养基离心，并将上清液通过超滤装置进行浓缩。通过SandwichELISA使用抗人IgG和抗人IgG-HRP(辣根过氧化物酶)联合体测定抗体的浓度。
为了表达并得到人源化抗体HZKR127Ⅲ，重复相同的方法，只是使用pCMV-HKR127(Ⅲ)HC，而不是使用pCMV-HKR127HC。实施例6人源化抗体对HBV表面抗原pre-S1的结合活性我们制备了HBV表面抗原pre-S1(氨基酸残基1-56；Kim和Hong,Biotechnology letters,17:871-876,1995)，并将1微克的纯化的pre-S1包被在微滴板的每个孔中。在加入实施例5制备的0,0.25,0.5,1,2,3,4,5,7.5,10,20，或40ng的人源化抗体后，进行间接ELISA，其中第二抗体是Fc-特异性的抗人IgG-HRP联合体。抗体的结合活性是通过测定492nm的OD值进行测定的。
将纯化的鼠KR127抗体用作对照，并使用Fc-特异性抗鼠IgG-HRP联合体作为第二抗体进行KR127抗体的ELISA。结果示于表1和2。表1KR127和HZKR127Ⅰ对HBV表面抗原pre-S1的结合活性(在492nm的OD值) 续表1 表2HZKR127Ⅰ和HZKR127Ⅲ对HBV表面抗原pre-S1的结合活性(在492nm的OD值) 续表2 实施例7人源化抗体对HBV表面抗pre-S1的抗原结合亲和性对HBV表面抗pre-S1的抗原结合亲和性是通过竞争ELISA方法测定的(Ryu等，J.Med.Virol.,52:226,1997)。
pre-S1抗原(1×10-7-1×10-12M)和实施例5的人源化抗体(5ng)之间，或者抗原(1×10-7-1×10-12M)和对照抗体KR127(5ng)之间的结合反应性是在37℃进行2小时。然后将反应混合物加入96孔用250ng的抗原pre-S1包被的96孔微滴板上。
图6a显示两种抗体的亲和性。已经证实，人源化抗体HZKR127Ⅰ的结合亲和性几乎与鼠抗体KR127的结合亲和性相同(7×107M-1)。
图6b显示HZKR127Ⅲ的亲和性与HZKR127Ⅰ的亲和性的比较。HZKR127Ⅲ的亲和性(5×107M-1)与HZKR127Ⅰ的亲和性的差异不大(7×107M-1)。工业实用性如上文所述，本发明提供了针对HBV表面抗原pre-S1的人源化抗体，与鼠单克隆抗体相比它显示出相似的结合亲和性，而人源化抗体的免疫原性大大降低。因而，本发明的人源化抗体可用于防止HBV感染和治疗乙型肝炎。
本领域的普通技术人员将会看到，本文中公开的概念和特定的实施方案可被用作进一步改进或设计其它的实施方案的基础，以达到与本发明相同的目的。本领域的普通技术人员将会看到，这些等同的实施方案不脱离后附的权利要求中所述的本发明的精神和范围。
序列表<110>韩国科学技术研究院绿十字<120>对HBV表面抗原PRE-S1具有特异性的人源化抗体及其制备方法<130>9FPO-11-03<150>KR1998-49663<151>1998-11-19<160>28<170>KOPATIN1.5<210>1<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸引物1<400>1gaattcac attcacgatg tacttg26<210>2<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸引物2<400>2ggccccaggc ttcaccactt cagctcc 27<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的关核苷酸引物3<400>3gtgaagcctg gggcctca 18<210>4<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸引物4<400>4agaactactg aatgcgtagc cagaagc27<210>5<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸引物5<400>5gcattcagta gttcttggat gaactgg 27<210>6<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的关核苷酸引物6<400>6aatccgtcca accactcaa gaccctg 27<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸引物7<400>7tggattggac ggatttatcc t 21<210>8<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸引物8<400>8ggattgtct gcagtcagtg tggccttgcc ctggaactt 39<210>9<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸引物9<400>9actgcagaca aatccacgag cacagcctac atggagctc39<210>10<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸引物10<400>10gtcgtactct cttgcacaga 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Ser20 25 30Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe50 55 60Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 7580Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Glu Tyr Asp Glu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr100 105 110Val Ser Ala115<210> 20<211> 115<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 人源化重链HKR127HC(HZⅠ)的可变区<400> 20Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Ser20 25 30Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe50 55 60Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Glu Tyr Asp Glu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr100 105 110Val Ser 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Ile65 70 75 80Ile Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly85 90 95Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105 110Arg<210>23<211>113<212>PRT<213> 人工序列<220><223> 人源化轻链的可变区<400> 23Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly1 5 10 15Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser20 25 30Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly85 90 95Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105 110Arg<210> 24<211> 27<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 合成的寡核苷酸引物24<400>24gttcatccaa gaactggtga aggtgta 27<210>25<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸引物25<400>25agttcttgga tgaactgggt gcgacga 27<210>26<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸引物26<400>26gctcgtggat ttgtctgcag 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1．一种对HBV表面抗原pre-S1具有特异性的人源化抗体，含有人源化的重链和轻链可变区域。
2．按照权利要求1所述的人源化抗体，其中，该人源化重链可变区域含有由SEQ ID NO:20描述的氨基酸序列。
3．按照权利要求1所述的人源化抗体，其中，该人源化重链可变区域含有由SEQ ID NO:21描述的氨基酸序列。
4．按照权利要求1所述的人源化抗体，其中，该人源化重链可变区域含有一种氨基酸序列，它是从SEQ ID NO:21的氨基酸残基通过至少一个选自下组的氨基酸替换进行改变的Lys12→Val12,Thr28→Ala28, Thr30→Ser30Met48→Ile48,Arg67→Lys67, Val68→Ala68,Met70→Leu70,Val79→Ala79，和 Tyr95→Phe95。
5．按照权利要求1所述的人源化抗体，其中，该人源化轻链可变区域含有由SEQ ID NO:23描述的氨基酸序列。
6．一种编码人源化重链的基因，该人源化重链含有权利要求2,3或4的人源化重链可变区域。
7．按照权利要求6所述的基因，其中，该人源化重链可变区域含有由SEQ ID NO:20描述的氨基酸序列。
8．按照权利要求6所述的基因，其中，该人源化重链可变区域含有由SEQ ID NO:21描述的氨基酸序列。
9．一种编码含有一种人源化轻链可变区域的人源化轻链的基因，该人源化轻链可变区域含有描述于SEQ ID NO:23的氨基酸序列。
10．含有权利要求6的基因的表达载体。
11．按照权利要求10的表达载体，pCMV-HKR127HC，其中，权利要求7的基因被插入pRC/CMV(保藏号KCTC0531BP)。
12．按照权利要求10的表达载体，pCMV-HKR127(Ⅲ)HC，其中，权利要求8的基因被插入pRC/CMV(保藏号KCTC0691BP)。
13．一种含有权利要求9的基因的表达载体。
14．按照权利要求13的表达载体，pKC-dhfr-HKR127，其中，权利要求9的基因被插入pCMV-dhfr(保藏号KCTC0529BP)。
15．含有权利要求1的人源化抗体的药物组合物，它可用于防止HBV感染或治疗慢性乙型肝炎。
全文摘要
本发明涉及对HBV表面抗原pre－S1具有特异性的人源化抗体,它显示出与鼠单克隆抗体相似的结合亲和性并且由于它们具有较少的来源鼠的氨基酸残基从而显示出显著低的免疫原性。因而,本发明的人源化抗体可用于防止HBV感染和治疗乙型肝炎。
文档编号C12N15/12GK1322762SQ0010753
公开日2001年11月21日 申请日期2000年5月17日 优先权日2000年5月17日
发明者洪孝贞, 柳春济, 许香淑 申请人:韩国科学技术研究院, 韩国绿十字