专利名称：一种动物细胞堆积床大规模培养的接种方法
技术领域：
本发明涉及一种动物细胞堆积床大规模培养的接种方法，具体说来涉及一种利用微载体悬浮培养制备接种动物细胞，经逐级放大，最终直接加入到堆积床反应器进行大规模培养的方法。
利用重组动物细胞体外培养是生产高价值的蛋白，尤其是医用蛋白，例如EPO、t-PA等的重要方法之一。动物细胞培养方法主要有转瓶培养、直接悬浮培养、微载体悬浮培养、流化床培养、堆积床培养等。其中转瓶培养的生产率低，一般用于实验室规模。目前较常用的动物细胞大规模培养方法是直接悬浮培养、微载体培养和流化床培养，其生产规模已经放大至1,000升以上。但是，这几种培养系统对细胞的剪切力较大，造成培养液中的悬浮细胞和细胞碎片密度较高，在培养过程中往往会出现筛网分离单元被堵塞的情况，使得培养过程不得不中断。另外，由于收获的培养液中细胞碎片较多，对后处理过程非常不利。尽管现在已经采取了一些改进措施，但到目前为止这一问题还没有得到彻底地解决。
利用堆积床反应器培养动物细胞对动物细胞的剪切力小，能达到很高的细胞密度，容易进行灌流操作，收获的上清中悬浮细胞很少，培养过程稳定，在小规模培养中显示出一定的优势。然而，到目前为止，还未能充分解决堆积床培养系统中接种细胞的制备问题，限制了堆积床系统的放大规模，致使有关动物细胞在堆积床培养系统中的大规模培养鲜有报道。
目前，一般是使用转瓶来制备堆积床培养系统的接种细胞，但这种方法占地大、工作量大、效率低、成本高，需要收集成百上千个转瓶的细胞，稍有不慎，就可能染菌，引起整个接种乃至培养的失败，并造成巨大的经济损失。有人借鉴微载体培养中中常规的接种方法，利用微载体培养系统培养细胞，然后采用特定的方法例如用胰酶消化或低温方法等使细胞从微载体上脱离下来，收集单细胞悬液作为接种细胞取得了成功，但这种方法对细胞的损伤较大、收获率低、步骤繁多、同样不能减少染菌的机会。
因此，到目前为止本技术领域的技术人员通常认为动物细胞堆积床培养方法不适合于进行大规模培养，一直在致力于改进上述较为常用的大规模培养系统，但效果并不显著。堆积床培养系统在动物细胞大规模培养中的所具有的潜力一直因接种问题得不到解决而被忽略。
本发明的目的是克服本领域技术人员的偏见，弥补现有技术的不足，提供一种物细胞堆积床大规模培养的接种方法。
最近，本发明人已经发现，在采用微载体系统培养贴壁依赖动物细胞的过程中，可以利用细胞在微载体中的自动转移现象，直接把长满细胞的微载体以一定的放大率接种到更大规模的含新鲜微载体的培养系统中，逐级放大微载体培养的规模，改进了微载体培养的接种方法(丛春水等，用多孔微载体CYTOPORE高密度培养CHO细胞生产人重组红细胞生成素的研究，生物工程通报，15，1，40-42，1999)。
因此，本发明人结合微载体培养和堆积床培养的优点，利用微载体系统培养接种用细胞，逐级放大，然后直接加入到堆积床培养系统中进行培养，开辟了一种动物细胞堆积床培养的接种方法，具体如下1)向微载体培养系统中接种动物细胞，使其终密度不小于1-5×105cells/ml；2)待微载体上长满细胞，将该长满细胞的微载体接种到不大于上述微载体培养系统10倍有效体积的微载体培养系统中；3)按照步骤2)方法依次在微载体培养系统中进行扩大培养，直到获得所需量的动物细胞；4)直接将长满细胞的微载体接种到堆积床培养系统中进行培养。
一般地，接种到堆积床中的微载体停滞在堆积床载体之间的空隙中，当反应结束后可以进行回收。
在堆积床中培养的细胞，优选是贴壁依赖动物细胞，如CHO细胞、VERO细胞和BHK细胞等。
在微载体培养中的微载体，可以是本技术领域常规的微载体，例如，交联葡聚糖作基质的微载体如Cytodex-1、Cytodex-2、Cytodex-3；多糖类作基质的微载体如CYTOPORE微载体；蛋白质作基质的微载体如Cultisper G；塑料作基质的微载体如Biosilo等，优选是CYTOPORE微载体。
在步骤1)中向微载体接种的动物细胞密度，优选终密度为5×105cells/ml到1×106cells/ml。接种的细胞密度越高，则在微载体培养系统中细胞越易存活，并能缩短达到最高密度的时间。
在步骤2)中，放大率(被接种的微载体培养系统的有效体积/接种微载体培养系统的有效体积)优选为4到10。
在步骤4)中，向堆积床中接种的动物细胞密度，优选终密度为5×105cells/ml到1×106cells/ml。
本发明的接种方法克服本领域技术人员的偏见，基于堆积床大规模培养的优点，开发出一种简便实用的接种方法。该方法能够迅速大量地制备堆积床培养的接种细胞，并简化了接种步骤，降低了染菌的机率，节省大量的人力和物力，使得堆积床培养不再受制于接种操作的限制，为工业上进行动物细胞大规模堆积床培养提供了可靠的途径。
由于堆积床培养系统为细胞提供了一个温和的生长环境，细胞密度可以达到很高，堆积床的床层可以有效地固定细胞在床层中，在培养液中的悬浮细胞很少，收获的培养液有利于下游后处理。另外，堆积床培养的控制简单、操作弹性大、适合于对细胞进行灌注培养。因此，本发明的堆积床接种方法将使得堆积床大规模培养成为可能，对动物细胞大规模培养技术有巨大的推动作用。
实施例1利用本发明接种方法在堆积床系统培养CHO细胞的中试试验(1)实验材料细胞，产生EPO的中国仓鼠卵母基因工程细胞。培养基，哺乳动物细胞培养基DMEM、F12、小牛血清为美国Gibco公司产品。其他试剂如谷氨酰胺、葡萄糖、氯化铵、乳酸、DMSO等均为进口和国产分析纯产品。按说明书配置DMEM/F12(1∶1)培养基，血清浓度为5％。
Cytopore微载体为Pharmacia公司产品，基质是纤维素，直径200μm，孔径30μm，膨胀体积为40ml/g，使用前用PBS浸泡，12l℃高压蒸汽灭菌，然后用培养基洗两次，用量为2.5g/L。
堆积床培养所用的聚酯片载体为NBS公司产品，基质是聚酯，使用前用PBS浸泡，121℃高压蒸汽灭菌，再用培养基洗两次。使用时填装聚酯片容量约为250g。
主要仪器，CO2恒温培养箱(NAPCO公司)、紫外分光光度计(Shimadzu公司)、鼓风式超净工作台(北京市半导体设备一厂)、台式高速离心机80-2(上海安亭科学仪器厂)、普通光学显微镜(重庆光学仪器厂)、生化培养箱(广东医疗器械厂)、酶联仪(Shimadzu公司)、氨基酸自动分析仪(日立公司)、超纯水机(Minipore公司)、500ml和1000ml搅拌器(Wheaton公司)、Celligen2.2-L和5-L生物反应器(NBS公司)。
试剂盒，血糖试剂测定盒购自北京百泰生物技术公司，乳酸和氨浓度测定试剂盒购自德国Centronic公司。(2)实验方法1)将CHO细胞复苏于70ml玻璃培养卡氏瓶(简称方瓶)中，置于37℃ 5％CO2湿润培养箱中培养。在玻璃瓶中的培养基为10ml。消化液用溶于Hank’s液的0.2％胰酶。然后在总容积为1升的转瓶中培养CHO细胞。
2)把CHO细胞用胰酶从转瓶中消化下来，用培养液洗涤，向工作体积为250ml的含有微载体的500ml搅拌瓶中接种动物细胞，使其终密度为1×106cells/ml，搅拌转速20-40r/min，间歇换液，供给充分的营养；3)待微载体上长满细胞，将该长满细胞的微载体接种到工作体积为500ml的1000ml的微载体培养系统中，搅拌转速20-40r/min，间歇换液，供给充分的营养；4)待微载体上长满细胞，将该长满细胞的微载体接种到工作体积为1.5L的2.2-L的NBS微载体培养系统中，搅拌转速40-80r/min，间歇换液，供给充分的营养；5)待微载体上长满细胞，直接将长满细胞的微载体接种到有效容积为3.75升的堆积床培养系统中。起始搅拌速度为40r/min，30min后进行灌注培养。pH值设在7.20，维持溶氧在30％空气饱和度以上，灌注用的培养基中葡萄糖的浓度为8.3g/l，控制灌注速率，使整个培养系统中的葡萄糖浓度为1-3.0g/L，乳酸浓度为3.0g/L以下，氨浓度为4mM以下。
该堆积床反应器经约20天就可以达到2×107cells/ml以上的细胞密度，整个培养周期可以达到35到40天，可收获培养液25-30个反应器有效体积。而且，在整个培养过程中，培养液澄清透明，细胞碎片和游离细胞密度较微载体培养明显降低，特别有利于产品的下游纯化。
实施例2利用本发明接种方法在堆积床系统培养EPO单克隆抗体细胞的中试试验除了细胞为EPO单克隆抗体细胞，并在培养瓶中对它进行悬浮培养，然后接种进微载体培养系统，接种细胞密度为1×105cells/ml外，其他与实施例1相同，最后在堆积床培养系统所能达到的最大细胞密度为1.5×107cells/ml，大大高于在微载体培养系统或直接悬浮培养的密度。
权利要求
1.一种动物细胞堆积床培养的接种方法，其特征在于包括步骤1)向微载体培养系统中接种动物细胞，使其终密度不小于1-5×105cells/ml；2)待微载体上长满细胞，将该长满细胞的微载体接种到不大于上述微载体培养系统10倍有效体积的微载体培养系统中；3)依次在微载体培养系统中进行扩大培养，直到获得所需量的动物细胞；4)直接将长满细胞的微载体接种到堆积床培养系统中进行培养。
2.根据权利要求1所述的动物细胞堆积床培养的接种方法，其特征在于所培养的细胞是贴壁依赖动物细胞。
3.根据权利要求1所述的动物细胞堆积床培养的接种方法，所使用的微载体选自交联葡聚糖作基质的微载体、多糖类作基质的微载体、蛋白质作基质的微载体、塑料作基质的微载体。
4.根据权利要求3所述的动物细胞堆积床培养的接种方法，其特征在于所使用的微载体是CYTOPORE微载体。
5.根据权利要求1所述的动物细胞堆积床培养的接种方法，其特征在于在步骤3)中，放大率为4到10。
6.根据权利要求1所述的动物细胞堆积床培养的接种方法，其特征在于在步骤4)中，向堆积床中接种的动物细胞终密度为5×105cells/ml到1×106cells/ml。
全文摘要
一种动物细胞堆积床培养的接种方法,包括:向微载体培养系统中接种动物细胞;待微载体上长满细胞,将该长满细胞的微载体接种到更大体积的微载体培养系统中;依次在微载体培养系统中进行扩大培养;直接将长满细胞的微载体接种到堆积床培养系统中进行培养。能够迅速大量地制备堆积床培养的接种细胞,简化接种步骤,降低染菌机率,节省人力和物力,使得堆积床培养不再受制于接种操作的限制,为工业上进行动物细胞大规模堆积床培养提供了可靠的途径。
文档编号C12N5/07GK1327050SQ0010795
公开日2001年12月19日 申请日期2000年6月1日 优先权日2000年6月1日
发明者丛春水, 邓继先, 常钰 申请人:丛春水