专利名称：白色蛹虫草菌及生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的微生物，具体地说是一种白色蛹虫草菌及其生产工艺。
虫草真菌属于囊菌纲，肉座菌目，麦角菌科，虫草属。该属真菌现世界报道已有380余种，国内发现近65种。我国药用虫草历史悠久，特别是冬虫夏草为我国传统的名药材，具有多种医疗和滋补性作用，享誉海内外。此外，有药用价值，民间已习用的种尚有甘肃虫草、大蝉虫草、小蝉虫草、蛹虫草、巴西虫草等。我国不但虫草资源种类丰富，对药用和食用的历史也属世界之最。但是，目前所用的虫草种类几乎全部采自野生，除少数种人工培育至无性阶段外，人工大量培育成完全型(子实体)的种类极少。由于人类的活动，虫草生活的生态环境遭受了严重的破坏，加之人类的连年采挖，野生虫草资源日愈贫乏，许多物种面临灭绝危险，因此，合理利用虫草资源，加快人工培育研究，对于保护及合理开发利用虫草十分重要。
目前，国内外有多家在从事虫草菌的人工培育研究工作，并有多项技术申请了专利，综合这些技术不难看出他们的研究大多仅能将虫草菌培养至菌丝体阶段，能够培育成的子实体品种类很少，很难达到商品化大量培育虫草有性阶段--虫草子实体。培养易于在虫体上和培养基上长出子实体的高产、优质并能达到商品化生产子实体的虫草菌是目前虫草人工培养中急需解决的一大难题。
本发明目的在于提供一种产生虫草孢子粉丰富，生活力、寄生性强，适应性广，产量高，品质好，培养周期短，易于商品化生产虫草子实体的蛹虫草菌种。本发明的另一目的在于提供虫草菌的生产工艺，解决目前虫草子实体不能商品化大量培养的问题。
以下叙述本发明的主要内容一种白色蛹虫草菌株，该菌株已于2000年9月12日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.0487。
本发明所述的菌株是在培养蛹虫草子实体中发现的与蛹虫草子实体不同的白色子实体中获得的，将该白色子实体采用“孢子分离法”获取了该菌株，将该菌株扩繁培养后采用注射法，自然感染法等多种方法接种于蚕蛹体蚕幼虫及各种固体培养基上，经20～25℃条件下培养20-35天，均获得了白色蛹虫草子实体。本发明所述的菌株与原蛹虫草菌株主要区别如下区别一，原蛹虫草因菌种在黑暗条件下培养，菌丝体白色，但将其移入室内自然光下或40瓦灯下，12小时后菌丝变成桔黄色。本发明所述的菌株在黑暗条件下培养菌丝白色，在光照条件下培养菌丝仍然是黄白色。
区别二，蛹虫草子实体橙黄色，圆柱形或扁圆柱形，头部与柄部颜色一致，头部无孢子附着；本发明所述的菌株的子实体细条形，子实体白色或柄部颜色淡黄色，头部颜色白色，附有孢子粉。
区别三，原蛹虫草子实体上收集不到肉眼可见的孢子粉；本发明所述的菌株的子实体上可收集到黄白色粉状孢子粉；本发明所述的菌株与原踊虫草菌株的相同点相同点一，该菌株的分生孢子为圆形，无色，透明与原蛹虫草菌的分生孢子大小基本一致；相同点二，该菌株在固体培养上和在蚕蛹体上培育出来的菌丝体和子实体的气味与原蛹虫草菌丝体和子实体气味一致，都有蘑菇鲜香气味；相同点三，该菌株采用蛹虫草生产鉴别方法进行鉴别，均取得了一致的鉴别结果，即溶液颜色由黄色经红色、紫色、兰色变至黑绿色。证明它含有与蛹虫草一致的麦角甾醇及β谷甾醇等甾体化合物。
图1为本发明的生产工艺流程图。
以下结合附图详细叙述本发明的生产工艺流程(1)培养瓶的洗涤消毒将培养瓶在盛有洗涤液水溶液内浸泡20-30分钟，刷洗至洁净透明，再用自来水冲洗干净，然后将培养瓶放入鼓风干燥箱或高压灭菌器内消毒。干热消毒温度为160-180℃，时间为50-70分钟；蒸气消毒压力为1.3-1.4kg/平方厘米，时间为25-35分钟。消毒后放入无菌室内备用。
(2)寄主蚕蛹、蚕茧的储存和消毒处理本发明所述的蚕蛹为柞蚕蛹、桑蚕蛹、蓖麻蚕蛹及本领域人员公知的其他蚕蛹。
选择上述健壮无病、薄皮的优质蚕茧，将其放置在茧床，茧筐等盛茧容器内，放入储茧室储存，储茧室温度为2℃±2℃，室内要求干燥通气，储存时，筐或茧床不能积压，以免压坏蚕蛹。
削茧选蛹接种前1-2天将蚕茧从库内取出，用削茧器削破茧壳，将蚕蛹从壳内取出，弃去蚕脱，病蛹，坏蛹，选择健壮蚕蛹放入容器内，移入消毒室消毒处理。
洗蛹消毒首先用自来水将蛹体表面冲洗干净，然后将蚕蛹放入盛有消毒液的容器内对蚕蛹进行表面消毒处理。消毒液为70％酒精溶液或1/4的新洁尔灭溶液或其它无毒的能进行表面消毒的常用消毒药品。消毒时间3-5分钟；消毒后用无菌水冲洗干净，放入无菌容器内，移入无菌室储放备用，存放时间不能超过2小时。
(3)制备白色蛹虫草菌种A，分离纯化菌种分离白色蛹虫菌所用的培养基配方为蛋白胨10g，蚕蛹粉10g，奶粉10g，葡萄糖10g，琼脂20g，磷酸二氢钾1.5g，磷酸氢二钠1.0g，硫酸镁0.5g，生物素0.1mg，水1000ml，pH5.8。
分离方法本发明采用组织分离法即将白色蛹虫草子实体取下，用自来水冲洗干净，在无菌条件下，将子实体切成约0.1-0.2cm小块，放入1/4升汞溶液内消毒3-5分钟取出，用无菌水冲洗数次，接入培养基中，25℃条件下黑暗培养。
待菌丝萌发，在无菌条件下挑取无杂菌的菌落，移至新的培养基上，继续培养。用同样方法反复挑取，直至纯化至无杂菌感染为止，再将菌株保藏在4℃冰箱中备用。
B，菌种的培养母菌种的制备
母菌种培养基配方蛋白胨10g，蚕蛹粉10g，奶粉10g，蔗糖10g，磷酸二氢钾1.5g，磷酸氢二钠1.0g，琼脂25g，水1000ml，pH5.8。
按配方精确称取上述物质，首先将25g琼脂放入1000ml烧杯中，加入600ml热水浸泡10分钟，然后加热至琼脂完全溶化，另取500ml烧杯，将10g蚕蛹粉放入杯内加热开水200ml，浸泡30分钟，4层纱布过滤，弃去蛹渣，在蛹粉水内加入蛋白胨、奶粉、蔗糖，使之溶解。再另取一支50ml烧杯，将磷酸二氢钾，磷酸氢二钠放入杯中，加入200ml水，充分溶解后，一并倒入1000盛有琼脂液的烧杯中，定容1000ml，充分搅拌均匀后，将培养基分装在100ml三角瓶中，每瓶40毫升，瓶口用棉塞，牛皮纸线绳扎好放入高压灭菌锅内灭菌，压力为1.2kg/平方厘米，时间为25分钟，取出移入洁净工作台中，冷却后，接入白色蛹虫菌种。
液体菌种的制备液体菌种的配方为蛋白胨5g，蚕蛹粉5g，奶粉5g，葡萄糖5g，磷酸二氢钾1.5g，磷酸氢二钠1.0g，硫酸镁0.5g，生物素0.1mg，水1000ml，pH5.8。
按配方精确称取上述物质，充分搅拌后分装在500ml三角瓶内，每瓶250ml，瓶口用棉塞或塑料膜封扎好，置高压灭菌锅内灭菌，压力1.2kg/平方厘米，时间30分钟，取出，置洁净工作台内，冷却后接入白色蛹虫草菌种。在25℃振荡培养72小时。
固体菌种的制备固体菌种培养基配方为每500毫升菌种瓶内加入大米或小米或本领域内人员公知的其他物质60g，水60ml，瓶口用聚丙膜封口，线绳扎好后，置高压灭菌锅内灭菌。压力为1.2kg/平方厘米，时间为40分钟。取出冷却后，在无菌条件下接入白色蛹虫草菌种，移入培养室内培养架上黑暗培养，培养温度为25℃±2℃。
(4)接种蚕蛹及培育白色蛹虫草及子实体。
A，接种蚕蛹注射接种法在无菌条件下用医用注射器吸取菌液，注入蚕蛹体内，接种量柞蚕蛹0.5-1.0ml/蛹；蓖麻，桑蚕蛹0.1-0.2ml/蛹。接种完毕，将接种蛹置于无菌容器内，移入培养室培养架上黑暗培养，培养温度20℃±2℃。
自然感染法将米饭培养基菌种移入无菌室内，在洁净工作台上启开瓶盖，将经表面消毒的蚕蛹立放或横放在培养基上面的菌丝上，每500ml罐头瓶可接入柞蚕蛹8-16个，桑蚕、蓖麻蚕蛹30-80个。接种完毕，将瓶口按原样封好，置室内培养架上黑暗培养，培养温度20℃±2℃。
喷散接种法将液体菌种放入喷雾器内，将菌液喷洒在刚脱完皮的蚕幼虫体上或桑叶上保湿保温饲养，湿度90％以上，温度30℃左右。
B，培养僵蛹、僵蚕培养室温度20℃±2℃，室内湿度60-70％，黑暗培养。
注射接种法僵化时间7-15天；自然感菌法20-30天，待菌丝长满蛹体后，将已僵化的蚕蛹在无菌室内用镊子从菌瓶或菌盒中捡出，放入另一个无菌培养瓶中，瓶口用塑料膜封口，线绳扎好，移入育草室培育蛹虫草，将原培养瓶或培养盒内没僵的烂死蛹从瓶内挖出，移出室外处理。污染的菌瓶及时洗刷干净，消毒处理。喷散方法接种的蚕幼虫僵化后捡出直接放入培养瓶中培育虫草，还有一部分蚕幼虫在化蛹后才僵化，这时要进行摇茧，将僵化在茧壳内僵蚕蛹取出，放入培养瓶内培育蛹虫草。
C，培育子实体(培育蛹虫草)培育蚕蛹，蚕幼虫上的子实体前10天育草室温度25℃±2℃，湿度70-75％，室内光照强度500-800勒克斯，10天后，待子实体长高1cm左右时，室内温度降至20℃左右，直至采收。
培育固体培养基上的子实体菌丝培养阶段黑暗培养，温度为25℃±2℃；待菌丝长透瓶底后，降温至18℃±2℃时间，培养一周，一周后再升温到25℃±2℃，待子实体长到1cm左右时，温度降至20℃左右，直至采收。
(5)采收、干制，成品，包装。
A，蚕蛹、蚕幼虫蛹虫草的采收待子实体长出白色头部并有粉状孢子产生时，用镊子将其从培养瓶中取出，放入干燥盘内。
B，培养基上的子实体采收培养基上的子实体用镊子夹出，或连同米饭培养基内的菌丝一起挖出放入干燥盘内。
C，本发明的产品可直接是鲜品，如干燥可采用冻干法将采下的蛹虫草或培养基子实体放入冻干盘内，置冷冻干燥机中，预冻至冰点，然后减压干燥至含水量不超过8％，保持蛹体原形，色泽及营养成份活性成份不变。
热风干燥法将采下的蛹虫或培养基子实体放入干燥盘内，置鼓风干燥箱或干燥室内通风干燥湿度60℃，室内黑暗通风。
阴干法将采下的蛹虫在室内25℃温度下阴干。室内黑暗通风。
D，本发明的成品可以是冻干蛹虫草或烘干蛹虫草或阴干蛹虫草或蚕幼虫草或米饭培养基子实体或鲜蛹虫草。
E，包装本发明可采用塑料袋真空包装或纸盒、木盒、塑料盒等包装。
本发明较已有技术相比具有如下优点和积极效果1、所述的菌株比原菌株具有寄生性强，易于培养，产孢量高，孢子扩散性强，适于大量培养等优点。
2、所述的菌株可产生孢子粉，该粉扩散性强，可进行生物防治。
3、所述的菌株适应性广，5-35℃下均能生长，在含有C，N培养基上都能生长很好，并且能产孢子，抗菌性强，成品率100％。
4、将该菌种和原蛹虫草菌种制成液体菌种，振荡培养12小时后，用喷雾器将该菌液喷散在刚脱皮的四龄五龄蚕幼虫体上和桑叶上面，其结果本发明所述菌株致僵蚕率45％以上，原蛹虫草菌株致僵蚕率仅为1％。详见表3。
5、用同样的培养菌种方法和注射接种法，接种蚕蛹体在同样的条件下培养，结果，本发明所述菌株寄生率达95％；原蛹虫草菌株寄生率达60％左右。详见表1，2，4。
6、试验证明孢子粉有特殊的药理作用。
本发明实验实施例表1液体注射接种法接种蚕蛹结果
表2自然感染法接种蚕蛹培育蛹虫草结果
表3喷散法接种桑蚕幼虫培育虫草结果
表4米饭培养基培养子实体结果
*产孢子情况是指能否收集到孢子粉为标准以上结果从培养方面明显看出本发明所述菌菌从出子实体数，僵化数明显高于原蛹虫草菌株，而且本发明所述菌株能收集到虫草孢子粉，原蛹虫草菌株收集不到，另外本发明所述菌株的生产周期也明显短于原蛹虫草菌。
权利要求
1.一种白色蛹虫草菌株，其特征在于保藏号为CGMCC NO．0487。
2.一种白色蛹虫草子实体的制备方法，其特征在于将权利要求1所述的菌株制备母菌种，扩大培养，再接种到蚕蛹，桑蚕上，培养获得子实体。
3.根据权利要求2所述的方法，其中扩大培养是接种到液体培养基上。
4.根据权利要求2所述的方法，其中扩大培养基是将母菌种接种到大米或小米培养基上。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述接种方法是注射接种法，自然感染法和喷散接种法。
6.根据权利要求2所述的方法，其中所述子实体的培养包括前10天育草室温度25℃±2℃，湿度70-75％，室内光照强度500-800勒克斯，10天后，待子实体长高1cm左右时，室内温度降至20℃左右，直到采收。
7.根据权利要求2所述的方法，其中所述子实体的培育是指固体培养基上的子实体的培育，即菌丝培养阶段黑暗培养，温度25℃±℃，待菌丝长透瓶底后，降温至18℃±2℃培养一周，待子实体长至1cm左右时，温度降至20℃左右，直到采收。
全文摘要
本发明涉及一种新的微生物白色蛹虫草。将该菌株扩繁培养后,采用注射法、自然感染法、喷洒法等多种方法接种蚕蛹,蚕幼虫及各种米饭培养基,经20—25℃条件下培养可获得了白色蛹虫草子实体。该菌株具有能产生孢子粉,生活力、寄生力强,适应性广,产量高,品质好,易于大量培养等优点。本发明为利用蛹虫草菌的遗传多样性、选育出高产优质的虫草新品种开辟了新的途径。
文档编号C12N1/14GK1285400SQ0012488
公开日2001年2月28日 申请日期2000年9月21日 优先权日2000年9月21日
发明者苑桂华, 徐哲, 徐道田, 张亚 申请人:吉林东北虎药业股份有限公司, 徐哲, 苑桂华