专利名称：编码黄酮合酶的基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过基因工程技术控制和利用黄酮的生物合成，黄酮对植物中花的颜色，防紫外线的保护作用，与微生物的共生等有影响。更具体地，本发明涉及编码蛋白质的基因及其应用，所述蛋白质具有由黄烷酮合成黄酮的活性。
“类黄酮”是具有C6-C3-C6碳骨架的一组化合物的通称，它们广泛分布于植物细胞中。已知类黄酮具有吸引昆虫和其它传粉者的功能，可保护植物免受紫外线的侵袭，并参与与土壤微生物的相互作用(BioEssays,16(1994),Koes等，p123；Trends in Plant Science,1(1997),Shirley,B.W.,p.377)。
在类黄酮中，黄酮在植物与微生物的相互作用中起着重要作用，尤其是在豆科植物中更是如此，其中它们参与了与豆科细菌共生的起始步骤(植物细胞，7(1995),Dixon和Paiva,p.1085；植物病理学年评，33(1995),Spaink,p.345)。花瓣中的黄酮在被昆虫识别方面起作用并可用作辅色素而与花青苷形成复合物(Gendai Kagaku,(May,1998),Honda和Saito,p.25；Prog.Chem.Org.Natl.Prod.,52(1987),Goto,T.,p.114)。已知当黄酮与花青苷形成复合物时，花青苷的吸光度最大值往较长的波长偏移，即往蓝色方向偏移。
已广泛研究了类黄酮的生物合成途径(植物细胞，7(1995),Holton和Cornish,p.1071)，已分离出参与花青素3-葡糖苷和黄酮醇生物合成的所有酶的基因。然而，尚未分离出参与黄酮生物合成的基因。合成黄酮的酶包括属于双加氧酶家族并依赖于2-氧化戊二酸的酶(黄酮合酶Ⅰ)和属于细胞色素P450家族的单加氧酶(黄酮合酶Ⅱ)。这些酶是没有结构同源性的完全不同的酶。
据报道，在欧芹中，依赖于2-氧化戊二酸的双加氧酶催化由柚苷配基(一种黄烷酮)生产芹菜苷配基(一种黄酮)的反应(Z.Naturforsch.,36C(1981),Britsch等，p.742；Arch.Biochem.Biophys.,282(1990),Britsch,p.152)。已知其它类型的黄酮合酶Ⅱ存在于金鱼草(Z.Naturforsch.,36C(1981),Stotz和Forkmann,p.737)和大豆(Z.Naturforsch.,42C(1987),Kochs和Gri sebach,p.343；Planta,171(1987),Kochs等，p.519)中。最近，有人报道了大丁草花瓣中的基因座和黄酮合酶Ⅱ活性之间的相关性(植物化学，49(1998),Martens和Forkmann,p.1953)。然而，无人报道已分离出黄酮合酶Ⅰ和Ⅱ的基因或已高度纯化了黄酮合酶Ⅱ。
研究了细胞色素P450蛋白的特性，该蛋白质具有甘草二酮-合成活性，当用诱发剂处理经培养的甘草(Glycyrrhiza echinata)细胞时可诱导该活性。据信该蛋白质可催化甘草根亭配基(其为5-脱氧黄烷酮)第2位的羟化，接着非酶促打开半缩醛环，产生甘草二酮(植物生理学，105(1994),Otani等，p.1427)。为了克隆甘草二酮合酶，由经诱导剂处理的甘草培养细胞制备cDNA文库，克隆出8个编码细胞色素P450的基因片断(植物科学，126(1997),Akashi等，p.39)。
由这些片断得到2个不同的全长cDNA序列，各编码细胞色素P450,直至那时它们仍是未知的。具体地说，它们是CYPGe-3(细胞色素P450 No.CYP81E1)和CYPGe-5(细胞色素P450 No.CYP93B1，下文称之为CYP93B1)(植物生理学，115(1997),Akashi等，p.1288)。通过在使用培养的昆虫细胞的系统中进一步表达CYP93B1 cDNA，证实该基因编码的蛋白质可催化由甘草根亭配基(一种黄烷酮)合成甘草二酮的反应，和由柚苷配基(一种黄烷酮)生产2-羟基柚苷配基的反应。
通过用10％盐酸进行酸处理(室温，2小时)使2-羟基柚苷配基转变为芹菜苷配基(一种黄酮)。通过使圣草酚与表达CYP93B1的酵母的微粒体反应，接着进行酸处理可将圣草酚转变为藤黄菌素(一种黄酮)。由此阐明细胞色素P450基因编码黄烷酮2-羟化酶活性的功能(FEBS Lett.,431(1998),Akashi等.,p.287)。这里，由柚苷配基生产芹菜苷配基需要CYP93B1以及另一个未知的酶，由此得出的结论是总共需要两种酶。
然而，目前尚未鉴定出具有不经酸处理直接由黄烷酮(如柚苷配基)合成黄酮(如芹菜苷配基)之活性的酶。因此，尽管黄酮在植物中具有多种功能，但控制植物中的黄酮生物合成和改善黄酮参与的生物功能，如花的颜色的技术尚未见报道。与将参与由黄烷酮合成黄酮的两种酶的基因导入植物细胞相比，本身可催化由黄烷酮合成黄酮的酶的发现，该酶基因的获得，以及将该基因导入植物中具有更强的可操作性和工业实用性。
另外，在天然含有大量黄酮的花瓣中，预期通过反义方法或共抑制法控制黄酮合酶基因的表达也能改变花的颜色。另外，根据黄酮的抗细菌活性及其与土壤微生物的相互作用而在适当器官中表达黄酮合酶基因可增加植物抗细菌活性并因促进了与根际微生物的共生关系而改善豆科植物的固氮能力，并能获得防紫外线和光照的保护作用。
因此，本发明提供了编码可直接由黄烷酮合成黄酮的蛋白质的基因，该基因具体为编码黄酮合酶Ⅱ的基因，黄酮合酶Ⅱ可通过单个酶反应催化由黄烷酮合成黄酮的反应(下文称之为“黄酮合酶Ⅱ”)。
更具体地，本发明提供了编码P450蛋白的基因，所述蛋白质具有序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，并具有由黄烷酮合成黄酮的活性，还提供了编码具有经修饰的氨基酸序列但仍具有由黄烷酮合成黄酮之活性的蛋白质的基因，其中所述修饰是通过在上述氨基酸序列中添加或缺失一个或多个氨基酸和/或用不同氨基酸取代完成的。
本发明还提供了编码具有与序列表中SEQ ID NO:2所示氨基酸序列至少有55％同一性的氨基酸序列的蛋白质的基因，所述蛋白质具有由黄烷酮合成黄酮的活性。
本发明还提供了编码具有由黄烷酮合成黄酮之活性的蛋白质的基因，该基因在5×SSC,50℃的条件下可与序列表中SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的全部或部分杂交。
本发明还提供了载体，尤其是表达载体，其含有上述任一种基因。
本发明还提供了被上述载体转化的宿主。
本发明还提供了由上述任一种基因编码的蛋白质。
本发明还提供了生产上述蛋白质的方法，所述方法的特征在于培养上述宿主并从宿主中收集具有黄酮合成活性的蛋白质。
本发明还提供了其中导入了上述任一种基因的植物，或表现出相同特性的植物后代或其组织，如切花。
本发明还提供了使用上述基因改变类黄酮的量和组成的方法；使用上述基因改变黄酮量的方法；使用上述基因改变花的颜色的方法；使用上述基因使花的颜色变蓝的方法；使用上述基因使花的颜色更红的方法；使用上述基因修饰植物的光敏性的方法；使用上述基因控制植物和微生物之间的相互作用的方法。
实施本发明的具体方案由甘草CYP93B1基因编码的黄烷酮2-羟化酶由底物黄烷酮产生了2-羟基黄烷酮，通过酸处理将产物转变为黄酮。本发明人认为通过使用得自甘草的cDNA CYP93B1筛选例如含有大量黄酮的花的cDNA文库，从而得到编码具有直接由底物黄烷酮合成黄酮之活性的蛋白质的cDNA，即可得到编码黄酮合酶Ⅱ的基因(这是本发明的目的之一)。根据本发明，使用得自甘草的cDNA CYP93B1为探针筛选含有大量黄酮的紫苏的cDNA文库，可得到编码新细胞色素P450的cDNA(见实施例1)。
在酵母中表达得自紫苏的cDNA并与底物柚苷配基(一种黄烷酮)反应，结果无需经酸处理即可产生黄酮芹菜苷配基而不是2-羟基柚苷配基(见实施例2)。换句话说，该酶可直接由黄烷酮产生黄酮，而无需经酸处理，经证实，其基因为以前从未克隆过的黄酮合酶Ⅱ基因。
本发明的基因可以是例如编码序列表中SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的基因。然而，已知其氨基酸序列经添加或缺失多个氨基酸和/或被不同氨基酸取代而被修饰的蛋白质可保持与原始蛋白质相同的酶活性。因此，具有序列表中SEQ ID NO:2所示氨基酸序列，但其中的氨基酸序列经添加或缺失一个或多个氨基酸和/或被不同氨基酸取代而被修饰的蛋白质，以及编码所述蛋白质的基因也包含在本发明中，只要它们保持直接由黄烷酮生产黄酮之活性即可。
本发明还涉及具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列和编码本文所述氨基酸序列之核苷酸序列，或在例如5×SSC,50℃的条件下可与所述核苷酸序列的部分杂交的基因，条件是它们能编码具有由黄烷酮生产黄酮之活性的蛋白质。适当的杂交温度随核苷酸序列和核苷酸序列长度的不同而不同，例如，当所用探针是含有编码6个氨基酸的18个碱基长的DNA片断时，优选温度不超过50℃。
所述杂交选择的基因可以是天然的，例如得自如金鱼草，蝴蝶草或紫苏的植物基因；也可以是另一种植物的基因，如龙胆，马鞭草，菊，鸢尾草等的基因。杂交所选择的基因可以是cDNA或基因组DNA。
本发明还涉及编码具有与序列表中SEQ ID NO:2所示氨基酸序列至少有55％，优选至少70％，如80％或以上甚至90％或以上同一性的氨基酸序列的蛋白质的基因，所述蛋白质具有由黄烷酮合成黄酮的活性。
通过如实施例所述筛选cDNA文库可得到具有天然核苷酸序列的基因。可使用具有天然核苷酸序列的DNA作为起始物质，通过常规的定点诱变或PCR法合成编码具有经修饰的氨基酸序列的酶的DNA。例如，通过用限制性酶处理天然cDNA或基因组DNA，然后用作定点诱变或PCR(使用的引物中导入了所需的突变)的模板，即可得到其中导入所需修饰的DNA片断。然后可将已导入突变的DNA片断与编码靶酶另一部分的DNA片断连接。
或者，为了得到编码由缩短的氨基酸序列组成的酶的DNA，例如，可用所需的限制性核酸内切酶切割编码长于目的氨基酸序列的氨基酸序列(如全长氨基酸序列)的DNA，如果所得DNA片断不编码完整的靶氨基酸序列，可将该片断与含有其余序列的合成DNA连接。
可在使用大肠杆菌或酵母的表达系统中表达所得的基因，检测其酶活性以证实所得基因编码黄酮合酶。通过表达基因，也可得到黄酮合酶蛋白作为基因产物。或者，甚至可以使用SEQ ID NO:2所示的全部或部分氨基酸序列的抗体来得到黄酮合酶蛋白，可使用这种抗体克隆另一种生物中的黄酮合酶基因。
因此，本发明还涉及含有上述基因的重组载体，尤其是表达载体，并涉及被这些载体转化的宿主。所用宿主可以是原核或真核生物。常用作宿主的原核生物的例子包括埃希氏菌属的细菌，如大肠杆菌，和芽孢杆菌属的微生物，如枯草芽孢杆菌。
可以使用的真核宿主的例子包括低等真核生物，如真核微生物(如真菌门中的酵母和丝状真菌)。至于酵母，可提及的是属于糖酵母属的微生物，如酿酒酵母，至于丝状真菌，可提及的是属于曲霉属的微生物，如米曲霉和黑曲霉和青霉属的微生物。也可使用动物细胞和植物细胞，动物细胞可以是小鼠，仓鼠，猴或人的细胞系。也可使用昆虫细胞，如家蚕细胞或成年家蚕本身。
本发明的表达载体可包括表达调节区，如启动子和终止子，复制起点等，这取决于它们欲导入的宿主类型。可以使用的细菌表达载体启动子的例子包括常规的启动子，如trc启动子，tac启动子，lac启动子等。可以使用的酵母启动子的例子包括甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子，PH05启动子等。可以使用的丝状真菌启动子的例子包括淀粉酶启动子，trpC等。可以使用的动物细胞宿主启动子的例子包括病毒启动子，如SV40早期启动子，SV40晚期启动子等。
根据常规方法，使用限制性核酸内切酶，连接酶等可以制备表达载体。用表达载体转化宿主也可根据常规方法进行。
可以培养，栽培或发酵被表达载体转化的宿主，可根据常规方法，如过滤，离心分离，细胞破碎，凝胶过滤层析，离子交换层析等从培养产物中回收和纯化靶蛋白质。
本说明书全文讨论了得自紫苏的黄酮合酶Ⅱ，该酶能直接由黄烷酮合成黄酮，已知细胞色素P450基因构成了超家族(DNA和细胞生物学，12(1993),Nelson等，p.1)，相同家族中的细胞色素P450蛋白的氨基酸序列具有40％或更高的同一性，而亚家族中的细胞色素P450蛋白的氨基酸序列具有55％或更高的同一性，它们的基因能互相杂交(Pharmacogenetics,6(1996),Nelson等，p.1)。
例如，首次从矮牵牛属植物中分离出类黄酮3’,5’-羟化酶的基因，所述酶是细胞色素P450的一种并参与类黄酮合成途径(自然，366(1993),Holton等，p.276)，使用矮牵牛类黄酮3’,5’-羟化酶基因作为探针易于从龙胆(植物细胞生理学，37(1996),Tanaka等，p.711)，草原龙胆，风铃草(WO93/18155(1993),Kikuchi等)，薰衣草，蝴蝶草和马鞭草(Shokubutsu no Kagaku Chosetsu,33(1998),Tanaka等，p.55)中分离出类黄酮3’,5’-羟化酶基因。
因此，本发明的能直接由黄烷酮合成黄酮的紫苏黄酮合酶Ⅱ基因的全部或部分可用作探针以从不同种植物中得到能直接由黄烷酮合成黄酮的紫苏黄酮合酶Ⅱ基因。另外，通过纯化本说明书中所述的能直接由黄烷酮合成黄酮的紫苏黄酮合酶Ⅱ，通过常规方法得到抗该酶的抗体，即可得到与抗体反应的不同黄酮合酶Ⅱ蛋白，并得到编码这些蛋白质的基因。
因此，本发明并不仅限于能直接由黄烷酮合成黄酮的紫苏黄酮合酶Ⅱ基因，还涉及得自多种其它植物的能直接由黄烷酮合成黄酮的黄酮合酶Ⅱ。除了本文所述的紫苏外，所述黄酮合酶Ⅱ基因的来源还可以是龙胆，马鞭草，菊，鸢尾草，鸭跖草，矢车菊，鼠尾草，喜林草等，但本发明的范围不限于这些植物。
本发明还涉及通过导入一个或多个能直接由黄烷酮合成黄酮的黄酮合酶Ⅱ基因使颜色被修饰的植物，以及植物的后代或其组织，所述组织也可以是切花的形式。通过使用本发明的黄酮合酶Ⅱ或其已被克隆的基因，可以在只产生很少黄酮或根本不产生黄酮的植物种或变种中产生黄酮。通过在花瓣中表达一个或多个黄酮合酶Ⅱ基因，可以增加花瓣中黄酮的量，从而使花的颜色往例如，蓝色方向转变。
相反，通过抑制黄酮在花瓣中合成，可以使花的颜色往例如，红色方向转变。然而，黄酮对花色的作用很大，因此花色的改变并不局限于上述类型。就目前的技术水平而言，可以将基因导入植物并以组成型或组织特异性的方式表达基因，但是，也可以通过反义法或共抑制法抑制靶基因的表达。
可转化的植物的例子包括玫瑰，菊，麝香石竹，金鱼草，仙客来，红门兰，草原龙胆，香雪兰，扶郎花，唐菖蒲，满天星，伽蓝菜，百合，天竺葵，老鹤草，碧冬茄，蝴蝶草，郁金香，水稻，大麦，小麦，油菜子，马铃薯，番茄，白杨，香蕉，桉树，甜马铃薯，大豆，苜蓿，羽扇豆，玉米等，但并不限于这些植物。
由于黄酮具有如上所述的多种生理学活性，它们可赋予植物新的生理学活性或经济价值。例如，通过在根中表达产生黄酮的基因，可以促进对该植物有利的微生物的生长，从而促进植物生长。也可以合成在人，动物或昆虫中表现出生理学活性的黄酮。
下列实施例将更详细地解释本发明。除非特别说明，可根据分子克隆(Sambrook等，1989)进行分子生物学方法。
实施例1．克隆紫苏黄酮合酶Ⅱ基因从紫苏(Perilla frutescens)叶中提取RNA，通过Oligotex得到polyA+RNA。根据Gong等(植物分子生物学，35(1997),Gong等，p.915)的方法，将polyA+RNA用作模板以使用λgt10(Stratagene)为载体来制备cDNA文库。使用全长CYP93B1 cDNA为探针筛选cDNA文库。根据厂商推荐的方法，在低严紧条件下使用DIG-DNA-标记和检测试剂盒(Boehringer)进行阳性克隆的筛选和检测。
具体地说，42℃下，使用杂交缓冲液(5×SSC,30％甲酰胺，50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0),1％SDS,2％阻断试剂(Boehringer),0.1％月桂酰基肌氨酸，80微克/ml鲑精DNA)预杂交2小时，然后加入DIG标记的探针，将混合物放置过夜。65℃下，用含有1％SDS的5×SSC洗涤溶液将膜浸洗1.5小时。得到一个阳性克隆，将其称为噬菌体克隆#3。通过测定#3 cDNA之5’末端的核苷酸序列，预期#3 cDNA编码与甘草CYP93B1编码的黄烷酮2-羟化酶具有高同一性的序列，推测其编码功能类似于黄烷酮2-羟化酶的P450。
所得#3 cDNA编码的蛋白质在氨基酸水平上与CYP93B1所编码的黄烷酮2-羟化酶具有52％的同一性。紫苏克隆#3 cDNA的核苷酸序列示于SEQ ID NO.1，由其推定的氨基酸序列示于SEQ ID NO.2。
实施例2．在酵母中表达紫苏黄酮合酶Ⅱ基因进行下列实验以检测实施例1所得紫苏cDNA #3编码的蛋白质的酶活性。将实施例1所得的噬菌体克隆#3用作PCR(使用λ Arm引物(Stratagene))模板。PCR条件是98℃1分钟；98℃15秒，55℃10秒，74℃30秒共20个循环；接着74℃10分钟。将扩增的DNA片断亚克隆至pBluescript KS(-)的EcoRV位点。选择在pBluescript KS(-)的SalⅠ位点具有紫苏#3 cDNA起始密码子的克隆，将其称为pFS3。测定pFS3 cDNA的核苷酸序列，进行PCR以证实不存在错误。
将通过用SalⅠ和XbaⅠ消化pFS3得到的约1.8kb的DNA片断与用XhoⅠ和XbaⅠ预消化的pYES2连接，产生质粒pYFS3。然后将所得质粒导入BJ2168酵母(Nihon Gene)。通过Akashi等(FEBS Lett.,431(1998),Akashi等，p.287)所述的方法测定酶活性。30℃，在20ml选择培养基(6.7mg/ml无氨基酸的酵母含氮碱基(Difco),20mg/ml葡萄糖，30微克/ml亮氨酸，20微克/ml色氨酸和5mg/ml酪蛋白氨基酸)中将转化的酵母细胞培养24小时。
离心收集酵母细胞之后，30℃，在表达培养基(10mg/ml酵母提取物，10mg/ml蛋白胨，2微克/ml氯高铁血红素，20mg/ml半乳糖)中将收集的酵母细胞培养48小时。收集酵母细胞之后，通过悬浮在水中并收集细胞以进行洗涤。用玻璃珠破碎细胞10分钟，然后以8000g的转速离心细胞10分钟，以15,000g的转速进一步离心上清液10分钟以得到粗酶级分。
30℃下，将15微克(R,S)-柚苷配基(溶解于30微升2-甲氧乙醇中)，1ml粗酶溶液和1mM NADPH的混合物(总反应混合物体积1.05ml)反应2小时。通过加入30微升醋酸终止反应之后，加入1ml乙酸乙酯并混合。离心后，用蒸发器干燥乙酸乙酯层，将残留物质溶解于100微升甲醇中并用HPLC进行分析。根据Akashi等(FEBS Lett.,431(1998),Akashi等，p.287)所述的方法进行分析。酸处理包括将蒸发器干燥的样品溶解于150微升含有10％盐酸的乙醇中，搅拌30分钟。用1.3ml水稀释，加入800微升乙酸乙酯，混合，离心，回收乙酸乙酯层，然后干燥，溶解于200微升甲醇中并用HPLC进行分析。
表达pYFS3的酵母由柚苷配基产生了芹菜苷配基，而无需用酸处理反应混合物。这表明紫苏pFS3 cDNA编码具有黄酮合酶Ⅱ活性的蛋白质。
工业实用性通过将本发明的cDNA与适当植物表达载体连接，并将其导入植物中以表达或抑制黄酮合酶的表达，即可改变花的颜色。另外，通过不仅在花瓣中还在整个植物或其适当器官中表达黄酮合酶基因，可以增加抗植物微生物的抗性，或者通过促进与根际微生物的关系而改善豆科植物的固氮能力，以及改善植物防紫外线和光照的保护性作用。
序列表<110>SUNTORY LIMITED<120>编码黄酮合成酶的基因<130><160>2<210>1<211>1770<212>DNA<213>紫苏<220><223>编码具有直接将黄烷酮转变为黄酮之活性的蛋白质的核苷酸序列<400> 1tgtcgacgga gcaagtggaa atg gca ctg tac gcc gcc ctc ttc ctc ctg tcc 53Met Ala Leu Tyr Ala Ala Leu Phe Leu Leu Ser1 5 10gcc gcc gtg gtc cgc tcc gtt ctg gat cga aaa cgc ggg cgg ccg ccc 101Ala Ala Val Val Arg Ser Val Leu Asp Arg Lys Arg Gly Arg Pro Pro15 20 25tac cct ccc ggg ccg ttc cct ctt ccc atc atc ggc cac tta cac ctc 149Tyr Pro Pro Gly Pro Phe Pro Leu Pro Ile Ile Gly His Leu His Leu30 35 40ctc ggg ccg aga ctc cac caa acc ttc cac gat ctg tcc caa cgg tac 197Leu Gly Pro Arg Leu His Gln Thr Phe Mis Asp Leu Ser Gln Arg Tyr45 50 55ggg ccc tta atg cag ctc cgc ctc ggg tcc atc cgc tgc gtc att gct 245Gly Pro Leu Met Gln Leu Arg Leu Gly Ser Ile Arg Cys Val Ile Ala60 65 70 75gcc tcg ccg gag ctc gcc aag gaa tgc ctc aag aca cac gag ctc gtc 293Ala Ser Pro Glu Leu Ala Lys Glu Cys Leu Lys Thr His Glu Leu Val80 85 90ttc tcc tcc cgc aaa cac tcc acc gcc att gat atc gtc acc tac 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Leu Ser Ala Ala Val Val Arg1 5 10 15Ser Val Leu Asp Arg Lys Arg Gly Arg Pro Pro Tyr Pro Pro Gly Pro20 25 30Phe Pro Leu Pro Ile Ile Gly His Leu His Leu Leu Gly Pro Arg Leu35 40 45Mis Gln Thr Phe His Asp Leu Ser Gln Arg Tyr Gly Pro Leu Met Gln50 55 60Leu Arg Leu Gly Ser Ile Arg Cys Val Ile Ala Ala Ser Pro Glu Leu65 70 75 80Ala Lys Glu Cys Leu Lys Thr His Glu Leu Val Phe Ser Ser Arg Lys85 90 95His Ser Thr Ala Ile Asp Ile Val Thr Tyr Asp Ser Ser Phe Ala Phe100 105 110Ser Pro Tyr Gly Pro Tyr Trp Lys Phe Ile Lys Lys Leu Cys Thr Tyr115 120 125Glu Leu Leu Gly Ala Arg Asn Leu Ala His Phe Gln Pro Ile Arg Thr130 135 140Leu Glu Val Lys Ser Phe Leu Gln Ile Leu Met Arg Lys Gly Glu Ser145 150 155 160Gly Glu Ser Phe Asn Val Thr Glu Glu Leu Val Lys Leu Thr Ser Asn165 170 175Val Ile Ser His Met Met Leu Ser Ile Arg Cys Ser Glu Thr Glu Ser180 185 190Glu Ala Glu Ala Ala Arg Thr Val Ile Arg Glu Val Thr Gln Ile Phe195 200 205Gly Glu Phe Asp Val Ser Asp Ile Ile Trp Leu Cys Lys Asn Phe Asp210 215 220Phe Gln Gly Ile Arg Lys Arg Ser Glu Asp Ile Gln Arg Arg Tyr Asp225 230 235 240Ala Leu Leu Glu Lys Ile Ile Thr Asp Arg Glu Lys Gln Arg Arg Thr245 250 255Mis Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Ala Lys Asp Phe Leu Asp Met260 265 270Phe Leu Asp Ile Met Glu Ser Gly Lys Ala Glu Val Lys Phe Thr Arg275 280 285Glu His Leu Lys Ala Leu Ile Leu Asp Phe Phe Thr Ala Gly Thr Asp290 295 300Thr Thr Ala Ile Val Cys Glu Trp Ala Ile Ala Glu Val Ile Asn Asn305 310 315 320Pro Asn Val Leu Lys Lys Ala Gln Glu Glu Ile Ala Asn Ile Val Gly325 330 335Phe Asp Arg Ile Leu Gln Glu Ser Asp Ala Pro Asn Leu Pro Tyr Leu340 345 350Gln Ala Leu Ile Lys Glu Thr Phe Arg Leu His Pro Pro Ile Pro Met355 360 365Leu Ala Arg Lys Ser Ile Ser Asp Cys Val Ile Asp Gly Tyr Met Ile370 375 380Pro Ala Asn Thr Leu Leu Phe Val Asn Leu Trp Ser Met Gly Arg Asn385 390 395 400Pro Lys Ile Trp Asp Tyr Pro Thr Ala Phe Gln Pro Glu Arg Phe Leu405 410 415Glu Lys Glu Lys Ala Ala Ile Asp Val Lys Gly Gln His Phe Glu Leu420 425 430Leu Pro Phe Gly Thr Gly Arg Arg Gly Cys Pro Gly Met Leu Leu Ala435 440 445Ile Gln Glu Val Val Ile Ile Ile Gly Thr Met Ile Gln Cys Phe Asp450 455 460Trp Lys Leu Pro Asp Gly Ser Gly His Val Asp Met Ala Glu Arg Pro465 470 475 480Gly Leu Thr Ala Pro Arg Glu Thr Asp Leu Phe Cys Arg Val Val Pro485 490 495Arg Val Asp Pro Leu Val Val Ser Thr Gln500 50权利要求
1．基因，其编码具有序列表之SEQ ID NO:2所示氨基酸序列并显示出由黄烷酮合成黄酮之活性的蛋白质，或编码具有下述氨基酸序列之一种并具有由黄烷酮合成黄酮之活性的蛋白质，其中这些氨基酸序列已通过添加或缺失一个或多个氨基酸和/或用不同氨基酸进行一个或多个取代而被修饰。
2．权利要求1的基因，其与序列表之SEQ ID NO:2所示氨基酸序列至少具有55％的同一性，并具有由黄烷酮合成黄酮的活性。
3．权利要求1或2的基因，其在5×SSC,50℃下，能与序列表之SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的全部或部分杂交，并且编码具有由黄烷酮合成黄酮之活性的蛋白质。
4．载体，其含有权利要求1至3中任一项所述的基因。
5．被权利要求4的载体转化的宿主。
6．由权利要求1至3中任一项所述的基因编码的蛋白质。
7．生产具有黄酮合成活性之蛋白质的方法，其特征在于培养或生长权利要求5的宿主并从所述宿主中回收所述蛋白质。
8．其中已导入权利要求1至3中任一项所述基因的植物，或表现出相同特性的所述植物的后代或其组织。
9．权利要求8之植物或其具有相同特性的后代的切花。
10．使用权利要求1至3中任一项所述的基因改变类黄酮组成和/或其量的方法。
11．使用权利要求1至3中任一项所述的基因改变黄酮的量的方法。
12．使用权利要求1至3中任一项所述的基因改变花的颜色的方法。
13．使用权利要求1至3中任一项所述的基因使花的颜色变蓝的方法。
14．使用权利要求1至3中任一项所述的基因使花的颜色变红的方法。
15．使用权利要求1至3中任一项所述的基因改变植物光敏性的方法。
16．使用权利要求1至3中任一项所述的基因控制植物和微生物的相互作用的方法。
全文摘要
从例如紫苏中得到的编码可直接将黄烷酮转变为黄酮的酶的DNA及其用途;DNA和所编码酶的氨基酸序列示于SEQ ID NO:1＆2。将该基因导入植物中可例如改变植物的花色。
文档编号C12N9/02GK1310762SQ00800102
公开日2001年8月29日 申请日期2000年6月30日 优先权日1999年7月19日
发明者水谷正子, 田中良和, 久住高章, 绫部真一, 明石智义 申请人:三得利株式会社