专利名称：L－氨基酸生产菌以及用于生产l－氨基酸的方法
技术领域：
本发明涉及微生物工业领域技术。具体来说，本发明涉及通过发酵生产L-氨基酸的方法以及在该方法中使用的微生物。
背景技术：
在工业上采用短杆菌属(Brevibacterium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、芽胞杆菌属(Bacillus)、埃希氏菌属(Escherichia)、链霉菌属(Streptomyces)、假单胞菌属(Pseudomonas)、节杆菌属(Arthrobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)、青霉属(Penicillium)、念珠菌属(Candida)等微生物发酵生产氨基酸，例如L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-苏氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸和L-苯丙氨酸。为了提高生产率，使用分离自大自然的菌株或其人工突变体用作这样的工业微生物。已经公开了各种通过利用重组DNA技术增强L-谷氨酸生物合成酶的活性的技术，以提高L-谷氨酸的生产能力。
通过培育微生物例如上述微生物以及改进生产方法已经显著提高了L-氨基酸的生产能力。但是，为了进一步达到未来更高的要求，仍然需要开发以更低成本更有效生产L-氨基酸的方法。
关于通过发酵中醇(可以低成本大量获得的发酵原料)生产氨基酸的方法，常规已知方法采用以下微生物无色杆菌属(Achromobacter)或假单胞菌属(Pseudomonas)(日本专利公布(Kokoku)号45-25273/1970)、精朊杆菌属(Protaminobacter)(日本专利申请公开(Kokai)号49-125590/1974)、精朊杆菌属或甲烷单毛杆菌属(Methanomonas)(日本专利申请公开(Kokai)号50-25790/1975)、微环菌属(Microcyclus)(日本专利申请公开(Kokai)号52-18886/1977)、甲基菌属(Methylobacillus)(日本专利申请公开(Kokai)号4-91793/1992)、芽胞杆菌属(日本专利申请公开(Kokai)号3-505284/1991)等。
然而，迄今为止已知没有利用嗜甲基菌属细菌(Methylophilusbacteria)生产L-氨基酸的方法。尽管已知EP 0 035 831 A、EP 0 037 273A和EP 0 066 994 A描述的方法为利用重组DNA转化嗜甲基菌属细菌的方法，但是利用重组DNA技术改进嗜甲基菌属细菌的氨基酸生产能力仍然不为人们所了解。
发明公开本发明的目的是提供新型L-氨基酸生产菌和利用所述L-氨基酸生产菌生产L-氨基酸的方法。
本发明人致力于实现上述目的，结果发现嗜甲基菌属(Methylophilus)细菌适用于生产L-氨基酸。而且，尽管通常认为获得嗜甲基菌属细菌的营养缺陷型突变体是困难的(FEMS Microbiology Rev.39，235-258(1986)和Antonie van Leeuwenhoek 53，47-53(1987))，但是本发明人成功获得了所述细菌的营养缺陷型突变体。因此完成了本发明。
也就是说，本发明提供以下细菌(1)一种具有L-氨基酸生产能力的嗜甲基菌属细菌。
(2)按照(1)的嗜甲基菌属细菌，其中所述L-氨基酸是L-赖氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸或L-苏氨酸。
(3)按照(1)的嗜甲基菌属细菌，它可耐受L-氨基酸类似物或L-氨基酸辅源营养(auxotrophy)。
(4)按照(1)的嗜甲基菌属细菌，其中L-氨基酸生物合成酶活性提高。
(5)按照(1)的嗜甲基菌属细菌，其中二氢吡啶二羧酸盐合酶活性和天冬氨酸激酶活性提高，而且所述细菌具有L-赖氨酸生产能力。
(6)按照(1)的嗜甲基菌属细菌，其中二氢吡啶二羧酸盐合酶活性提高，而且所述细菌具有L-赖氨酸生产能力。
(7)按照(1)的嗜甲基菌属细菌，其中天冬氨酸激酶活性提高，而且所述细菌具有L-赖氨酸生产能力。
(8)按照(5)-(7)任一项的嗜甲基菌属细菌，其中选自天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸盐还原酶和二氨基庚二酸盐脱羧酶的一种、两种或三种酶的一种或多种活性提高。
(9)按照(5)的嗜甲基菌属细菌，其中所述二氢吡啶二羧酸盐合酶活性和所述天冬氨酸激酶活性提高，因为编码不影响L-赖氨酸的反馈抑制的二氢吡啶二羧酸盐合酶的DNA和编码不影响L-赖氨酸反馈抑制的天冬氨酸激酶的DNA通过导入转化细胞。
(10)按照(1)的细菌，其中天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶的活性提高，而且所述细菌具有L-苏氨酸生产能力。
(11)按照(1)-(10)任一项的细菌，其中所述嗜甲基菌属细菌是甲基营养型嗜甲基菌。
(12)一种生产L-氨基酸的方法，它包括用培养基培养以上(1)-(11)任一项定义的嗜甲基菌属细菌，在培养物中产生并积累L-氨基酸以及从所述培养物收集L-氨基酸。
(13)按照(12)的方法，其中所述培养基包含用作主要碳源的甲醇。
(14)一种生产L-氨基酸含量增高的嗜甲基菌属细菌的细菌细胞的方法，包括用培养基培养以上(1)-(11)任一项定义的嗜甲基菌属细菌，以在所述细菌的细菌细胞中产生并累积L-氨基酸。
(15)按照(14)的生产嗜甲基菌属细菌的细菌细胞的方法，其中所述L-氨基酸是L-赖氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸或L-苏氨酸。
(16)一种编码以下(A)或(B)定义的蛋白的DNA(A)具有SEQ ID NO6氨基酸序列的蛋白，或
(B)具有包含一个或多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位的SEQ ID NO6氨基酸序列的蛋白，而且具有天冬氨酸激酶活性的蛋白。
(17)按照(16)的DNA，它为以下(a)或(b)定义的DNA(a)具有包含SEQ ID NO5第510-1736号核苷酸的核苷酸序列的核苷酸序列的DNA；或(b)可与具有SEQ ID NO5第510-1736号核苷酸的核苷酸序列或其部分的探针在严格条件下杂交，而且编码具有天冬氨酸激酶活性的蛋白的DNA。
(18)编码以下(C)或(D)定义的蛋白的DNA(C)具有SEQ ID NO8氨基酸序列的蛋白，或(D)具有包含一个或多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位的SEQ ID NO8氨基酸序列，而且具有天冬氨酸半醛脱氢酶活性的蛋白。
(19)按照(18)的DNA，它为以下(c)或(d)定义的DNA(c)具有包含SEQ ID NO7第98-1207号核苷酸的核苷酸序列的核苷酸序列的DNA；或(d)可与具有SEQ ID NO7第98-1207号核苷酸的核苷酸序列或其部分的探针在严格条件下杂交，而且编码具有天冬氨酸半醛脱氢酶活性的蛋白的DNA。
(20)编码以下(E)或(F)定义的蛋白的DNA(E)具有SEQ ID NO10氨基酸序列的蛋白，或(F)具有包含一个或多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位的SEQ ID NO10氨基酸序列，而且具有二氢吡啶二羧酸盐合酶活性的蛋白。
(21)按照(20)的DNA，它为以下(e)或(f)定义的DNA(e)具有包含SEQ ID NO9第1268-2155号核苷酸的核苷酸序列的核苷酸序列的DNA；或
(f)可与具有SEQ ID NO9第1268-2155号核苷酸的核苷酸序列或其部分的探针在严格条件下杂交，而且编码具有二氢吡啶二羧酸盐合酶活性的蛋白的DNA。
(22)编码以下(G)或(H)定义的蛋白的DNA(G)具有SEQ ID NO12氨基酸序列的蛋白，或(H)具有包含一个或多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位的SEQ ID NO12氨基酸序列，而且具有二氢吡啶二羧酸盐还原酶活性的蛋白。
(23)按照(22)的DNA，它为以下(g)或(h)定义的DNA(g)具有包含SEQ ID NO11第2080-2883号核苷酸的核苷酸序列的核苷酸序列的DNA；或(h)可与具有SEQ ID NO11第2080-2883号核苷酸的核苷酸序列或其部分的探针在严格条件下杂交，而且编码具有二氢吡啶二羧酸盐还原酶活性的蛋白的DNA。
(24)编码以下(I)或(J)定义的蛋白的DNA(I)具有SEQ ID NO14氨基酸序列的蛋白，或(J)具有包含一个或多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位的SEQ ID NO14氨基酸序列，而且具有二氨基庚二酸盐脱羧酶活性的蛋白。
(25)按照(24)的DNA，它为以下(i)或(j)定义的DNA(i)具有包含SEQ ID NO13第751-1995号核苷酸的核苷酸序列的核苷酸序列的DNA；或(j)可与具有SEQ ID NO13第751-1995号核苷酸的核苷酸序列或其部分的探针在严格条件下杂交，而且编码具有二氨基庚二酸盐脱羧酶活性的蛋白的DNA。
在此说明书中，“L-氨基酸生产能力”是指在培养基中积累显著量L-氨基酸或当用所述培养基培养本发明微生物时微生物细胞中氨基酸含量提高的能力。
附图简述
图1图示具有突变的dapA的质粒RSF24P的产生过程。“dapA*24”是指编码突变DDPS的突变dapA，其中118-组氨酸残基被酪氨酸残基取代。
图2图示具有突变的dapA和突变的lysC的质粒RSFD80的产生过程。“lysC*80”是指编码其中352-苏氨酸残基被异亮氨酸残基取代的突变AKIII的突变lysC。
图3图示含有ask基因的大肠杆菌转化体菌株的天冬氨酸激酶活性。
图4图示含有asd基因的大肠杆菌转化体菌株的天冬氨酸半醛脱氢酶活性。
图5图示含有dapA基因的大肠杆菌转化体菌株的二氢吡啶二羧酸盐合酶活性。
图6图示含有dapB基因的大肠杆菌转化体菌株的二氢吡啶二羧酸盐还原酶活性。
图7图示含有lysA基因的大肠杆菌转化体菌株的二氨基庚二酸盐脱羧酶活性。
实施本发明的最佳方式<1>本发明的微生物本发明的微生物是属于嗜甲基菌属而且具有L-氨基酸生产能力的细菌。本发明的嗜甲基菌属细菌包括例如食甲基嗜甲基菌(Methylophilus methylotrophus)AS1菌株(NCIMB10515)等。食甲基嗜甲基菌AS1菌株(NCIMB10515)可得自National Collections of Industrialand Marine Bacteria(地址NCIMB Lts.，Torry Research Station 135，Abbey Road，Aberdeen AB9 8DG，United Kingdom)。
按照本发明生产的L-氨基酸包括L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸等。可生产一种或多种这样的氨基酸。
赋予嗜甲基菌属细菌野生型菌株L-氨基酸生产能力则可获得具有L-氨基酸生产能力的嗜甲基菌属细菌。为了获得L-氨基酸生产能力，可使用常规用于培育棒状杆菌(coryneform)、埃希氏菌属细菌等的方法，例如获得营养缺陷型突变菌株、L-氨基酸类似物抗性菌株或代谢控制突变菌株的方法，以及可使用用于产生L-氨基酸生物合成酶活性增强的重组菌株的方法(参阅“氨基酸发酵”，the Japan ScientificSocieties Press[Gakkai Shuppan Center]，第一版，1986年5月30日公布，第77-100页)。培育氨基酸生产菌时，可赋予1种或同时赋予2种或更多种特性，例如辅源营养、L-氨基酸类似物抗性和代谢控制突变。一种或同时2种或更多种L-氨基酸生物合成酶活性增强。而且，可在增强L-氨基酸生物合成酶活性的同时具有所述特性，例如辅源营养、L-氨基酸类似物抗性和代谢控制突变。
例如，L-赖氨酸生产菌可培育为L-高丝氨酸或L-苏氨酸和L-蛋氨酸辅源营养的突变体(日本专利公布(Kokoku)号48-28078/1973和56-6499/1981)、肌醇或醋酸辅源营养的突变体(日本专利申请公开(Kokai)号55-9784/1980和56-8692/1981)或氧代赖氨酸、异羟肟酸赖氨酸、S-(2-氨基乙基)-半胱氨酸、γ-甲基赖氨酸、α-氯己内酰胺、DL-α-氨基-ε-己内酰胺、α-氨基-月桂酰内酰胺、天冬氨酸类似物、磺胺类药物、醌型或N-月桂酰亮氨酸抗性突变体。
此外，L-谷氨酸生产菌可培育为油酸等辅源营养突变体。L-苏氨酸生产菌可培育为α-氨基-β-羟基缬氨酸抗性突变体。L-高丝氨酸生产菌可培育为L-苏氨酸辅源营养突变体或L-苯丙氨酸类似物抗性突变体。L-苯丙氨酸生产菌可培育为L-酪氨酸辅源营养突变体。L-异亮氨酸生产菌可培育为L-亮氨酸辅源营养突变体。L-脯氨酸生产菌可培育为L-异亮氨酸辅源营养突变体。
而且，如下文实施例所述，可以获得为酪蛋白氨基酸辅源营养菌株的生产一种或多种支链氨基酸(L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸)的菌株。
为了获得嗜甲基菌属细菌突变体，本发明者首次采用链霉素抗性菌株出现频率作为指标详细检测了最佳突变条件。结果当突变后存活率约0.5％时获得最大出现频率的链霉素抗性菌株，成功在此条件下获得营养缺陷型菌株。他们还相对于以前对大肠杆菌等进行筛选而言，大规模筛选突变体，成功获得营养缺陷型菌株，曾经认为这是困难的。
如上所述，因为已知在合适条件下通过诱变嗜甲基菌属细菌可获得突变体，所以根据突变方法，适当设定诱变后存活率约0.5％的条件可容易地获得所需要的突变体。
用嗜甲基菌属细菌获得突变体的诱变方法包括UV辐射和用用于常规诱变处理的诱变剂处理，例如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)和亚硝酸。通过选择嗜甲基菌属细菌的天然突变体也可以获得具有L-氨基酸生产能力的嗜甲基菌属细菌。
如下可获得L-氨基酸类似物抗性突变体例如，使诱变的嗜甲基菌属细菌接种到含不同浓度L-氨基酸类似物的琼脂培养基中，选择形成菌落的菌株。
如下可获得营养缺陷型突变体使嗜甲基菌属细菌在含目标营养素(例如L-氨基酸)的琼脂培养基中形成菌落，将所述菌落复制到不合所述营养素的琼脂培养基中，选择不能在不含所述营养素的琼脂培养基中生长的菌株。
以下例举通过增强L-氨基酸生物合成酶活性赋予或增强L-氨基酸生产能力的方法。[L-赖氨酸]例如通过增强二氢吡啶二羧酸盐合酶活性和/或天冬氨酸激酶活性可获得L-赖氨酸生产能力。
可如下增强嗜甲基菌属细菌的二氢吡啶二羧酸盐合酶活性和/或天冬氨酸激酶活性使编码二氢吡啶二羧酸盐合酶的基因片段和/或编码天冬氨酸激酶的基因片段与一种在嗜甲基菌属细菌中具有功能的载体、优选多拷贝型载体连接，获得重组DNA，然后将其导入嗜甲基菌属细菌宿主，以转化所述宿主。由于编码二氢吡啶二羧酸盐合酶的基因和/或编码天冬氨酸激酶的基因在转化体菌株细胞中的拷贝数增加，所以其活性增强。此后也分别以缩写DDPS、AK和AKIII表示二氢吡啶二羧酸盐合酶、天冬氨酸激酶和天冬氨酸激酶III。
关于提供编码DDPS的基因和编码AK的基因的微生物，可使用任何微生物，前提是它们含有在嗜甲基菌属细菌微生物中能够表达DDPS活性和AK活性的基因。这样的微生物可以是野生型菌株或其突变菌株。具体来说，这样的微生物实例包括大肠杆菌K-12菌株、食甲基嗜甲基菌AS1菌株(NCIMB10515)等。由于从埃希氏菌属细菌获得的DDPS编码基因(dapA，Richaud，F.等，J.Bacteriol.，297，(1986))和AKIII编码基因(lysC，Cassan，M.，Parsot，C.，Cohen，G.N.和Patte，J.C.，J.Biol.Chem.，261，1052(1986))的核苷酸序列均已经知道，所以可用根据这些基因的核苷酸序列合成的引物和用诸如大肠杆菌K-12等的微生物的染色体DNA作为模板通过PCR获得这些基因。作为具体实例，以下说明衍生自大肠杆菌的dapA和lysC。但是，用于本发明的基因不限于它们。
最好是用于本发明的DDPS和AK不受L-赖氨酸的反馈抑制影响。已知得自大肠杆菌的野生型DDPS受L-赖氨酸的反馈抑制，而得自大肠杆菌的野生型AKIII受L-赖氨酸的抑制和反馈抑制。因此，导入嗜甲基菌属细菌的dapA和lysC最好编码具有对L-赖氨酸的反馈抑制不敏感的突变的DDPS和AKIII。此后，具有对L-赖氨酸反馈抑制不敏感的突变的DDPS也称为“突变DDPS”，而编码突变DDPS的DNA也称为“突变dapA”。具有对L-赖氨酸的反馈抑制不敏感的突变的得自大肠杆菌的AKIII也称为“突变AKIII”，而编码突变AKIII的DNA也称为“突变lysC”。
按照本发明，DDPS和AK不一定需要是突变DDPS和AK。已知例如原产于棒状杆菌属细菌的DDPS不受L-赖氨酸的反馈抑制影响。
产生自大肠杆菌的野生型dapA的核苷酸序列的范例为SEQ IDNO1。所述核苷酸序列编码的野生型DDPS的氨基酸序列的范例为SEQ ID NO2。得自大肠杆菌的野生型lysC的核苷酸序列的范例为SEQ ID NO3。所述核苷酸序列编码的野生型ATIII的氨基酸序列的范例为SEQ ID NO4。
编码不受L-赖氨酸反馈抑制的突变DDPS的DNA包括编码具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的DDPS的DNA，其中所述氨基酸序列中的118-组氨酸残基被酪氨酸残基取代。编码不受L-赖氨酸反馈抑制的突变AKIII的DNA包括编码具有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的AKIII的DNA，其中所述氨基酸序列中的352-苏氨酸残基被异亮氨酸残基取代。
用于基因克隆的质粒可以是任何质粒，前提是它可在诸如埃希氏菌属细菌等的微生物中复制，具体包括pBR322、pTWV228、pMW119、pUC19等。
在嗜甲基菌属细菌中有功能的载体例如为可在嗜甲基菌属细菌中自主复制的质粒。具体来说，可以是已提及的广谱宿主载体RSF1010及其衍生物，例如pAYC32(Chistorerdov，A.Y.，Tsygankov，Y.D.Plasmid，16，161-167，(1986))、pMFY42(Gene，44，53，(1990))、pRP301、pTB70(Nature，287，396，(1980))等。
为了使dapA和lysC连接到在嗜甲基菌属细菌中有功能的载体而制备重组DNA，用对应于含dapA和lysC的DNA片段末端的限制酶消化载体。常常采用诸如T4 DNA连接酶的连接酶进行连接。dapA和lysC可以各自加入相应的载体中或者加入一个载体中。
关于含编码突变DDPS的突变dapA和编码突变AKIII的突变lysC的质粒，已知广谱宿主质粒RSFD80(WO95/16042)。用该质粒转化的大肠杆菌JM109菌株称为AJ12396，并于1993年10月28日保藏于日本国际贸易部工业科技局的国立生命科学和人体技术研究所(National Institute of Bioscience and Human-Technology，Agency ofIndustrial Science and Technology，Ministry of International Trade andIndustry)(postal code 305-8566，1-3 Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，保藏号为FERM P-13936，于1994年11月1日根据布达佩斯条约规定将其转移到国际保藏单位，保藏号为FERM BP-4859。可用已知方法由AJ12396菌株获得RSFD80。
RSFD80包含的突变dapA具有SEQ ID NO1的野生型dapA核苷酸序列，其中第597号核苷C被T取代。由其编码的突变DDPS具有SEQ ID NO2的氨基酸序列，其中118-组氨酸残基被酪氨酸残基取代。RSFD80包含的突变lysC具有SEQ ID NO3的野生型lysC核苷酸序列，其中第1638号核苷C被T取代。由其编码的突变AKIII具有SEQ ID NO4的氨基酸序列，其中352-苏氨酸残基被异亮氨酸残基取代。
为了将如上所述制备的重组DNA导入嗜甲基菌属细菌，可使用任何方法，只要所使用的方法可获得足够的转化率。例如可使用电穿孔(Canadian Journal of Microbiology，43，197(1997))。
在嗜甲基菌属细菌染色体DNA上存在多拷贝dapA和/或lysC也可以增强DDPS活性和/或AK活性。为了在嗜甲基菌属细菌的染色体DNA中导入多拷贝dapA和/或lysC，可采用在嗜甲基菌属细菌染色体DNA上存在的多拷贝序列作为靶进行同源重组。作为染色体DNA上存在的多拷贝序列，也可以使用重复DNA、存在于转座因子末端的反向重复序列等。另一方面，按照日本专利申请公开(Kokai)号2-109985/1990所公开的方法，通过将多拷贝的dapA和/或lysC置于转移它们的转座子上，可将其导入染色体DNA中。在所述两种方法中，因为转化菌株中的dapA和/或lysC的拷贝数增加，所以应该提高DDPS活性和AK活性。
除了上述的增加基因的方法之外，用更强的表达控制序列代替原有的诸如dapA和/或lysC启动子的控制序列，也可以提高DDPS活性和/或AK活性(日本专利申请公开(Kokai)号1-215280/1989)。已知的这样的强启动子有例如lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、λ嗜菌体的PR启动子和PL启动子、tet启动子、amyE启动子、spac启动子等。取代这些启动子可增强表达dapA和/或lysC，因此可提高DDPS活性和AK活性。可同时增强表达控制序列和增加dapA和/或lysC的拷贝数。
为了通过连接基因片段和载体制备重组DNA，用对应于所述基因片段末端的限制酶消化载体。通常用诸如T4 DNA连接酶的连接酶进行连接。关于DNA的消化方法和连接等、制备染色体DNA、PCR、制备质粒DNA、转化、设计用作引物的寡核苷酸等，可使用本领域技术人员周知的常规方法。这样的方法介绍于Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，和Maniatis，T.，“Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版”，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1989)等。
除了增强DDPS活性和/或AK活性之外，也可以增强参与L-赖氨酸生物合成的另一种酶活性。这样的酶包括二氨基庚二酸途径酶，例如二氢吡啶二羧酸还原酶、二氨基庚二酸脱羧酶、二氨基庚二酸脱氢酶(关于所有前述酶参见WO96/40934)、磷酸烯醇丙酮酸羧酶(日本专利申请公开(Kokai)号60-87788/1985)、天冬氨酸氨基转移酶(日本专利公布(Kokoku)号6-102028/1994)、二氨基庚二酸差向异构酶、天冬氨酸半醛脱氢酶等，或者氨基己二酸途径酶，例如高乌头酸水合酶等。最好是天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸还原酶和二氨基庚二酸脱羧酶中至少一种酶的活性提高。
下文介绍从食甲基嗜甲基菌获得的天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸合酶、二氢吡啶二羧酸还原酶和二氨基庚二酸脱羧酶。
此外，可降低本发明微生物催化从L-赖氨酸生物合成途径分支产生L-赖氨酸以外的化合物的反应的酶活性，或者可使这样的酶缺陷。催化从L-赖氨酸生物合成途径分支产生L-赖氨酸以外的化合物的反应的酶包括高丝氨酸脱氢酶(参见WO95/23864)。
前述增强参与L-赖氨酸生物合成的酶的活性的技术可同样用于下文的其它氨基酸。[L-谷氨酸]可赋予嗜甲基菌属细菌L-谷氨酸生产能力，其方法例如导入编码以下任何一种酶的DNA谷氨酸脱氢酶(日本专利申请公开(Kokai)61-268185/1986)、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合酶、异柠檬酸脱氢酶(日本专利申请公开(Kokai)号62-166890/1987和63-214189/1988)、乌头酸水合酶(日本专利申请公开(Kokai)号62-294086/1987)、柠檬酸合酶(日本专利申请公开(Kokai)号62-201585/1987和63-119688/1988)、磷酸烯醇丙酮酸羧酶(日本专利申请公开(Kokai)号60-87788/1985和62-55089/1987)、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、烯醇化酶、磷酸甘油酸变位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、二磷酸果糖醛缩酶、磷酸果糖激酶(日本专利申请公开(Kokai)号63-102692/1988)、磷酸葡萄糖异构酶、谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶(WO99/07853)等。
此外，可降低本发明微生物催化从L-谷氨酸生物合成途径分支产生L-谷氨酸以外的化合物的反应的酶活性，或者可使这样的酶缺陷。催化从L-谷氨酸生物合成途径分支产生L-谷氨酸以外的化合物的反应的酶包括α-酮戊二酸脱氢酶(αKGDH)、异柠檬酸裂合酶、磷酸乙酰转移酶、醋酸激酶、醋羟酸合酶、醋乳酸合酶、甲酸乙酰转移酶、乳酸脱氢酶、谷氨酸脱羧酶、1-吡咯啉脱氢酶等。[L-苏氨酸]例如通过增强天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶的活性可赋予或增强L-苏氨酸生产能力。例如用包含苏氨酸操纵子的重组质粒转化嗜甲基菌属细菌，可增强这些酶的活性门本专利申请公开(Kokai)号55-131397/1980、59-31691/1984和56-15696/1981以及日本专利申请公开(Kohyo)号3-501682/1991)。
如下也可以赋予或增强L-苏氨酸生产能力，其方法是增强或导入具有以下基因的苏氨酸操纵子编码对L-苏氨酸的反馈抑制不敏感的天冬氨酸激酶的基因(日本专利公布(Kokoku)号1-29559/1989)、编码高丝氨酸脱氢酶的基因(日本专利申请公开(Kokai)号60-012995/1985)或编码高丝氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶的基因(日本专利申请公开(Kokai)号61-195695/1986)。
此外，导入编码突变磷酸烯醇丙酮酸羧酶的DNA也可以提高L-苏氨酸生产能力，所述突变磷酸烯醇丙酮酸羧酶具有使其对天冬氨酸的反馈抑制不敏感的突变。[L-缬氨酸]例如通过在嗜甲基菌属细菌中导入其控制机制基本脱敏的L-缬氨酸生物合成基因，可赋予L-缬氨酸生产能力。还可以导入基本上对嗜甲基菌属微生物携带的L-缬氨酸生物合成基因的控制机制不敏感的突变。
L-缬氨酸生物合成基因的实例包括例如大肠杆菌的ilvGMEDA操纵子。ilvA基因编码的苏氨酸脱氨酶催化使L-苏氨酸转化为2-酮基丁酸的脱氨反应，它是L-异亮氨酸生物合成的限速步骤。因此，为了有效进行L-缬氨酸合成反应，最好是使用不表达苏氨酸脱氨酶活性的操纵子。不表达这样的苏氨酸脱氨酶活性的ilvGMEDA操纵子的实例包括其中消除苏氨酸脱氨酶活性的突变导入ilvA、或ilvA被破坏的ilvGMEDA操纵子，以及其中缺失ilvA的ilvGMED操纵子。
因为ilvGMEDA操纵子受L-缬氨酸和/或L-异亮氨酸和/或L-亮氨酸操纵子表达控制的影响(减弱作用)，所以最好去除或突变所述减弱作用需要的区段，使其对L-缬氨酸表达的抑制作用不敏感。
通过对野生型ilvGMEDA操纵子进行突变处理或利用基因重组技术的方法对其进行改良，可获得不表达苏氨酸脱氨酸活性而且如上所述使其对减弱作用不敏感的ilvGMEDA操纵子(参见WO96/06926)。[L-亮氨酸]例如，除了生产L-缬氨酸需要的上述特性之外，在嗜甲基菌属细菌微生物中导入基本上不受控制机制影响的L-亮氨酸生物合成基因，可赋予或增强L-亮氨酸生产能力。也可以导入基本消除L-亮氨酸生物合成基因在嗜甲基菌属细菌微生物中的控制机制的突变。这样的基因实例包括，例如提供基本消除L-亮氨酸抑制作用的酶的leuA基因。[L-异亮氨酸]例如通过导入thrABC操纵子和ilvGMEDA操纵子可赋予L-异亮氨酸生产能力，其中thrABC操纵子含有编码基本对L-苏氨酸抑制作用不敏感、得自大肠杆菌的天冬氨酸激酶I/高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因，而ilvGMEDA操纵子含有编码基本对L-异亮氨酸抑制作用不敏感的苏氨酸脱氨酶的ilvA基因而且去除了其减弱作用需要的区段(日本专利申请公开(Kokai)号8-47397/1996)。[其它氨基酸]通过增强嗜甲基菌属细菌的磷酸烯醇丙酮酸盐生产能力可增强L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-苏氨酸和L-异亮氨酸的生物合成(WO97/08333)。
通过增强或导入脱敏分支酸变位酶-预苯酸脱水酶(CM-PDT)基因(日本专利申请公开(Kokai)号5-236947/1993和62-130693/1987)和脱敏3-脱氧-D-阿拉伯糖庚酮糖酸(arabinoheptulonate)-7-磷酸合酶(DS)基因(日本专利申请公开(Kokai)号5-236947/1993和61-124375/1986)，可改善L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的生产能力。
通过增强或导入含编码脱敏邻氨基苯甲酸合酶的基因色氨酸操纵子，可改善L-色氨酸生产能力(日本专利申请公开(Kokai)号57-71397/1982、62-244382/1987和美国专利号4,371,614)。
在本说明书中，表述“增强酶活性”通常是指所述酶的细胞内活性高于野生型菌株，而且当利用基因重组技术等修饰而获得的所述酶活性增强的菌株时，所述酶的细胞内活性高于修饰前的所述菌株。表述“降低酶活性”通常是指所述酶的细胞内活性低于野生型菌株，而且当利用基因重组技术等修饰而获得的所述酶活性降低的菌株时，所述酶的细胞内活性低于修饰前的所述菌株。
如下可生产L-氨基酸在培养基中培养具有如上所述获得的L-氨基酸生产能力的嗜甲基菌属细菌，以在培养基中产生并累积L-氨基酸，以及从所述培养物收集所述L-氨基酸。
通过在培养基中培养具有L-氨基酸生产能力的嗜甲基菌属细菌，以在所述细菌细胞中产生并累积L-氨基酸，从而可产生与嗜甲基菌属细菌野生型菌株相比，L-氨基酸含量提高的嗜甲基菌属细菌细胞。
采用常规用于培养具有甲醇同化特性的微生物的方法培养用于本发明的微生物。用于本发明的培养基可以是可以是天然或合成培养基，只要它含有碳源、氮源、无机离子和其它需要的微量有机成分。
采用甲醇作为主要碳源，可以低成本制备L-氨基酸。当甲醇用作主要碳源时，常常在培养基中加入0.001-30％量的甲醇。在培养基中加入硫酸铵等用作氮源。除了这些成分之外，通常还要加入少量微量成分，例如磷酸钾、磷酸钠、硫酸镁、硫酸亚铁和硫酸锰。
常常在pH 5-9和20-45℃温度下，例如通过振摇或搅拌通气获得的有氧条件下进行培养，而且通常在24-120小时内完成培养。
常规可联合使用诸如离子交换树脂、沉淀等的已知方法从培养物中收集L-氨基酸。
此外，可用分离微生物细胞的常规方法使嗜甲基菌属细菌细胞与培养基分离。<2>本发明的基因本发明的DNA为编码以下一种得自食甲基嗜甲基菌的酶的基因天冬氨酸激酶(此后也简写为“AK”)、天冬氨酸半醛脱氢酶(此后也简写为“ASD”)、二氢吡啶二羧酸合酶(此后也简写为“DDPS”)、二氢吡啶二羧酸还原酶(此后也简写为“DDPR”)和二氨基庚二酸脱羧酶(此后也简写为“DPDC”)。
本发明的DNA可如下获得例如用食甲基嗜甲基菌基因文库转化AK、ASD、DDPS、DDPR或DPDC缺陷型微生物突变菌株，以及选择恢复辅源营养的克隆。
例如可如下制备食甲基嗜甲基菌基因文库。首先，利用Saito等的方法(Saito，H.和Miura，K.，Biochem.Biophys.Acta 72，619-629，(1963))等从食甲基嗜甲基菌野生菌株如食甲基嗜甲基菌AS1菌株(NCIMB10515)制备总染色体DNA，用合适的限制酶例如Sau3AI或AluI部分消化，获得各种片段的混合物。通过调节消化反应时间等可控制消化程度，可使用各种各样的限制酶。
然后，使消化的染色体DNA片段与可在大肠杆菌细胞中自主复制的载体DNA连接，获得重组DNA。具体来说，用产生与用于消化染色体DNA的限制酶产生的末端核苷酸序列相同的限制酶作用于载体DNA，使其完全消化并切割所述载体。然后混合染色体DNA片段混合物和消化并切割的载体DNA，使连接酶、优选T4 DNA连接酶作用于所述混合物，获得重组DNA。
如下可获得基因文库溶液利用所获得的重组DNA转化大肠杆菌，例如大肠杆菌JM109菌株等，以及用转化体的液体培养物制备重组DNA。可应用D.M.Morrison的方法(Methods in Enzymology 68，326(1979))、用氯化钙处理接受细胞以便提高DNA渗透性的方法(Mandel，M.和Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))等进行所述转化。在下文提及的实施例中使用电穿孔。
上述载体的实例有所述及的pUC19、pUC18、pUC118、pUC119、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218、pSTV28、pSTV29等。也可以使用嗜菌体载体。因为例如pUC118和pUC119含有氨苄青霉素抗性基因，而pSTV28和pSTV29含有氯霉素抗性基因，因此使用含有氨苄青霉素或氯霉素的培养基，则只有带有载体或重组DNA的转化体才能够生长。
关于培养转化体以及从细菌细胞收集重组DNA的方法，可提及碱性SDS法等。
用如上所述获得的食甲基嗜甲基菌基因文库溶液转化AK、ASD、DDPS、DDPR或DPDC缺陷型突变微生物菌株，以及选择恢复辅源营养的克隆。
AK缺陷型突变微生物菌株的实例包括编码AK的三种基因(thrA、metLM、lysC)缺陷的大肠杆菌GT3。ASD缺陷型突变微生物菌株的实例包括大肠杆菌Hfr3000 U482(CGSC 5081菌株)。DDPS缺陷型突变微生物菌株的实例包括大肠杆菌AT997(CGSC 4547菌株)。DDPR缺陷型突变微生物菌株的实例包括大肠杆菌AT999(CGSC 4549菌株)。DPDC缺陷型突变微生物菌株的实例包括大肠杆菌AT2453(CGSC 4505菌株)。这些突变菌株可得自大肠杆菌遗传保藏中心(the Yale University，Department of Biology，Osborn Meorial Labs.，P.O.Box 6666，New Haven 06511-7444，Connecticut，U.S.)。
尽管所有上述突变菌株不能在M9基本培养基中生长，但是含有编码AK、ASD、DDPS、DDPR或DPDC的基因的转化体菌株可在M9基本培养基中生长，因为这些基因在转化体中发挥作用。所以，通过选择能够在所述基本培养基中生长的转化体菌株，并从所述菌株收集重组DNA，就可获得含编码各种酶的基因的DNA片段。大肠杆菌AT999(CGSC 4549菌株)即使在完全培养基例如L培养基中，当其中不加入二氨基庚二酸时，其生长速率极其缓慢。但是，可观测到其含有编码得自食甲基嗜甲基菌的DDPR的基因的转化体菌株因为所述基因起作用而正常生长。因此，通过选择在L培养基中正常生长的转化体菌株也可以获得含编码DDPR基因的转化体菌株。
从所获得的重组DNA提取插入DNA片段并测定其核苷酸序列，可确定每种酶的氨基酸序列及其编码基因的核苷酸序列。
编码本发明AK的基因(此后也称为“ask”)编码具有序列表所示SEQ ID NO6的氨基酸序列的AK。关于ask基因的具体实例，可提及具有SEQ ID NO5核苷酸组成的核苷酸序列的DNA。本发明的ask基因可以具有这样的序列各氨基酸的对应密码子可被等同密码子取代，只要它编码与SEQ ID NO6氨基酸序列相同的氨基酸序列。
编码本发明ASD的基因(此后也称为“asd”)编码具有序列表所示SEQ ID NO8氨基酸序列的ASD。关于asd基因的具体实例，可提及含有SEQ ID NO7的第98-1207号核苷酸组成的核苷酸序列的DNA。本发明的asd基因可以具有这样的序列各氨基酸的对应密码子可被等同密码子取代，只要它编码与SEQ ID NO8氨基酸序列相同的氨基酸序列。
编码本发明DDPS的基因(此后也称为“dapA”)编码具有序列表所示SEQ ID NO10氨基酸序列的DDPS。关于dapA基因的具体实例，可提及具有SEQ ID NO9的第1268-2155号核苷酸组成的核苷酸序列的DNA。本发明的dapA基因可以具有这样的序列各氨基酸的对应密码子可被等同密码子取代，只要它编码与SEQ ID NO10氨基酸序列相同的氨基酸序列。
编码本发明DDPR的基因(此后也称为“dapB”)编码具有序列表所示SEQ ID NO12氨基酸序列的DDPR。关于dapB基因的具体实例，可提及具有SEQ ID NO11的第2080-2883号核苷酸组成的核苷酸序列的DNA。本发明的dapB基因可以具有这样的序列各氨基酸的对应密码子可被等同密码子取代，只要它编码与SEQ ID NO12氨基酸序列相同的氨基酸序列。
编码本发明DPDC的基因(此后也称为“lysA”)编码具有序列表所示SEQ ID NO14氨基酸序列的DPDC。关于lysA基因的具体实例，可提及具有SEQ ID NO13的第751-1995号核苷酸组成的核苷酸序列的DNA。本发明的lysA基因可以具有这样的序列各氨基酸的对应密码子可被等同密码子取代，只要它编码与SEQ ID NO14氨基酸序列相同的氨基酸序列。
本发明的各酶基因可具有对应于SEQ ID NO6、8、10、12或14各氨基酸序列的氨基酸序列，其中包括一个或数个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位，而且编码具有AK、ASD、DDPS、DDPR或DPDC活性的蛋白。本文使用的表述“一个或数个”优选为1-10个、更优选1-5个、更优选1-2个。
编码与AK、ASD、DDPS、DDPR或DPDC基本相同的蛋白的DNA，例如上述DNA，它们可如下获得例如通过定点诱变修饰各核苷酸序列，使得所述氨基酸序列在特定位点包含一个或多个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位。利用常规诱变处理也可以获得上述修饰DNA。诱变处理的实例包括用羟胺等体外处理编码AK、ASD、DDPS、DDPR或DPDC的DNA，利用UV辐射或用于常规诱变处理的诱变剂(如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)和亚硝酸)处理含编码AK、ASD、DDPS、DDPR或DPDC的基因的诸如埃希氏菌属细菌的微生物。
上述核苷酸的取代、缺失、插入、添加或倒位包括天然突变(突变或变异)，例如根据含AK、ASD、DDPS、DDPR或DPDC等的微生物种间差异或菌株间差异观测到的突变。
如下可获得编码与AK、ASD、DDPS、DDPR或DPDC基本相同的蛋白的DNA使具有如上所述突变的DNA在合适的细胞中表达，以及检测表达产物的AK、ASD、DDPS、DDPR或DPDC活性。采用以下方法也可以获得编码与AK、ASD、DDPS、DDPR或DPDC基本相同的蛋白的DNA从编码AK、ASD、DDPS、DDPR或DPDC的突变DNA或含其中一种DNA的细胞中分离可与探针在严格条件下杂交而且编码具有AK、ASD、DDPS、DDPR或DPDC活性的蛋白的DNA，其中所述探针含有一种选自以下的核苷酸序列包含SEQ ID NO5第510-1736号核苷酸的核苷酸序列、包含SEO IDNO7第98-1207号核苷酸的核苷酸序列、包含SEQ ID NO9第1268-2155号核苷酸的核苷酸序列、包含SEQ ID NO11第2080-2883号核苷酸的核苷酸序列或包含SEQ ID NO13第751-1995号核苷酸的核苷酸序列、或这些核苷酸序列的一部分。在本发明说明书中，具有核苷酸序列或其部分是指具有所述核苷酸序列或其部分或其互补核苷酸。
本文使用的术语“严格条件”是指允许形成所谓的特异性杂交体而不允许形成非特异性杂交体的条件。该条件可随所述探针的核苷酸序列和长度而不同。但是，它可以为例如允许高度同源DNA例如具有40％或更高同源性的DNA杂交，而不允许以上定义同源性以下的DNA杂交的条件，或者为在常规DNA杂交洗涤条件60℃温度以及相当于1×SSC和0.1％SDS、优选0.1×SSC和0.1％SDS的盐浓度下允许杂交的条件。
各基因的部分序列也可以用作探针。可以采用根据各基因的核苷酸序列制备的寡核苷酸作为引物以及含各基因的DNA片段作为模板经PCR(多聚酶链式反应)制得这样的探针。当具有约300bp长度的DNA片段用作探针时，杂交的洗涤条件可以为例如50℃，2×SSC和0.1％SDS。
可在如上所述的条件下杂交的基因还包括在其序列中存在中止密码子的基因以及编码因为活性中心突变而不再具有活性的酶的基因。但是这样的基因容易通过将其与市售活性表达载体连接以及检测AK、ASD、DDPS、DDPR或DPDC活性而去除。
因为本发明揭示了得自食甲基嗜甲基菌的编码AK、ASD、DDPS、DDPR和DPDC的基因的核苷酸序列，所以可通过采用根据所述序列制备的寡核苷酸探针进行杂交，从食甲基嗜甲基菌基因文库获得编码AK、ASD、DDPS、DDPR和DPDC的DNA序列。此外，编码这些酶的DNA序列也可以采用根据上述核苷酸序列制备的寡核苷酸引物通过PCR从食甲基嗜甲基菌染色体DNA扩增获得。
可适当利用上述基因增强嗜甲基菌属细菌生产L-赖氨酸的能力。实施例参照下文的以下实施例进一步具体解释本发明。
除非另有说明，否则所用试剂均得自Wako Pure Chemicals或Nakarai Tesque。各实施例所用培养基成分如下。所有培养基用氢氧化钠或盐酸调节pH。(L培养基)细菌用胰蛋白胨(DIFCO) 10g/L酵母提取物(DIFCO) 5g/L氯化钠5g/L[于120℃蒸汽灭菌20分钟](L琼脂培养基)L培养基细菌培养用琼脂(DIFCO) 15g/L[于120℃蒸汽灭菌20分钟](SOC培养基)细菌用胰蛋白胨(DIFCO) 20g/L酵母提取物(DIFCO) 5g/L10mM氯化钠2.5mM氯化钾10mM硫酸镁10mM氯化镁20mM葡萄糖[除了镁溶液和葡萄糖之外其他各组分蒸汽灭菌(120℃，20分钟)，然后加入通过0.22μm滤膜除菌的2M镁贮藏液(1M硫酸镁、1M氯化镁)和2M葡萄糖溶液，再使所述混合物通过0.22μm滤膜除菌](121M1培养基)K2HPO41.2g/LKH2PO40.62g/LNaCl 0.1g/L(NH4)2SO40.5g/LMgSO4·7H2O0.2g/LCaCl2·6H2O0.05g/LFeCl3·6H2O1.0mg/LH3BO310μg/LCuSO4·5H2O5μg/LMnSO4·5H2O10μg/LZnSO4·7H2O70μg/LNaMoO4·2H2O 10μg/LCoCl2·6H2O5μg/L1％(v/v)甲醇，pH 7.0[除了甲醇之外，其他所有成分均于121℃蒸汽灭菌15分钟。在所述成分充分冷却后，加入甲醇。](121生产培养基成分)甲醇 2％磷酸氢二钾 0.12％磷酸钾 0.062％氯化钙六水合物 0.005％硫酸镁七水合物 0.02％氯化钠 0.01％氯化铁六水合物 1.0mg/L硫酸铵 0.3％硫酸铜五水合物 5μg/L硫酸锰五水合物 10μg/L钼酸钠二水合物 10μg/L硼酸 10μg/L硫酸锌七水合物 70μg/L氯化钴六水合物 5μg/L碳酸钙(Kanto Kagaku) 3％(pH7.0)(121M1琼脂培养基)121M1培养基细菌培养用琼脂(DIFCO)15g/L[除了甲醇之外，其他所有成分均于121℃蒸汽灭菌15分钟。在所述成分充分冷却后，加入甲醇。](M9基本培养基)Na2HPO4·12H2O 16g/LKH2PO43g/LNaCl0.5g/LNH4Cl 1g/LMgSO4·7H2O 246.48mg/L葡萄糖 2g/LpH7.0[分别灭菌(120℃，20分钟)并加入硫酸镁和葡萄糖。根据需要加入适量氨基酸和维生素。](M9基本琼脂培养基)M9基本培养基细菌培养用琼脂(DIFCO)15g/L实施例1制备L-赖氨酸生产菌(1)(1)在嗜甲基菌属细菌中导入突变lysC和突变dapA采用包含突变lysC和突变dapA的已知质粒RSFD80(参见WO95/16042)将所述基因导入嗜甲基菌属细菌。RSFD80是得自广泛宿主谱的载体质粒pAYC32(Chistorerdov，A.Y.，Tsygankov，Y.D.，Plasmid，16，161-167，(1986))的质粒pVIC40(国际公布WO90/04636，日本专利申请公开(Kohyo)号3-501682/1991)，质粒pAYC32是RSF1010的衍生物，其中从大肠杆菌获得的突变dapA和突变lysC以该顺序位于pVIC40四环素抗性基因的启动子(tetP)下游，使所述基因的转录方向相对于tetP是常规方向。突变dapA编码118-组氨酸残基被酪氨酸残基取代的突变DDPS。突变lysC编码352-苏氨酸残基被异亮氨酸残基取代的突变AKIII。
如下构建RSFD80。如
图1所示，使质粒pdapAS24上的突变dapA在四环素抗性基因启动子的下游部位连接到pVIC40，获得RSF24P。然后如图2所示，用RSF24P和含有突变lysC的pLLC*80制备具有突变dapA和突变lysC的质粒RSFD80。也就是说，尽管pVIC40含有一个苏氨酸操纵子，但是在RSFD80中该苏氨酸操纵子被含突变dapA的DNA片段和含突变lysC的DNA片段取代。
用KSFD80质粒转化的大肠杆菌JM109菌株称为AJ12396，而且于1993年10月28日保存于日本国际贸易部工业科技局的国立生命科学和人体技术研究所(National Institute of Bioscience and Human-Technology，Agency of Industrial Science and Technology，Ministry ofInternational Trade and Industry)(postal code 305-8566，1-3 Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，保藏号为FERM P-13936，根据布达佩斯条约规定于1994年11月1日转移到国际保藏单位，保藏号为FERMBP-4859。
在30ml含有20mg/L链霉素的LB培养基中于30℃培养大肠杆菌AJ1239菌株12小时，用Wizard+Midipreps DNA纯化系统(Promega销售)从所获得的细胞中纯化RSFD80质粒。
通过电穿孔将如上所述制备的RSFD80质粒导入食甲基嗜甲基菌AS1菌株(NCIMB10515)(Canadian Journal of Microbiology，43，197(1997))。关于对照，使用于制备RSFD80质粒的pVIC40质粒中的编码苏氨酸操纵子的DNA区缺失，从而制备只含有所述载体区的pRS质粒(参见日本专利申请公开(Kohyo)号3-501682/1991)，以用于RSFD80的相同方法将pRS质粒导入AS1菌株。(2)含有得自大肠杆菌的突变lysC和突变dapA的嗜甲基菌属细菌的AKIII活性用含有RSFD80质粒的食甲基嗜甲基菌AS1菌株(下文也称为“AS1/RSFD80”)和含有pRS质粒的食甲基嗜甲基菌AS1菌株(下文也称为“AS1/pRS”)制备无细胞提取物，并检测AK活性。如下制备无细胞提取物(粗酶溶液)。将AS1/RSFD80菌株和AS1/pRS菌株分别接种到含有20mg/L链霉素的上述成分的121生产培养基中，于37℃振摇培养34小时，然后去除碳酸钙以及收获细胞。
在0℃条件下用0.2％KCl洗涤如上所述获得的细菌细胞，将其悬浮在含10mM硫酸镁、0.8M硫酸铵和0.03Mβ-巯基乙醇的20mM磷酸钾缓冲液(pH7)中，超声破坏(0℃，200W，10分钟)细菌细胞。超声细胞悬浮液于0℃下以33,000rpm离心30分钟，分离上清液。向上清液中加入硫酸铵至80％饱和，混合物于0℃放置1小时，离心。沉淀物用含10mM硫酸镁、0.8M硫酸铵和0.03Mβ-巯基乙醇的20mM磷酸钾缓冲液(pH7)溶解。
按照Stadtman方法(Stadtman，E.R.，Cohen，G.N.，LeBras，G.和Robichon-Szulmajster，H.，J.Biol.Chem.，236，2033(1961)，测量AK活性。也就是说，使具有下列成分的反应溶液于30℃温育45分钟，加入氯化铁溶液(2.8N盐酸0.4ml、12％TCA0.4ml、5％氯化铁六水合物/0.1N盐酸0.7ml)显色。离心反应溶液，检测上清液在540nm的吸光度。活性以1分钟产生的异羟肟酸量表示(1U＝1μM/min)。摩尔消光系数设定为600。不含天冬氨酸钾的反应溶液用作空白管。检测酶活性时，在所述酶反应溶液中加入不同浓度L-赖氨酸，检测L-赖氨酸的抑制程度。结果见表1。(反应溶液组成)反应混合物*10.3ml羟胺溶液*20.2ml0.1M天冬氨酸钾(pH7.0) 0.2ml酶溶液 0.1ml水(平衡用) 总计1ml*11M Tris-HCl(pH8.1)9ml，0.3M硫酸镁0.5ml和0.2M ATP(pH7.0)5ml*2临用前用氢氧化钾中和的8M羟胺溶液表1
*1nM/分钟/mg蛋白*2存在5mM L-赖氨酸的活性保留率如表1所示，导入RSFD80质粒使AK活性增加约1.7倍。此外，还证实RSFD80质粒编码的大肠杆菌产生的AK对L-赖氨酸的抑制作用完全脱敏。而且，发现单独的L-赖氨酸不能抑制AS1菌株本身具有的AK活性。本发明的发明人发现，当在反应溶液存在L-赖氨酸和L-苏氨酸各2 mM时，AS1菌株的AK被100％抑制(协同抑制)。(3)用由大肠杆菌获得的含有突变lysC和dapA的嗜甲基菌属细菌生产L-赖氨酸然后将AS1/RSFD80菌株和AS1/pRS菌株接种到含20mg/L链霉素的121生产培养基，于37℃振摇培养34小时。完成培养后，离心去除细菌细胞和碳酸钙，用氨基酸分析仪(JASCO Corporation[NihonBunko]，高效液相层析)检测培养物上清液中的L-赖氨酸浓度。结果见表2。
表2
实施例2制备L-赖氨酸生产菌(2)(1)在广宿主谱的载体中导入tac启动子区为了生产大量参与食甲基嗜甲基菌L-赖氨酸(Lys)生物合成的酶，使用tac启动子用于基因表达所述目的酶。tac启动子常常用于大肠杆菌。
采用pKK233-3的DNA(Pharmacia)作为模板，具有SEQ ID NO15和16的核苷酸序列的DNA片段作为引物以及耐热DNA聚合酶，通过PCR扩增获得tac启动子区。进行PCR，1个PCR循环为94℃20秒，60℃30秒和72℃60秒，重复30个循环。然后收集所扩增的DNA片段，并用EcoRI和PstI限制酶处理。另一方面，用相同限制酶消化广宿主谱的载体pRS(参见日本专利申请公开(Kohyo)号3-501682/1991)，将含tac启动子区的上述DNA片段导入限制酶消化末端构建pRS-tac。(2)制备dapA基因(二氢吡啶二羧酸盐合酶基因)表达质粒pRS-dapA24和LysC基因(天冬氨酸激酶基因)表达质粒pRS-lysC80将编码部分脱敏Lys对其酶活性的反馈抑制的二氢吡啶二羧酸盐合酶的突变基因(dapA*24)导入质粒pRS-tac，其中pRS-tac用上述(1)所述方法制得。
首先，采用RSFD80的DNA(参见实施例1)作为模板，具有SEQID NO17和18的核苷酸序列的DNA片段作为引物，通过PCR扩增获得dapA*24基因区。进行PCR，1个PCR循环为94℃20秒，60℃30秒和72℃90秒，重复30个循环。然后用Sse8387I和XbaI限制酶处理所述片段，制备具有相应切割末端的dapA*24基因片段。另一方面，用上述相同方法以Sse8387I处理以及以XbaI部分消化pRS-tac。用T4连接酶使上述dapA*24基因片段与此消化质粒连接，获得pRS-dapA24。
同样，采用RSFD80的DNA作为模板，具有SEQ ID NO19和20的核苷酸序列的DNA片段作为引物，通过PCR获得编码部分脱敏LyS对其酶活性的反馈抑制的天冬氨酸激酶的基因(lysC*80)。进行PCR，1个PCR循环为94℃20秒，60℃30秒和72℃90秒，重复30个循环。然后用Sse8387I和SapI限制酶处理所获得的DNA片段。另一方面，用Sse8387I和SapI限制酶处理载体pRS-tac。用T4连接酶使上述lysC*80基因片段与此消化质粒连接，获得pRS-lysC80。(3)在食甲基嗜甲基菌中导入pRS-dapA24或pRS-lysC80并评价培养物分别通过电穿孔将如上所述获得pRS-dapA24和pRS-lysC80导入食甲基嗜甲基菌AS1菌株(NCIMB10515)，获得AS1/pRS-dapA24和AS1/pRS-lysC80。将各菌株接种到含20mg/L链霉素的121生产培养基中，于37℃振摇培养48小时。关于对照菌株，也以相同方法培养带有pRS的AS1菌株。完成培养后，离心去除细菌细胞和碳酸钙，用氨基酸分析仪(JASCO Corporation[Nihon Bunko]，高效液相层析)检测培养物上清液中的L-赖氨酸浓度。结果见表3。
表3
实施例3制备L-赖氨酸生产菌(3)将食甲基嗜甲基菌AS1菌株(NCIMB10515)接种到121M1培养基中，并于37℃培养15小时。以NTG用常规方法(NTG浓度100mg/L，37℃，5分钟)处理获得的细菌细胞，将其涂布在含7g/L S-(2-氨乙基)-半胱氨酸(AEC)和3g/LL-苏氨酸的121M1琼脂培养基上。于37℃培养细菌细胞2-8天，挑出形成的菌落，以获得AEC抗性菌株。
将上述AEC抗性菌株接种到121生产培养基，于37℃在有氧条件下培养38小时。完成培养后，离心从培养基中去除细菌细胞和碳酸钙，用氨基酸分析仪(JASCO Corporation[Nihon Bunko]，高效液相层析)检测培养物上清液中的L-赖氨酸浓度。选择相对于原菌株L-赖氨酸生产能力提高的菌株，并将其命名为食甲基嗜甲基菌AR-166菌株。原菌株和AR-166菌株的L-赖氨酸生产量见表4。
表4
食甲基嗜甲基菌AR-166菌株个人命名为AJ13608，于1999年6月10日将其保存于日本国际贸易部工业科技局的国立生命科学和人体技术研究所(Naional Institute of Bioscience and Human-Technology，Agency of Industrial Science and Technology，Ministry of InternationalTrade and Industry)(postal code 305-8566，1-3 Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，保藏号为FERM P-17416，根据布达佩斯条约规定于2000年3月31日转移到国际保藏单位，保藏号为FERM BP-7112。实施例4制备L-苏氨酸生产菌(1)在嗜甲基菌属细菌中导入苏氨酸操纵子质粒通过电穿孔将含从大肠杆菌获得的苏氨酸操纵子的质粒pVIC40(国际公布WO90/04636，日本专利中请公开(Kohyo)号3-501682/1991)导入食甲基嗜甲基菌AS1菌株(NCIMB10515)(CanadianJournal of Microbiology，43，197(1997))以获得AS1/pVIC40菌株。关于对照，使pVIC40质粒缺失编码苏氨酸操纵子的DNA区，从而获得只含有所述载体区的pRS(日本专利申请公开(Kohyo)号3-501682/1991)，以用于pVIC40的相同方法将其导入AS1菌株，获得AS1/pRS菌株。(2)用含有从大肠杆菌获得的苏氨酸操纵子嗜甲基菌属细菌生产L-苏氨酸分别将AS1/pVIC40和AS1/pRS菌株接种到含20mg/L链霉素、1g/L L-缬氨酸和1g/L L-亮氨酸的121生产培养基中，于37℃振摇培养50小时。完成培养后，离心去除细菌细胞和碳酸钙，用氨基酸分析仪(JASCO Corporation[Nihon Bunko]，高效液相层析)检测培养物上清液中的L-苏氨酸浓度。结果见表5。
表5
实施例5制备支链氨基酸生产菌将食甲基嗜甲基菌AS1菌株(NCIMB10515)接种到121M1培养基中，并于37℃培养15小时。以NTG用常规方法(NTG浓度100mg/L，37℃，5分钟)处理获得的细菌细胞，将其涂布在含0.5％酪蛋白氨基酸(DIFCO)的121M1琼脂培养基上。于37℃培养细菌细胞2-8天，使其形成菌落。挑出所形成的菌落接种到121M1琼脂培养基和含0.5％酪蛋白氨基酸的121M1琼脂培养基上。与前一种培养基相比，选择在后一种培养基上生长得更好的菌株作为酪蛋白氨基酸营养缺陷型菌株。用此方法从NTG-处理的500个菌株中获得9个渗漏(leaky)酪蛋白氨基酸营养缺陷型菌株。从这些酪蛋白氨基酸营养缺陷型菌株获得一个相对于其原菌株在培养基中累积更多L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸的菌株。该菌株命名为食甲基嗜甲基菌C138菌株。
食甲基嗜甲基菌C-138菌株个人命名为AJ13609，于1999年6月10日将其保存于日本国际贸易部工业科技局的国立生命科学和人体技术研究所(National Institute of Bioscience and Human-Technology，Agency of Industrial Science and Technology，Ministry of InternationalTrade and Industry)(postal code 305-8566，1-3 Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，保藏号为FERM P-17417，根据布达佩斯条约规定于2000年3月31日转移到国际保藏单位，保藏号为FERM BP-7113。
将原菌株(AS1菌株)和C138菌株接种到121生产培养基中，于37℃在有氧条件下培养34小时。完成培养后，离心去除培养物中的细菌细胞和碳酸钙，用氨基酸分析仪(JASCO Corporation[Nihon Bunko]，高效液相层析)检测培养物上清液中的L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸浓度。结果见表6。
表6
实施例6制备食甲基嗜甲基菌AS1菌株的染色体DNA文库(1)制备食甲基嗜甲基菌AS1菌株的染色体DNA用铂环将食甲基嗜甲基菌AS1菌株(NCIMB10515)接种到试管中的5ml 121M1培养基中，于37℃振摇培养过夜。以1％量将所获得的培养细菌液接种到500ml体积的Sakaguchi培养瓶中的50ml 121M1培养基中，于37℃振摇培养过夜。然后离心收获细胞，使细胞悬浮于50ml TEN溶液(含50mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM EDTA和20mM氯化钠(pH8.0)的溶液)。离心收获细胞，再次将其悬浮于5ml含5mg/ml溶菌酶和10μg/ml RNA酶的TEN溶液。使悬浮液于37℃放置30分钟，然后加入蛋白酶K和十二烷基硫酸钠至终浓度分别为10μg/ml和0.5％(wt/vol)。
将所述悬浮液于70℃放置2小时，然后加入并混合等量饱和酚溶液(用10mM Tris-HCl(pH8.0)饱和的酚溶液)。离心悬浮液，收集上清液。加入并混合等量酚/氯仿溶液(酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1)，离心混合物。收集上清液，加入等量氯仿溶液(氯仿∶异戊醇＝24∶1)，重复相同提取步骤。在上清液中加入1/10体积3 M醋酸钠(pH4.8)和2.5倍体积乙醇沉淀染色体DNA。离心收集沉淀物，用70％乙醇洗涤，减压干燥，以及用适量TE溶液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA(pH8.0))溶解。(2)制备基因文库使50μl上述(1)获得的部分染色体DNA(1μg/μl)、20μl H缓冲液(500 mM Tris-HCl、100mM氯化镁、10mM二硫苏糖醇、1000mM氯化钠(pH7.5))以及8单位限制酶Sau3AI(Takara Shuzo)在总体积200μl中于37℃反应10分钟，然后加入并混合200μl酚/氯仿溶液，以中止反应。离心反应混合物，收集上层溶液，在0.8％琼脂糖凝胶上进行分离。用ConcertTM快速凝胶提取系统(DNA收集试剂盒，GIBCO BRLCo.)收集相对于2-5kb碱基对(此后简写为“kbp”)的DNA。用这种方法获得50μl分级大小(fractionated size)DNA溶液。
另一方面，使2.5μg质粒pUC118(Takara Shuzo)、2μlK缓冲液(200mM Tris-HCl、100mM氯化镁、10mM二硫苏糖醇、1000mM氯化钾(pH8.5))和10单位限制酶BamHI(Takara Shuzo)在总体积20μl中于37℃反应2小时，然后加入并混合20单位牛小肠碱性磷酸酶(Takara Shuzo)，使所述混合物再反应30分钟。使反应混合物与等量酚/氯仿溶液混合，离心混合物。收集上清液，加入等量氯仿溶液重复相似的提取步骤。在上清液中加入1/10体积3 M醋酸钠(pH4.8)和2.5倍体积乙醇沉淀DNA。离心收集DNA，用70％乙醇洗涤，减压干燥，以及用适量TE溶液溶解DNA。
用2型连接试剂盒(Takara Shuzo)连接如上所述制备的染色体DNA的Sau3AI消化产物和pUC118的BamHI消化产物。在反应混合物中加入1/10体积3M醋酸钠(pH4.8)和2.5倍体积乙醇沉淀DNA。离心收集DNA，用70％乙醇洗涤，减压干燥，以及用适量TE溶液(连接酶溶液A)溶解DNA。
用上述步骤的相同方法，连接(连接酶溶液B)用限制酶AluI(Takara Shuzo)部分消化染色体DNA获得的片段和质粒pSTV29(Takara Shuzo)的SmaI消化产物。
用铂环将大肠杆菌JM109接种到试管中的5ml L培养基中，于37℃振摇培养过夜。以1％量将所获得的培养细菌液接种到500ml体积的Sakaguchi培养瓶中的50ml L培养基中，于37℃培养直到培养物OD660为0.5-0.6，在冰上冷却15分钟。然后于4℃离心收获细胞。使细胞悬浮于50ml冰冷的水中，离心洗涤细胞。重复该操作一次，使细胞悬浮于50ml冰冷的10％甘油溶液，离心洗涤细胞。把细胞悬浮在与细胞相同体积的10％甘油溶液中，分成50μl的等份。在50μl体积的细胞中加入1μl以上制备的连接酶溶液A或连接酶溶液B。然后将混合物装入BioRad电穿孔设备的特殊小杯(0.1cm宽，预冰冷)中。
所述设备设定为1.8kV和25μF，脉冲控制器的设定为200ohms。将所述小杯安装到所述设备上，对其施加脉冲。施用脉冲后，立即加入1ml冰冷的SOC培养基，将所述混合物转移到无菌试管中，于37℃振摇培养1小时。将各细菌细胞培养液体培养物涂布在含抗生素(当使用连接酶溶液A时为100μg/ml氨苄青霉素，或者当使用连接酶溶液B时为20μg/ml氯霉素)的L琼脂培养基上，于37℃培养过夜。刮取出现在各琼脂培养基上的菌落，接种到在500ml体积的Sakaguchi培养瓶中的50ml含相应抗生素的L培养基中，于37℃振摇培养2小时。用SDS碱法从各培养细菌液中提取质粒DNA，以分别形成基因文库溶液A和基因文库溶液B。实施例7克隆食甲基嗜甲基菌AS1菌株的赖氨酸生物合成基因(1)克隆编码天冬氨酸激酶(AK)的基因用基因文库溶液B通过上述相同的电穿孔方法转化编码AK的3种基因(thrA、metLM和lysC)缺陷的大肠杆菌GT3。在转化溶液中加入含20μg/ml二氨基庚二酸的SOC培养基，于37℃振摇培养。然后将培养的细菌液涂布在含20μg/ml二氨基庚二酸和20μg/ml氯霉素的L培养基上，以获得形成的菌落。将其作为母板复制到含20μg/ml氯霉素的M9琼脂培养基上，复制物于37℃培养2-3天。所述宿主不能在不含二氨基庚二酸的M9基本培养基中生长，因为它不具有AK活性。相反，预期含有得自食甲基嗜甲基菌的编码AK的基因的转化体菌株因为所述基因的作用而能够在M9基本培养基中生长。
约3000个转化体中有2个转化体在M9培养基上形成菌落。从在M9培养基上形成的菌落中提取质粒，并进行分析。结果证实在所述质粒上存在插入片段。这2种质粒分别命名为pMMASK-1和pMMASK-2。采用这2种质粒再次转化大肠杆菌GT3。所获得的转化体能够在M9基本培养基上生长。进而使含各所述质粒的转化体在含20μg/ml氯霉素的L培养基中培养过夜，离心培养细菌液收集细胞。通过超声细胞制备无细胞的提取物，按照Miyajima等的方法(Journal ofBiochemistry(Tokyo)，第63卷，139-148(1968))检测AK活性(图3pMMASK-1、pMMASK-2)。此外，同样在含20μg/ml二氨基庚二酸和20μg/ml氯霉素的L培养基中培养具有载体pSTV29的GT3菌株，以及检测AK活性(图3载体)。结果，与仅带有所述载体的转化体比较，在2个含插入片段的克隆中观测到AK活性提高。因此，证实能够克隆在pSTV29上的基因为得自食甲基嗜甲基菌的编码AK的基因。该基因称为ask。
通过双脱氧法测定ask基因的DNA核苷酸序列。发现pMMASK-1和pMMASK-2含有共同的片段。含得自食甲基嗜甲基菌的ask基因的DNA片段的核苷酸序列示于SEQ ID NO5。所述核苷酸序列可编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO5和6。(2)克隆编码天冬氨酸半醛脱氢酶(ASD)的基因采用如上所述的相同方法，使用基因文库溶液B通过电穿孔转化asd基因缺陷的大肠杆菌Hfr3000 U482(CGSC 5081菌株)。在转化溶液中加入含20μg/ml二氨基庚二酸的SOC培养基，使混合物于37℃振摇培养。离心收获细胞。通过将其悬浮在L培养基中以及离心悬浮液，从而洗涤细胞。再重复相同洗涤操作一次，将细胞悬浮在L培养基中。然后将悬浮液涂布在含20μg/ml氯霉素的L琼脂培养基上，于37℃培养过夜。宿主在不含二氨基庚二酸的L培养基中的生长极其缓慢，因为它缺乏asd基因。相反，因为所述基因的作用，所以预期即使在L培养基中，含有得自食甲基嗜甲基菌的编码ASD的基因的转化体菌株也可观测到正常生长。进而预期所述宿主大肠杆菌不能在M9基本培养基中生长，但是含有得自食甲基嗜甲基菌的编码ASD的基因的转化体菌株能够在M9基本培养基中生长，因为所述基因的作用。所以，挑取在L培养基上正常生长的转化体菌落，划痕并培养于M9培养基上。结果观察到了生长。因此证实编码ASD的基因在这些转化体菌株中具有预期的功能。
从在M9培养基上形成的3个转化体菌落提取质粒，而且证实所述质粒中存在插入片段。3种质粒分别命名为pMMASD-1、pMMASD-2和pMMASD-3。当再用这些质粒转化大肠杆菌Hfr3000U482时，各转化体可在M9基本培养基上生长。进而在含20μg/ml氯霉素的L培养基上培养各转化体过夜，离心培养的细菌液收集细胞。超声处理细胞制备粗酶溶液，按照Boy等人的方法(Journal ofBacteriology，Vol.112(1)，84-92(1972))检测ASD活性(图4pMMASD-1、pMMASD-2和pMMASD-3)。此外，同样在含20μg/ml二氨基二庚酸和20μg/ml氯霉素的L培养基中培养带有所述载体的宿主，与对照实验一样检测ASD活性(图4载体)。结果在仅带有所述载体的转化体不能检测到酶活性，而在具有插入片段的3个克隆中均能够检测到ASD活性。因此证实所获得的基因为得自食甲基嗜甲基菌的编码ASD的基因(称为asd)。
用双脱氧法测定asd基因的DNA核苷酸序列。发现全部3种所获得的克隆含有同样的片段。含有得自食甲基嗜甲基菌的asd基因的DNA片段的核苷酸序列示于SEQ ID NO7。所述核苷酸序列可编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO7和8。(3)克隆编码二氢吡啶二羧酸盐合酶(DDPS)的基因采用基因文库溶液A通过相同电穿孔步骤转化dapA基因缺陷型大肠杆菌AT997(CGSC 4547菌株)。在转化溶液中加入含20μg/ml二氨基二庚酸的SOC培养基，使混合物于37℃振摇培养。然后，将培养的细菌液涂布在含20μg/ml二氨基庚二酸和100μg/ml氨苄青霉素的L培养基上，以获得形成的菌落。将其作为母板复制到含100μg/ml氨苄青霉素的M9基本琼脂培养基上，复制物于37℃培养2-3天。所述宿主不能在不含二氨基庚二酸的M9基本培养基中生长，因为它是dapA基因缺陷型。相反，预期含有得自食甲基嗜甲基菌的编码DDPS的基因的转化体菌株因为所述基因的作用而能够在M9基本培养基中生长。
从在M9培养基上形成的2株菌落提取质粒，并进行分析。结果证实在所述质粒上存在插入片段。这2种质粒分别命名为pMMDAPA-1和pMMDAPA-2。采用这2种质粒再次转化大肠杆菌AT997时，各转化体均能够在M9基本培养基上生长。进而使含相应质粒的各转化体在含100μg/ml氨苄青霉素的L培养基中培养过夜，离心培养细菌液收集细胞。通过超声处理细胞制备细胞提取物，按照Yugari等人的方法(Journal of Biological Chemistry，第240卷，第4710页(1965))检测DDPS活性(图5pMMDAPA-1、pMMDAPA-2)。此外，同样在含20μg/ml二氨基庚二酸和100μg/ml氨苄青霉素的L培养基中培养具有所述载体的宿主细菌，以及检测作为对照实验的DDPS活性(图5载体)。结果，在仅带有所述载体的转化体中没能检测到所述酶活性，而在带有具有所述插入片段的质粒的各转化体中均可测到DDPS活性。因此，证实所获得的基因为得自食甲基嗜甲基菌的编码DDPS的基因(称为dapA)。
通过双脱氧法测定dapA基因的DNA核苷酸序列。发现所述插入片段的两种质粒含有共同的片段。含得自食甲基嗜甲基菌的dapA基因的DNA片段的核苷酸序列示于SEQ ID NO9。所述核苷酸序列可编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO9和10。(4)克隆编码二氢吡啶二羧酸盐还原酶(DDPR)的基因采用基因文库溶液A通过如上所述的相同电穿孔步骤转化dapB基因缺陷型大肠杆菌AT999 (CGSC 4549菌株)。在转化溶液中加入含20μg/ml二氨基二庚酸的SOC培养基，使混合物于37℃振摇培养。然后离心收获细胞。通过将其悬浮在L培养基中以及离心悬浮液，从而洗涤细胞。再重复相同洗涤操作一次，将细胞悬浮在L培养基中。再后，将细菌悬浮液涂布在含100μg/ml氨苄青霉素的L琼脂培养基上，于37℃培养过夜。宿主在不含二氨基庚二酸的L培养基中的生长极其缓慢，因为它缺乏dapB基因。相反，因为所述基因的作用，所以预期即使在L培养基中，在含有得自食甲基嗜甲基菌的编码DDPR基因的转化体菌株也可观测到正常生长。进而所述宿主大肠杆菌不能在M9基本培养基中生长，但是因为所述基因的作用，预期含有得自食甲基嗜甲基菌的编码DDPR的基因的转化体菌株能够在M9基本培养基中生长。
所以，将在L培养基上正常生长的转化体菌落划痕并培养于M9琼脂培养基上。之后在M9培养基上仍然观测到生长。因此证实编码DDPR的基因在转化体菌株中具有作用。从在M9培养基上形成的菌落提取质粒，结果证实在所述质粒上存在插入片段。采用质粒(pMMDAPB)再次转化大肠杆菌AT999时，转化体可在M9基本培养基上生长。进而使含所述质粒的转化体在L培养基中培养过夜，离心培养细菌液收集细胞。通过超声处理细胞制备细胞提取物，按照Tamir等人的方法(Journal of Biological Chemistry，第249卷，第3034页(1974))检测DDPR活性(图6pMMDAPB)。此外，同样在含20μg/ml二氨基庚二酸和100μg/ml氨苄青霉素的L培养基中培养具有所述载体的宿主细菌，以及检测作为对照实验的DDPR活性(图6载体)。结果，在仅带有所述载体的转化体中没能检测到DDPR活性，而在带有pMMDAPB的转化体上可测到DDPR活性。因此，证实所获得的基因为得自食甲基嗜甲基菌的编码DDPR的基因(称为dapB)。
通过双脱氧法测定dapB基因的DNA核苷酸序列。含得自食甲基嗜甲基菌的dapB基因的DNA片段的核苷酸序列示于SEQ ID NO11。所述核苷酸序列可编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO11和12。(5)克隆编码二氨基庚二酸盐脱羧酶(DPDC)的基因采用基因文库溶液A通过如上所述的相同电穿孔步骤转化lysA基因缺陷型大肠杆菌AT2453(CGSC 4505菌株)。在转化溶液中加入SOC培养基，使混合物于37℃振摇培养。然后离心收获细胞。通过将其悬浮在5ml灭菌水中以及离心悬浮液，从而洗涤细胞。再重复相同洗涤操作一次，将细胞悬浮在500μl灭菌水中。然后将细菌悬浮液涂布在含20μg/ml氯霉素的M9基本琼脂培养基上，于37℃培养2-3天。所述宿主在不含赖氨酸的M9基本培养基中不能生长，因为它缺乏lysA基因。相反，因为所述基因的作用，所以预期含有得自食甲基嗜甲基菌的编码DPDC基因的转化体菌株可在M9基本培养基中生长。
因此从在M9培养基上形成的3个转化体菌株提取质粒，并进行分析。结果证实在所述质粒上存在插入片段。这3种质粒分别命名为pMMLYSA-1、pMMLYSA-2和pMMLYSA-3。采用各质粒再次转化大肠杆菌AT2453时，各转化体均可在M9基本培养基上生长。进而使含相应质粒的各转化体在含20μg/ml氯霉素的L培养基中培养过夜，离心培养细菌液收集细胞。通过超声处理细胞制备细胞提取物，按照Cremer等人的方法(Journal of General Microbiology，第134卷，3221-3229(1988))检测DPDC活性(图7pMMLYSA-1、pMMLYSA-2、pMMLYSA-3)。此外，同样在含20μg/ml氯霉素的L培养基中培养具有所述载体的宿主细菌，以及检测作为对照实验的DPDC活性(图7载体)。结果，在仅带有所述载体的转化体中没能检测到DPDC活性，而在具有所述插入片段的3个克隆中均可测到DPDC活性。因此，证实所获得的基因为得自食甲基嗜甲基菌的编码DPDC的基因(称为lysA)。
通过双脱氧法测定lysA基因的DNA核苷酸序列。发现全部3个插入片段含有共同的DNA片段。含得自食甲基嗜甲基菌的lysA基因的DNA片段的核苷酸序列示于SEQ ID NO13。所述核苷酸序列可编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO13和14。
工业实用性按照本发明提供具有L-氨基酸生产能力的嗜甲基菌属细菌、采用所述嗜甲基菌属细菌生产L-氨基酸的方法以及L-氨基酸含量提高的嗜甲基菌属细菌细胞。采用本发明的方法可利用甲醇作为原料生产L-氨基酸。而且，本发明提供从嗜甲基菌属细菌获得的新型L-赖氨酸生物合成酶基因。
权利要求
1.一种具有L-氨基酸生产能力的嗜甲基菌属细菌(Methylophilusbacteria)。
2.按照权利要求1的嗜甲基菌属细菌，其中所述L-氨基酸是L-赖氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸或L-苏氨酸。
3.按照权利要求1的嗜甲基菌属细菌，它具有L-氨基酸类似物抗性或L-氨基酸辅源营养(auxotrophy)。
4.按照权利要求1的嗜甲基菌属细菌，其中L-氨基酸生物合成酶活性增强。
5.按照权利要求1的嗜甲基菌属细菌，其中二氢吡啶二羧酸盐合酶活性和天冬氨酸激酶活性增强，而且所述细菌具有L-赖氨酸生产能力。
6.按照权利要求1的嗜甲基菌属细菌，其中二氢吡啶二羧酸盐合酶活性增强，而且所述细菌具有L-赖氨酸生产能力。
7.按照权利要求1的嗜甲基菌属细菌，其中天冬氨酸激酶活性增强，而且所述细菌具有L-赖氨酸生产能力。
8.按照权利要求5-7任一项的嗜甲基菌属细菌，其中选自天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸盐还原酶和二氨基庚二酸盐脱羧酶中的1种、2种或3种酶的活性增强。
9.按照权利要求5的嗜甲基菌属细菌，其中通过将编码不受L-赖氨酸反馈抑制的二氢吡啶二羧酸盐合酶的DNA以及编码不受L-赖氨酸反馈抑制的天冬氨酸激酶的DNA导入细胞的转化作用而增强所述二氢吡啶二羧酸盐合酶活性和天冬氨酸激酶活性。
10.按照权利要求1的嗜甲基菌属细菌，其中天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶的活性增强，而且所述细菌具有L-苏氨酸生产能力。
11.按照权利要求1-10任一项的细菌，其中所述嗜甲基菌属细菌是食甲基嗜甲基菌。
12.一种生产L-氨基酸的方法，它包括在培养基中培养 1-11任一项定义的嗜甲基菌属细菌，以便在培养物中产生并累积L-氨基酸，以及从所述培养物中收集所述L-氨基酸。
13.按照权利要求12的方法，其中所述培养基含有用作主要碳源的甲醇。
14.一种产生L-氨基酸含量提高的嗜甲基菌属细菌的细菌细胞的方法，它包括在培养基中培养权利要求1-11任一项定义的嗜甲基菌属细菌，以便在所述细菌的细菌细胞中产生并累积L-氨基酸。
15.按照权利要求14的产生所述嗜甲基菌属细菌的细菌细胞的方法，其中所述L-氨基酸是L-赖氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸或L-苏氨酸。
16.一种编码以下(A)或(B)定义的蛋白的DNA(A)具有SEQ ID NO6的氨基酸序列的蛋白，或(B)具有包括一个或几个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位的SEQ ID NO6的氨基酸序列而且具有天冬氨酸激酶活性的蛋白。
17.按照权利要求16的DNA，它为以下(a)或(b)定义的DNA(a)具有包含SEQ ID NO5第510-1736号核苷酸的核苷酸序列的核苷酸序列的DNA；或(b)在严格条件下可与具有SEQ ID NO5第510-1736号核苷酸的核苷酸序列或其部分的探针杂交，而且编码具有天冬氨酸激酶活性的蛋白的DNA。
18.一种编码以下(C)或(D)定义的蛋白的DNA(C)具有SEQ ID NO8的氨基酸序列的蛋白，或(D)具有包括一个或几个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位的SEQ ID NO8的氨基酸序列而且具有天冬氨酸半醛脱氢酶活性的蛋白。
19.按照权利要求18的DNA，它为以下(c)或(d)定义的DNA(c)具有包含SEQ ID NO7第98-1207号核苷酸的核苷酸序列的核苷酸序列的DNA；或(d)在严格条件下可与具有SEQ ID NO7第98-1207号核苷酸的核苷酸序列或其部分的探针杂交，而且编码具有天冬氨酸半醛脱氢酶活性的蛋白的DNA。
20.一种编码以下(E)或(F)定义的蛋白的DNA(E)具有SEQ ID NO10的氨基酸序列的蛋白，或(F)具有包括一个或几个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位的SEQ ID NO10的氨基酸序列而且具有二氢吡啶二羧酸盐合酶活性的蛋白。
21.按照权利要求20的DNA，它为以下(e)或(f)定义的DNA(e)具有包含SEQ ID NO9第1268-2155号核苷酸的核苷酸序列的核苷酸序列的DNA；或(f)在严格条件下可与具有SEQ ID NO9第1268-2155号核苷酸的核苷酸序列或其部分的探针杂交，而且编码具有二氢吡啶二羧酸盐合酶活性的蛋白的DNA。
22.一种编码以下(G)或(H)定义的蛋白的DNA(G)具有SEQ ID NO12的氨基酸序列的蛋白，或(H)具有包括一个或几个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位的SEQ ID NO12的氨基酸序列而且具有二氢吡啶二羧酸盐还原酶活性的蛋白。
23.按照权利要求22的DNA，它为以下(g)或(h)定义的DNA(g)具有包含SEQ ID NO11第2080-2883号核苷酸的核苷酸序列的核苷酸序列的DNA；或(h)在严格条件下可与具有SEQ ID NO11第2080-2883号核苷酸的核苷酸序列或其部分的探针杂交，而且编码具有二氢吡啶二羧酸盐还原酶活性的蛋白的DNA。
24.一种编码以下(I)或(J)定义的蛋白的DNA(I)具有SEQ ID NO14的氨基酸序列的蛋白，或(J)具有包括一个或几个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位的SEQ ID NO14的氨基酸序列而且具有二氨基庚二酸盐脱羧酶活性的蛋白。
25.按照权利要求24的DNA，它为以下(i)或(i)定义的DNA(i)具有包含SEQ ID NO13第751-1995号核苷酸的核苷酸序列的核苷酸序列的DNA；或(j)在严格条件下可与具有SEQ ID NO13第751-1995号核苷酸的核苷酸序列或其部分的探针杂交，而且编码具有二氨基庚二酸盐脱羧酶活性的蛋白的DNA。
全文摘要
在含有用作主要碳源的甲醇的培养基中培养以下细菌从而生产L－氨基酸:属于嗜甲基菌属、能够利用甲醇作为主要碳源生长而且具有L－氨基酸生产能力的细菌(例如通过在嗜甲基菌属细菌细胞中导入编码不受L－赖氨酸反馈抑制的二氢吡啶二羧酸盐合酶的DNA以及另一种编码不受L－赖氨酸反馈抑制的天冬氨酸激酶的DNA而转化,并因此增强二氢吡啶二羧酸盐合酶活性和天冬氨酸激酶活性的嗜甲基菌属细菌)或属于嗜甲基菌属而且需要酪蛋白氨基酸的细菌。
文档编号C12N9/88GK1346402SQ00806019
公开日2002年4月24日 申请日期2000年4月7日 优先权日1999年4月9日
发明者郡司义哉, 安枝寿, 杉本慎一, 辻本信晴, 岛冈惠, 宫田由理, 大场麻奈美 申请人:味之素株式会社