专利名称：诊断试验的制作方法
技术领域：
本发明涉及疾病的检测方法，用于这种方法中的装置，和包含这种装置的试剂盒。
细菌性阴道病(BV)是一种最多数的阴道微小栖居动物(乳酸杆菌)被其它微生物，如Gardnerella vaginalis所压倒的病。BV与预产期前生产(PTL)有关。这种关联的机理是由于与BV有关的菌系获得进入子宫的机会，并引起促使分娩的炎性介质的释放。
人们先前已经想到在BV中，自身的细菌性感染引起PTL。通常用抗菌素治疗BV，例如预防PTL，但是这种治疗很少成功。此外，抗菌素可能除去非-病原菌，包括有益的菌株，如乳酸杆菌。
目前，BV的存在是根据临床检查和对疾病的细菌特性进行革兰氏染色来检测的。因为要花费几天时间才能够得到革兰氏染色的结果，因而患者不能在就诊的时候就被告知该结果。
在怀孕的过程中，阴道和子宫之间没有膜屏障来预防增长的细菌感染。然而，宫颈粘液塞可作为物理屏障预防子宫内感染。
粘液塞位于被称为粘蛋白的，富含碳水化合物的糖蛋白植入结构上。粘蛋白是由连接在中央蛋白质核心上的寡聚糖侧链组成的。唾液酸残基存在于碳水化合物侧链的末端。
与那些没有BV的相比，在有BV妇女的阴道分泌物中发现较高水平的细菌性唾液酸酶活性(MacGregor et al (1994)Am.J.Obstet.Gynaecol.170 1048-1060；Briselden et al (1992)J.Clin.，Microbiol.30 663-666)。
细菌性唾液酸酶是一种分解糖蛋白和糖脂的唾液酸残基的酶。唾液酸酶的活性可以使用各种天然和合成的唾液酸糖接合底物，通过比色法，荧光测定法和放射性技术来测定。以前用于唾液酸酶活性测定的底物包括牛下颌下腺粘蛋白和人类α-1酸糖蛋白(Eowe et al(1999)印刷中)；2’-(4-甲基umbelliferyl)-α-D-N-乙酰基神经氨酸(Paupermpoonsiri et al (1996) Clin.Inf.Dis.Vol.23 748-752；Brieselden et al(1992)supra)；4-硝基苯基-α-唾液酸和2-(3-甲氧苯基)-N-乙酰基-D-神经氨酸(MacGregor et al(1994)supra)。许多已知的唾液酸酶底物的敏感度均较低。
所述的唾液酸酶底物可用于各种测定中。例如，比色法或荧光测定法可以使用合成的底物，其检测底物的非-唾液酸部分(例如，4-甲基伞形酮或4-硝基苯酚)。可选择地，自唾液酸糖接合底物释放的唾液酸的量可以用HPLC或比色测定法来检测。且，有时也可以使用放射性测定法，其包含将放射性同位素示踪引入到唾液酸糖接合底物中，并通过液体闪烁计数检测所释放的唾液酸。
本发明人已经发现PTL和BV之间的关联是由于细菌性唾液酸酶的活性而不是自身的细菌感染。相信唾液酸酶的活性与粘液塞的降解有关，其导致进入上生殖道的细菌增加。
位于粘蛋白分子碳水化合物侧链末端的唾液酸的羧基提供造成糖侧链刚性的阴离子电荷。唾液酸的裂解破坏了引起粘液塞粘度损失的粘蛋白分子之间互相排斥的电荷。由于此作用使进入上生殖道的细菌增加有两个原因。首先，粘蛋白和粘液基质的组成在降解之后损失，作为屏障机制，粘液基质的机械性能和制菌性能变得不那么有效。第二，粘液层的分裂促进细菌粘附在下面的上皮上，其改变免疫识别应答，并降低由于阴道流体的移动而洗去细菌的可能性。
由此发现可知，唾液酸酶抑制剂对于治疗和预防疾病，如细菌性阴道病，和预防PTL的治疗可能是有效的。且唾液酸酶活性的测定对于疾病，如BV的检测是有效的。
本发明人已经提出了一种疾病，如BV的诊断试验，其检测唾液酸酶活性的存在。已经发现此试验的结果与使用常规革兰氏染色诊断的BV的发病率密切相关。该试验方法包括，自患者采集样品，并使样品与唾液酸酶的底物相接触。培养之后，如果检测到唾液酸酶的活性，则可以观察到可检测的变化，如颜色变化。在优选实施方案中，该试验是斑点试验，也就是说，将样品涂在唾液酸酶的底物上，该底物自身是用适当的固体介质，如滤纸支持的。
已经发现使用底物的试验在BV的检测中具有非常高的敏感度，其可能指示用于来源于BV菌系的唾液酸酶结合的最佳环境。用于本试验中的优选底物是5-溴-4-氯-3-吲哚基α-D-N-乙酰基神经氨酸的盐，特别是环己胺(X-α-NANA)，其可以自 Rose ScientificLtd.，Edmonton，Canada得到。
本发明检测唾液酸酶活性的试验方法是高度敏感的，运行快速且便宜，使用简单。该试验对于作为BV指示物的唾液酸酶活性的试验和预产期前生产可能性的预测是非常有效的。该测定可以在与患者的同一房间内，或在门诊部或GP手术室中进行，这是因为除了通常可得到的那些之外，本发明的方法不需要使用昂贵的设备或材料。例如，与常规的方法相比，不需要革兰氏染色试剂盒或光学显微镜。此外，本发明的方法比革兰氏染色的劳动强度要小。
且，唾液酸酶斑点试验比目前使用的比色法，荧光测定法或放射性试验更利于检测BV，这是因为唾液酸酶的活性不总是存在于BV或所有BV菌系中，其存在可能是一种指示物，即在某些病例中比在其它病例中对宿主更有害。
本发明的第一方面提供一种疾病的检测方法，其包含下列步骤(i)自人类受试者获得生物样品；(ii)将生物样品加样唾液酸酶的底物上，该底物已经固定在固体支持介质上了；并(iii)检测固定的唾液酸酶的变化。
本发明的第二方面是提供一种用于疾病检测中的装置，该装置包含固定在固体介质上的唾液酸酶-特异性的底物。
该装置可用于本发明第一方面的方法中，其包含下列步骤(ii)自人类受试者获得生物样品；(ii)将生物样品涂在该装置上；并(iii)检测固定的唾液酸酶底物有没有颜色的变化。
本发明的第三方面提供一种诊断疾病的试剂盒，其包含本发明第二方面的装置。
本发明第三方面的试剂盒还可以包含培养基，例如Tris/HCL缓冲液和/或获得样品的试剂。
优选将本发明第二方面的装置和本发明第三方面的试剂盒用于诊断生殖-泌尿道感染。更特别地，该疾病是细菌性阴道病。
唾液酸酶的底物是一种由唾液酸酶特异识别的底物。例如，该底物可以被唾液酸酶分解。优选的底物是唾液酸的糖苷。更优选的底物是5-溴-4-氯-3-吲哚基α-D-N-乙酰基神经氨酸或其盐，例如其环己胺盐。
固体介质可以是，例如，滤纸。
优选的哺乳动物受试者是怀孕的妇女或打算怀孕的妇女。
本发明的第四方面是提供一种检测样品中唾液酸酶活性的方法，该方法包含下列步骤；(a)使所述样品与试验试剂相接触，该试剂包含5-溴-4-氯-3-吲哚基α-D-N-乙酰基神经氨酸或其盐；并(b)检测试验试剂的变化。
该试验试剂可以包含，例如，固体，液体或凝胶状态的介质，其中将5-溴-4-氯-3-吲哚基α-D-N-乙酰基神经氨酸或其盐支持，涂覆，吸附或以别的方式包含在介质中或介质上。
5-溴-4-氯-3-吲哚基α-D-N-乙酰基神经氨酸优选是环己胺盐形式的。优选的，5-溴-4-氯-3-吲哚基α-D-N-乙酰基神经氨酸环己胺盐支持或吸附在固体底物，如滤纸上。这样，反应化合物可以固定在底物上，促进诊断试验的进行。这种反应化合物吸附在固体介质上的诊断试验通常被称为斑点-试验，因为诊断试验自身是通过在固体介质上“打点”样品(或样品的提取物)而进行的，其中，反应化合物吸附在该区域。
该样品可以直接从哺乳动物受试者，典型地从人类受试者获得，例如使用棉拭，或用适宜的缓冲液冲洗。在采集样品之后，可以将其上样在试验试剂上，或使其与试验试剂直接接触。可选择地，例如在样品是棉拭时，可以在液体介质，如tris缓冲液中提取样品的内容物，然后将其涂在试验试剂上。这可以使试验方法的应用更加便利。
该试验方法特别适于BV的检测，在优选实施方案中，该样品可作为阴道棉拭或样品，自女性人类患者采集。
在样品与试验试剂接触之后，观察试验试剂的任何变化。在试验试剂包含5-溴-4-氯-3-吲哚基α-D-N-乙酰基神经氨酸环己胺的情况下，该变化是颜色的变化，自无色至兰色。此变化可视觉观察到，或可以使用适当的设备，如棒状测试比色计或分光光度计来进行，其可用于量化结果。在可观察到颜色变化处，优选底物的背景部分的颜色不能遮掩或隐蔽反应化合物的颜色变化。还优选未反应的试验试剂是不在底物背景部分上显露的颜色。优选未反应的试剂是无色的。
本发明的第五方面提供一种用于本发明第四方面的试剂盒，其包含一种试验试剂，该试剂包含5-溴-4-氯-3-吲哚基α-D-N-乙酰基神经氨酸或其盐。
在本发明此实施方案中，优选该试验试剂是固体介质形式的装置，其中5-溴-4-氯-3-吲哚基α-D-N-乙酰基神经氨酸或其盐支持或吸附在其上。优选的试验试剂是浸润在5-溴-4-氯-3-吲哚基α-D-N-乙酰基神经氨酸环己胺溶液中的滤纸。优选滤纸浸润在大约1mg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚基α-D-N-乙酰基神经氨酸环己胺溶液中。然后可以直接使用该滤纸或干燥和贮存以备将来使用。因此，该试剂盒或者包含5-溴-4-氯-3-吲哚基α-D-N-乙酰基神经氨酸环己胺(例如溶液)和固体介质(例如滤纸)，这样使用者可以将底物涂在固体介质上，或该试剂盒可以包含固体介质，其中5-溴-4-氯-3-吲哚基α-D-N-乙酰基神经氨酸环己胺已经预先涂在其上，并干燥。
本发明此方面的试剂盒还可以包含温孵培养基，例如Tris/HCL缓冲液和/或得到样品的装置，且其可以与适当的说明一起包装在适宜的容器中使用。
用于本发明的试验试剂可以通过下列方法制备，其中使反应化合物与适宜的固体，液体或凝胶状态的介质相接触，这样反应化合物就包含在介质中或支持或吸附在介质上。例如，在试验试剂是固体装置时，可将反应化合物制备成适当的溶液，然后将其涂在固体介质上。
用于本发明第四和第五方面的试验试剂自身是本发明的一个方面。试剂的优选形式是固体装置，其中试验试剂被涂在固体底物的表面，形成局部小片(local patch)，在此处进行诊断试验。
本发明第四方面的方法，第五方面的试剂盒，和第六方面的装置可用于检测疾病，其特征在于细菌性唾液酸酶的异常活性(例如增加)。例如，该疾病可以是生殖-泌尿道感染。优选本发明第四方面的方法，第五方面的装置，和第六方面的试剂盒用于诊断细菌性阴道病。
优选哺乳动物受试者是怀孕的妇女或打算怀孕的妇女。
本发明的第七方面提供一种诊断人类受试者中PTL的方法，该方法包含在患者中或自患者采集的样品中测定细菌性唾液酸酶活性的步骤。
本发明的第八方面提供一种治疗BV或预防PTL的方法，该方法包含给予患者唾液酸酶抑制剂的步骤。
本发明的第九方面提供唾液酸酶抑制剂在制造治疗BV或预防PTL的治疗或预防组合物中的用途。
为了更好的理解本发明，并说明如何实现，将仅仅参考下列实施例来说明。
实施例用于BV诊断的平行的革兰氏染色和唾液酸酶斑点试验的测定100名参加 Milne Genito-Urinary Clinic，Bristol RoyalInfirmary的妇女，被试验用于BV检测的常规革兰氏染色和唾液酸酶的活性。在检查的时候取分离的棉拭，并将其立即放入缓冲液中，该缓冲液是由2ml 25mM的Tris/HCL/Tween 20(PH7.0)组成的。将棉拭于4℃冷藏直到临床试验结束。
称唾液酸底物，5-溴-4-氯-3-吲哚基-α-D-N-乙酰基神经氨酸环己胺盐，使其在25mM CaCl，150M Na醋酸盐和1M NaCl(PH5.5)的缓冲液中达到1mg/ml的浓度。混合均匀，然后将其吸移到10cm直径的滤纸上，直到滤纸较好地润湿。自Tris缓冲液中移出棉拭，并在用底物接种的滤纸上擦。将滤纸放在陪替氏培养皿中，盖上盖子，并在37℃培养该皿1小时。指示唾液酸酶活性的蓝点出现。如果没有唾液酸酶活性，则该纸甚至是干燥之前，保持2小时之后无色。
BV的革兰氏染色诊断是通过Spiegel’s标准(1980)评估的。由Hay et al(1992)定义的2级BV是一种有问题的种类，其与BV和“正常”阴道菌株的关系还需要进一步阐明。此种类不符合BV的定义，2级BV是否是具有正在逐步进行的BV微生物的建群指征还不清楚。在此研究中，因此，1级和2级联合用于统计分析，虽然革兰氏染色的初始评估分为1级(主要是乳酸杆菌表型)，2级(乳酸杆菌和与BV相关的生物混合)和3级(很少或没有乳酸杆菌，主要是有clue细胞存在的BV生物)。观察者不了解斑点试验的结果，斑点试验的观察者不了解革兰氏染色的结果。
结果BV的革兰氏染色结果与斑点试验的结果相关。将1级和2级的结果联合用于统计分析，不将2级视为是BV的决定性诊断，且其在此研究中的数量相对较少。
患者的年龄在16-52岁之间，平均年龄28.3岁，中位年龄26岁，众数年龄25岁。
唾液酸酶活性的阳性斑点试验与P＜.000001水平的革兰氏染色诊断的3级BV发病率密切相关，斑点试验在BV检测中的敏感度为93.5，特异性96.3。阳性预测值95.6，阴性预测值94.5。Amsells(1990)标准与p＝.04水平的斑点试验的结果密切相关，敏感度93.7，特异性70.5，阳性预测值57.6，阴性预测值96.2。
权利要求
1.一种疾病的检测方法，其包含下列步骤(i)自人类受试者获得生物样品；(ii)将生物样品涂在唾液酸酶的底物上，其中该底物已经被固定在固体支持介质上；并(iii)检测固定的唾液酸酶底物的变化。
2.根据权利要求1的方法，其中的疾病是细菌性阴道病。
3.根据权利要求1的方法，其中的底物是5-溴-4-氯-3-吲哚基α-D-N-乙酰基神经氨酸或其盐。
4.一种用于前述任一权利要求检测疾病的方法中的装置。
5.一种用于疾病诊断的试剂盒，其包含权利要求4的装置。
6.一种检测样品中唾液酸酶活性的方法，该方法包含下列步骤(a)使所述样品与试验试剂相接触，其中该试验试剂包含5-溴-4-氯-3-吲哚基α-D-N-乙酰基神经氨酸或其盐，并(b)检测试验试剂的变化。
7.根据权利要求6的方法，其中5-溴-4-氯-3-吲哚基α-D-N-乙酰基神经氨酸吸附在固体介质上。
8.根据权利要求6或7的方法，其中的方法用于检测细菌性阴道病。
全文摘要
本发明提供一种疾病的检测方法,其包含下列步骤:(i)自人类受试者获得生物样品;(ii)将生物样品涂在唾液酸酶的底物上,其中该底物已经被固定在固体支持介质上;并(iii)检测固定的唾液酸酶底物的变化。该底物优选5－溴－4－氯－3－吲哚基α－D－N－乙酰基神经氨酸或其盐。
文档编号C12Q1/00GK1351670SQ0080769
公开日2002年5月29日 申请日期2000年3月17日 优先权日1999年3月17日
发明者M·米拉, T·科菲尔德 申请人:布里斯托尔大学