专利名称：构建dna文库的方法和其上固定有dna文库的支持物的制作方法
技术领域：
本发明的工业领域涉及基因技术、蛋白质技术、细胞技术和免疫学技术等分子生物学技术和生物化学技术，具体地涉及通过利用微量DNA实验材料构建其上固定有脱氧核糖核酸(以下称“DNA”)的原始支持物的方法，构建其复制支持物的方法和固定有DNA片段的支持物。
而且，本发明的另一目的是提供其上固定有复制DNA片段的支持物。
在根据本发明构建cDNA文库的方法中，mRNA与固定在支持物上的cDNA文库解杂交(dehybridize)。该方法的特征在于通过利用该解杂交的mRNA固定相同的cDNA文库。
在根据本发明构建gDNA(基因组DNA)文库的方法中，该方法的特征在于将双链gDNA与支持物上具有限制性酶位点的寡核苷酸连接在一起。
在根据本发明构建单链gDNA文库的方法中，该方法的特征在于利用权利要求3所述的支持物上固定的gDNA的有义部分。
在根据本发明构建单链gDNA文库的方法中，该方法的特征在于使权利要求3所述gDNA文库的反义部分解杂交，并利用该反义部分通过合成在支持物上固定有义部分。
在权利要求1-5之一所述的根据本发明的任何方法中，其特征在于支持物预先经核苷酸或寡核苷酸进行化学修饰。
根据本发明的支持物的特征在于通过权利要求1-6之一所述的任何方法固定有DNA文库。
根据本发明的支持物的特征在于固定的是单链DNA文库。
图1显示了自动构建和复制cDNA文库支持物的装置的示意图。
图1所示用于构建DNA文库支持物的装置A含有用于向容器中输送反应溶液的送液器105、用于停止该反应溶液和输送新反应溶液的送液开关器220、用于在平面的前后左右方向和上下方向驱动用于注入/排出实验材料的喷管101的喷管驱动器100、用于加热/冷却前述容器中的反应溶液的溶液温度控制器30、用于容纳装有用来构建相应固定化DNA文库支持物的各实验材料和/或溶液的容器的实验材料容器支撑器20、和用于将该实验材料容器支撑器控制在预定温度的实验材料容器温度控制器40，等。优选地，鉴于将来与PCR装置和/或PCR产物分析装置的连接，容器支撑器10能够容纳96个或更多个实验材料容器。优选地，为了构建复制支持物，实验材料容器支撑器20含有至少4个实验材料容器插入孔。优选地，鉴于将来与PCR装置和/或PCR产物分析装置的连接，实验材料容器支撑器20上提供的容器插入孔数目为10个孔或更多个孔。优选地，鉴于溶液温度控制器30和实验材料容器温度控制器40的温度控制，容器支撑器10和实验材料容器支撑器20为具有良好导热性的铝块。
优选地，对于原始支持物和复制支持物，用于构建DNA文库支持物的支持物为平板形、球形、立方体形或粒状。尽管没有规定该支持物的材料，但优选该材料不与反应溶液发生反应，或不析出对DNA固定化反应有害的物质。例如，塑料、玻璃、硅氧烷和金属均是优选材料。优选平板形、球形、立方体形等。尤其是，优选由钻石或包含碳原子的钻石组成的支持物。(携带cDNA文库的原始支持物和其复制支持物的制备)我们将参照
图1和图3阐述其上固定有cDNA文库的原始支持物和其复制支持物的构建方法。首先，预备必要数量(T1～Tn)的经oligo(dT)n(n为15-30)化学修饰的3mm×3mm×0.1mm支持物。这些支持物仅采用oligo(dT)n进行化学修饰，在该支持物上还未固定有DNA文库。采用经oligo(dT)n化学修饰的支持物的原因是此经化学修饰的支持物容易与总RNA中的mRNA杂交。将这些支持物插入容器CB1-CBn中，然后将这些容器放置在容器支撑器10中。在此情况下，为了确保通过利用从小量实验材料获得的微量mRNA构建作为固定化cDNA文库的原始支持物和其复制支持物，优选将一个支持物插入第一容器中。关于其中插有化学修饰支持物的容器CB1-CBn在容器支撑器10中的放置顺序，将放有化学修饰支持物T1用于原始支持物的容器CB1插入第一插入部分HT1中。其中放有相应编号数的化学修饰支持物(T2-Tn)、用于复制支持物的必要数量容器(CB2-CBn)分别被顺序地插入第二插入孔HT2、...、第n个插入孔HTn中。(原始支持物的制备)将纯化的总RNA溶液201、RT酶溶液202和含有核苷酸(dT、dA、dG、dC)的反应溶液203装入控制在预定温度(即4℃)的实验材料容器支撑器20中。提供清洗/洗脱DNA用的Tris-乙二胺四乙酸(以下称“TE”)溶液204(含有Tris-乙二胺四乙酸的缓冲溶液)和废液缸210及其它物件。提供毛细管230作为液体输送通道，通过与送液开关器220连接用于液相输送相应溶液。优选地，毛细管230是用于液相层析的抗腐蚀不锈管。优选地，实验材料注入喷管101经送液器105和送液开关器220之间的连接途径是硅氧烷管231。然后，将实验材料注入喷管101移动至容器支撑器10中的HT1孔位置，以便在装有第一支持物(T1)的容器CB1中插入喷管101。将送液开关器220打向所述反应溶液侧，通过驱动送液器105向容器CB1中注入该反应溶液。将送液开关器220转向总RNA溶液201，并通过送液器105注入预定量的溶液201。在等于或低于预定温度(例如20℃)的温度下经过一段预定时间(例如20-30分钟)后，将送液开关器220转向RT酶溶液(酶1)202，以便通过驱动送液器105注入预定量的溶液202。在将实验材料注入喷管101从容器CB1中移出后，将容器支撑器10的温度设定在预定温度(例如42℃)，通过维持一段预定时间(例如30-60分钟)进行RT酶反应，从mRNA构建cDNA。在将容器支撑器10的温度设定在等于或低于预定温度(例如20℃)的温度后，将送液开关器220转向废液缸210，以便通过驱动送液器105使容器CB1中的反应溶液排出至废液缸210中。将送液开关器220转向TE溶液204，以便通过驱动送液器105向容器CB1中注入预定量的TE溶液204。通过驱动溶液温度控制器30，将容器支撑器10的温度加热至预定温度(例如90℃)，以便使mRNA杂交。然后，将送液开关器220转向用于暂时保存mRNA的容器206，通过驱动送液器105将解杂交的mRNA溶液转移至容器206中以暂时保存mRNA。(复制支持物的制备)接下来，将描述通过重新使用自上述方法制备的原始cDNA文库支持物上解杂交的mRNA构建复制支持物的方法。首先，在将实验材料注入/排出喷管101从容器101移出后，将喷管101移至容器CB2中，通过反向驱动送液器105在含有复制支持物(T2)的容器CB2中注入暂时保存的mRNA溶液206。然后，重复以上原始支持物的制备步骤。然而，可以省去稍后用于注入总RNA溶液201的步骤。将送液开关器220打向用于容器CB2的反应溶液203侧。通过驱动送液器105在容器CB2中注入该反应溶液。在等于或低于预定温度(例如20℃)的温度下维持容器CB2一段预定时间(例如20-30分钟)，之后将送液开关器220转向RT酶溶液(酶1)202，以便通过驱动送液器105注入预定量的该溶液。在将实验材料注入/排出喷管101移出容器CB2后，使容器支撑器10的温度在预定温度(例如约42℃)维持一段预定时间(例如30-60分钟)。在将容器支撑器10的温度控制在等于或低于室温(20℃)的温度后，将送液开关器220转向废液缸210。将实验材料注入/排出喷管101插入容器CB2中，通过驱动送液器105将容器CB2中的反应溶液排出至废液缸210中。将送液开关器220转换至TE溶液204，以便通过驱动送液器105在容器CB2中注入预定量的TE溶液204。然后，将送液开关器220转向废液缸210，以便使容器CB2中的TE溶液排出至废液缸中。通过重复以上操作几次(优选等于或大于5次)，产生从该原始cDNA文库支持物复制的第一块复制支持物。通过将构建该复制支持物的循环操作重复必要次数，产生必要数量的复制支持物。图2是自动构建和复制gDNA文库支持物的装置的示意图。图2所示用于构建DNA文库支持物的装置含有用于将反应溶液等液相输送至容器中的送液器105、用于对该反应溶液的液相输送进行转换的送液开关器220、用于在平面内的前后左右方向和上下方向驱动实验材料注入/排出喷管101的喷管驱动器100、用于容纳放有支持物的容器的容器支撑器10、用于加热/冷却该容器中的反应液体的容器溶液温度控制器30、用于容纳其中分别地放置有复制固定化DNA文库支持物用的实验材料和实验溶液的容器的实验材料容器支撑器20、和用于将该实验材料容器支撑器控制在预定温度的实验材料容器温度控制器40。优选地，鉴于将来与PCR装置和/或PCR产物分析装置的连接，容器支撑器10中可以插有96个或更多个实验材料容器。优选地，为了制备复制支持物，实验材料容器支撑器20含有至少4个用于实验材料容器的孔。优选地，鉴于将来与PCR装置和/或PCR产物分析装置的连接，实验材料容器支撑器20上提供的实验材料孔的数量等于或大于10。优选地，鉴于采用具有Peltier元件的容器溶液温度控制器30进行温度控制，容器支撑器10和实验材料容器支撑器20由具有良好热传导性的铝制成。(gDNA文库的原始支持物和其复制支持物的制备)我们将参考图2和图5阐述固定有gDNA文库的原始支持物和其复制支持物的制备。预备必要数量(T1～Tn)采用具有限制性酶位点的寡核苷酸(有义部分)化学修饰的支持物(例如3mm×3mm×0.1mm)。对于该原始支持物(T1)，与寡核苷酸(反义部分)进行杂交并用限制性酶进行处理，以便产生完全的限制性酶位点。将该原始支持物T1放入容器CB1中，并将采用具有限制性酶位点的寡核苷酸(有义部分)化学修饰的支持物T2～Tn(复制支持物)放入容器CB2～CBn中。将这些容器放入溶液支撑器10中。关于放置顺序，将放有原始支持物T1的容器CB1首先插入第一插入孔HT1中，其中均放有复制支持物的第二容器和相继的容器CB2～CBn则按顺序插放。将经限制性酶处理的纯化gDNA文库溶液306、DNA连接酶溶液(酶1)305、DNA聚合酶溶液(酶2)302和含有核苷酸(dT、dA、dG、dC)的反应溶液303装在温度固定在预定温度(24℃)的实验材料溶液支撑器20中。提供用于清洗/洗脱DNA的TE溶液304和废液缸310。将用于相应溶液的毛细管330与送液开关器220连接。优选地，毛细管230是液相层析用抗腐蚀性不锈管。送液开关器220与实验材料注入/排出喷管101及其它装置通过送液器105和毛细管230的前端相连。优选硅氧烷管231用于该连接。将实验材料注入/排出喷管101移至容器支撑器10的HT1孔位置，以便使喷管101插入装有第一支持物(T1)的容器CB1中。将送液开关器220转换至反应溶液303，以便通过驱动送液器105注入预定量(例如17μl)的反应溶液303。将送液开关器220转换至经限制性酶处理的gDNA文库溶液306，以便通过驱动送液器105注入预定量(例如2μl)的溶液306。在使容器CB1在等于或低于预定温度(例如20℃)的温度维持一段预定时间(例如20-30分钟)后，将送液开关器220转向DNA连接酶溶液(酶1)305，以便通过驱动送液器105在容器CB1中注入预定量(例如1μl)溶液305。在将实验材料注入/排出喷管101移出容器CB1后，将容器支撑器10的温度控制在预定温度(例如37℃)。使容器CB1维持一段预定时间(例如30-60分钟)后，在支持物T1上产生经DNA连接酶固定的gDNA文库。在将容器支撑器10的温度控制在预定温度(例如等于或小于20℃)后，将送液开关器220转向废液缸310，以便在容器CB1中插入实验材料注入/排出喷管101并通过驱动送液器105排出容器CB1中的反应溶液。将送液开关器220转向TE溶液304，通过驱动送液器105在容器CB1中注入预定量(例如500μl)的该TE溶液。然后，将送液开关器220转向废液缸310，以便排出容器CB1中的该TE溶液。通过重复该步骤几次(例如等于或大于5次)，清洗该固定化支持物T1。清洗该固定化支持物T1后，将送液开关器220转向反应溶液303，以便通过驱动送液器105在容器CB1中注入预定量(例如19μl)的反应溶液303。通过将容器支撑器10的温度加热至预定温度(例如90℃)并使容器CB1维持一段预定时间(例如10-20分钟)，使反义部分从该固定化gDNA文库上解杂交。然后，将送液开关器220转向用于暂时保存gDNA文库(反义部分)的容器306，以便从容器CB1中排出该gDNA文库(反义部分)溶液。在此阶段，完成了第一块gDNA文库(有义部分)支持物(原始支持物)的制备。(复制支持物的制备)在将实验材料注入/排出喷管101移出容器CB1后，将喷管101移至放置有复制支持物(T2)的下一容器CB2中，以便在容器CB2中注入暂时保存的该gDNA文库(反义部分)溶液306。为了制备复制支持物，重复上述循环操作必要次数，以便制备必要数量的复制支持物。然而，在下述第二个实施方案中，应注意在复制物构建程序中选择DNA聚合酶溶液(酶2)302，以便通过驱动送液器105在容器CB2中注入预定量(例如1μl)的溶液302。
产业上利用的可能性在根据本发明的装置中，可以容易地从mRNA制成固定有cDNA文库的支持物和从经限制性酶处理的gDNA制成固定有gDNA文库的支持物。尽管在传统技术中不能从DNA文库溶液复制产生复制支持物，但可以容易地在短时间内以固定化DNA支持物的形式制成必要数量的复制支持物(至到mRNA和gDNA被化学或物理方式破坏)。通过一度从重要检测对象的培养细胞或组织中收集微量基因材料，可以制成固定化DNA文库支持物和其复制支持物。对于这同一种实验材料，可以进行各种基因研究和检测。这有许多的好处。通过利用该固定化DNA文库支持物和其复制支持物，将来可以显著地节约用于开发新基因诊断技术的预算和人工。如果一度收集了患者的血液，或在手术中收集了组织用于基因诊断，则就预防医学研究而言，可以容易地实现对此收集的血液/组织的重新利用。这些事实通过使患者的精神和经济损害降低至尽可能少，可以带来很大的益处。
权利要求
1.构建互补DNA被固定化的cDNA文库的方法，包括步骤在mRNA与支持物上的oligo(dT)杂交后应用RT酶(逆转录酶)进行作用。
2.构建cDNA文库的方法，包括步骤使mRNA从固定在支持物上的cDNA文库上解杂交，通过利用所述mRNA在另一支持物上固定相同的cDNA文库。
3.构建gDNA文库的方法，包括步骤在使双链gDNA与支持物上具有限制性酶位点的寡核苷酸连接在一起后，固定gDNA文库。
4.利用权利要求3中制备的所述支持物上所述gDNA文库的固定化有义部分构建gDNA文库的方法。
5.构建单链gDNA文库的方法，包括步骤在使权利要求3中制备的所述gDNA文库的所述反义部分解杂交后，利用反义部分通过合成在支持物上固定有义部分。
6.权利要求1-5之一所要求保护的方法，其中所述支持物预先采用核苷酸或寡核苷酸进行化学修饰。
7.根据权利要求1-6之一所要求保护的方法制备的固定有DNA文库的支持物。
8.固定有单链DNA文库的支持物。
全文摘要
本发明涉及构建cDNA文库的方法,包括用支持物上的oligo(dT)n与mRNA杂交,并用逆转录酶处理以固定互补DNA;或构建gDNA文库的方法,包括将双链染色体DNA文库与支持物上具有限制性酶切位点的寡核苷酸连接起来,然后固定该gDNA文库;用于制备它们的复制物的方法;和其上携带有由此复制产生的DNA片段的支持物。
文档编号C12N15/10GK1353752SQ00808415
公开日2002年6月12日 申请日期2000年5月10日 优先权日1999年5月10日
发明者高桥浩二郎, 高井修, 丹花通文 申请人:东洋钢板株式会社, 日本帕克里津广岛株式会社