专利名称：氨基酸生产的代谢工程的制作方法
背景技术：
L-赖氨酸是通过工业发酵生产的氨基酸的一个范例。这种必需氨基酸的商业生产主要利用革兰氏阳性的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)、和乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)进行(A.Kleemann等人，氨基酸(Amino Acids)，在《Ullmann氏工业化学百科全书》(Ullmann’s Encycolpedia of Industrial Chemistry)一书中，第A2卷，第57-97页，WeinhamVCH-Verlagsgesellschaft，1985)，这3种生物体累计每年生产大约250,000吨L-赖氨酸。
考虑到通过发酵工艺进行的L-赖氨酸生产在经济上的重要性，提高生产的总量同时降低生产成本将是有益的。为达此目的，在棒杆菌中深入研究了L-赖氨酸合成的生化途径(最近的评论见Sahm等人，纽约科学院年鉴(Ann.N.Y.Acad.Sci.)78225-39，1996)。赖氨酸途径的入口开始于L-天冬氨酸(见
图1)，而L-天冬氨酸是由草酰乙酸经转氨基作用生成的。谷氨酸棒杆菌的一个特殊特性是它能够通过两种不同路径将赖氨酸中间物哌啶-2，6-二羧酸转变成二氨基庚二酸，即通过涉及琥珀酸化中间物的反应或者通过二氨基庚二酸脱氢酶的单一反应。总之，进入该途径的碳流在两个点上受到调控第一，L-苏氨酸和L-赖氨酸二者水平对天冬氨酸激酶的反馈抑制；第二，对二氢吡啶二羧酸合酶水平的控制。因此，可去调控和提高这两种酶的活性从而提高棒杆菌中的L-赖氨酸产量。
除了通向L-赖氨酸合成的生化途径，新的证据表明赖氨酸离开细胞进入培养基的转运是开发过度生成赖氨酸的谷氨酸棒杆菌菌株时需要考虑的另一个条件。Krmer及其同事的研究指出被动转运离开细胞，作为渗漏膜的结果，并不是赖氨酸外流的唯一解释；他们的数据提出具有下列特性的特异载体(1)转运蛋白对赖氨酸具有较高的Km值(20mM)；(2)转运蛋白是OH-同向转运系统(摄取系统是H+反向转运系统)；且(3)转运蛋白带正电荷，以及膜电位刺激分泌(S.Brer和R.Krmer，欧洲生化杂志(Eur.J.Biochem.)202137-143，1991)。
本领域已知利用对营养缺陷型或抗性特性而分离的多种菌株生产L-赖氨酸的几种发酵工艺美国专利号2,979,439公开了需要高丝氨酸(或甲硫氨酸和苏氨酸)的突变体；美国专利号3,700,557公开了对苏氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸、或半胱氨酸有营养要求的突变体；美国专利号3,707,441公开了对赖氨酸类似物有抗性的突变体；美国专利号3,687,810公开了能够生成L-赖氨酸且对杆菌肽、青霉素G、或多粘菌素具有抗性的突变体；美国专利号3,708,395公开了对高丝氨酸、苏氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、或上述混合物有营养要求且对赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、或其类似物有抗性的突变体；美国专利号3,825,472公开了对赖氨酸类似物有抗性的突变体；美国专利号4,169,763公开了能够生成L-赖氨酸且对至少一种天冬氨酸类似物和磺胺类药物有抗性的棒杆菌属突变菌株；美国专利号5,846,790公开了能够在不存在任何生物素作用遏制剂时生成L-谷氨酸和L-赖氨酸的突变株；以及美国专利号5,650,304公开了能够生成L-赖氨酸且对4-N-(D-丙氨酰)-2，4-二氨基-2，4-二脱氧-L-阿拉伯糖、2，4-二脱氧-L-阿拉伯糖、或其衍生物有抗性的属于棒杆菌属或短杆菌属(Brevibacterium)的菌株。
利用棒杆菌发酵生产L-赖氨酸领域的最新进展包括使用分子生物学技术来提高赖氨酸产量。提供下列范例作为例示性技术美国专利申请编号4,560,654和5,236,831公开了通过用重组DNA分子转化对S-(2-氨基乙基)-半胱氨酸敏感的宿主棒杆菌或短杆菌属微生物获得的L-赖氨酸生产突变株，其中载体DNA中插入了赋予对S-(2-氨基乙基)-半胱氨酸的抗性和生成赖氨酸的能力的DNA片段；美国专利申请编号5,766,925公开了通过将源自对L-赖氨酸和L-苏氨酸的反馈抑制脱敏的棒状细菌、编码天冬氨酸激酶的基因整合到具有渗漏型高丝氨酸脱氢酶的棒状细菌或高丝氨酸脱氢酶基因缺陷的棒状细菌的染色体DNA中产生的突变株。
除了L-赖氨酸以外，棒杆菌及相关生物体可用于生产其它氨基酸，例如支链氨基酸L-亮氨酸、L-异亮氨酸、和L-缬氨酸。通向支链氨基酸生物合成的生化途径也已透彻研究。进入天冬氨酸途径的碳流可集中生成L-赖氨酸或L-苏氨酸，而L-苏氨酸可用于生成L-异亮氨酸(
图1B)。L-异亮氨酸是由L-苏氨酸经5个反应生成的；催化这些反应的酶包括(1)苏氨酸脱水酶；(2)乙酰羟酸合酶(acetohydroxy acidsynthase，AHAS)；(3)异构还原酶(isomeroreductase，IR)；(4)二羟酸脱水酶；和(5)转氨酶B。苏氨酸脱水酶是该途径中异亮氨酸合成唯一独有的酶；其它4种酶还用于生成其它支链氨基酸，缬氨酸和亮氨酸。由苏氨酸流向异亮氨酸的碳流受到苏氨酸脱水酶和乙酰羟酸合酶(AHAS)的控制。在克隆了棒杆菌中异亮氨酸途径的各种酶的编码基因(ilvA、ilvB、ilvC、ilvD、和ilvE)之后(C.Cordes等人，基因(Gene)112113-116，1992；B.Mckel等人，细菌学杂志(J.Bacteriology)1748065-8072，1992；和C.Keilhauer等人，细菌学杂志(J.Bacteriology)1755595-5603，1993)，可应用重组DNA技术产生新的菌株。
通过提高支链氨基酸生物合成途径中酶的活性来提高氨基酸L-异亮氨酸、L-亮氨酸、和L-缬氨酸产量已有描述。另外，通过提高由ilvBN操纵子编码的乙酰羟酸合酶(AHAS)的活性来提高支链氨基酸产量已有描述(H.Sahm等人，纽约科学院年鉴(Ann.N.Y.Acad.Sci.)78225-39，1996)。
用于生产支链氨基酸的例示性工艺包括美国专利号5,188,948公开了利用对聚酮化合物(polyketide)有抗性的微生物生产L-缬氨酸的发酵工艺；美国专利号5,521,074公开了利用属于棒杆菌属或短杆菌属的微生物生产L-缬氨酸的工艺，该微生物展示a)生成L-缬氨酸的能力，b)在含乙酸作为唯一碳源的培养基中对L-缬氨酸的抗性，和c)在含葡萄糖作为唯一碳源的培养基中对丙酮酸类似物的敏感性；美国专利号4,601,983公开了能够用于生产具有高丝氨酸脱氢酶活性的蛋白质、能够在棒状细菌中复制、且用于生成L-苏氨酸和L-异亮氨酸的遗传序列；美国专利号4,442,208公开了利用通过重组DNA技术获得的对α-氨基-β-羟基戊酸有抗性的短杆菌或棒杆菌菌株生产L-异亮氨酸的发酵工艺；美国专利号4,656,135公开了用于生产L-异亮氨酸的工艺，包括培养对甲基赖氨酸或α-酮丙二酸有抗性且能够在液体培养基中生成L-异亮氨酸的属于短杆菌属或棒杆菌属的微生物，并由所述培养基回收积累的L-异亮氨酸；美国专利号5,118,619公开了经利用D-乳酸的突变体由D，L-α-羟基丁酸发酵生产L-异亮氨酸的方法；美国专利号5,763,231公开了生产L-亮氨酸的工艺，包括在培养基中培养属于棒杆菌属、埃希氏菌属、短杆菌属、或微杆菌属(Microbacterium)的菌株，并使产生的细胞与糖类和乙酸或其盐类反应以形成L-亮氨酸并在反应液中积累；以及美国专利号3,970,519公开了抵抗亮氨酸或其类似物的反馈抑制且需要异亮氨酸、苏氨酸、或甲硫氨酸中至少一种作为生长养分以生成L-亮氨酸的菌株。
通过降低缬氨酸产量来提高氨基酸产量尚未有描述。
通过降低AHAS活性来提高氨基酸产量尚未有描述。
发明概述本发明的一个目的是提供能够以比亲本菌株更高的效率将葡萄糖转变成除L-异亮氨酸、L-亮氨酸、和L-缬氨酸以外的其它氨基酸的微生物。转变效率可通过下面的公式量化[(生成的氨基酸克数/消耗的右旋糖克数)*100]＝％产量，并表述为由右旋糖生成的产量。
在一个实施方案中，本发明提供了经诱变而成为一种或多种支链氨基酸的合成营养缺陷型且经选择以比亲本菌株更高的百分比产量生成预期氨基酸的微生物。
在更具体的实施方案中，本发明提供了如下获得的微生物，包括对亲本菌株进行随机化学诱变，分离支链氨基酸合成营养缺陷型的经诱变变体，并选择能够以比亲本菌株更高的效率将葡萄糖转变成除L-异亮氨酸、L-亮氨酸、和L-缬氨酸以外的其它氨基酸的变体。在另一个具体的实施方案中，本发明提供了如下获得的微生物，包括利用rDNA方法学在ilvBN操纵子的核酸序列中引入变化(即突变)，分离支链氨基酸合成营养缺陷型或营养徐缓型的经诱变变体，并选择能够以比亲本菌株更高的效率将葡萄糖转变成除L-异亮氨酸、L-亮氨酸、和L-缬氨酸以外的其它氨基酸的变体。
在一个优选的实施方案中，本发明的微生物生成L-赖氨酸。在另一个优选的实施方案中，本发明致力于棒杆菌微生物或短杆菌微生物，特别优选的微生物是生成L-赖氨酸的棒杆菌或短杆菌微生物。在最优选的实施方案中，微生物具有NRRL No.B-30149(也称为LC10)或NRRLNo.B-30150(也称为BF100-1030)的鉴定特征，这两种菌株于1999年6月29日保藏于农业研究机构培养物收藏中心(AgriculturalResearch Service Culture Collection)，北方地区研究中心(Northern Regional Research Center)，北方大学街1815号(1815University Street)，Peoria，伊利诺斯州(Illinois)，61604，美国。
本发明的另一个目的是提供用于提高氨基酸产量的方法，包括诱变亲本菌株，选择一种或多种支链氨基酸合成的营养缺陷型细胞，并选择以比亲本菌株更高的百分比产量由右旋糖生成预期氨基酸的支链氨基酸营养缺陷型。
在优选的实施方案中，本发明的方法致力于通过培养经随机化学诱变或重组DNA(rDNA)技术变成对支链氨基酸亮氨酸、异亮氨酸、和缬氨酸中一种或多种为营养缺陷型或营养徐缓型的棒杆菌来提高由右旋糖生成氨基酸L-赖氨酸的产量。
在一个具体的实施方案中，支链氨基酸营养缺陷型是由棒杆菌的化学诱变产生的。在另一个具体的实施方案中，支链氨基酸营养缺陷型是由ilvBN操纵子通过rDNA技术的诱变产生的。
本发明的另一个目的是提供由能够以比亲本菌株更高的效率将葡萄糖转变成除L-异亮氨酸、L-亮氨酸、和L-缬氨酸以外的其它氨基酸的微生物生产氨基酸的工艺。
在一个实施方案中，本发明提供了用于生产氨基酸的工艺，包括在培养基中培养如下获得的微生物诱变亲本菌株成为支链氨基酸合成营养缺陷型或营养徐缓型，并选择能够以比亲本菌株更高的效率将葡萄糖转变成除L-异亮氨酸、L-亮氨酸、和L-缬氨酸以外的其它氨基酸的变体。
在本发明工艺的优选实施方案中，发酵利用的微生物是如下获得的，包括对亲本菌株进行随机化学诱变，分离支链氨基酸合成营养缺陷型的经诱变变体，并选择能够以比亲本菌株更高的效率将葡萄糖转变成除L-异亮氨酸、L-亮氨酸、和L-缬氨酸以外的其它氨基酸的变体。在本发明工艺的另一个优选实施方案中，发酵利用的微生物是如下获得的，包括利用rDNA方法学改变(即引入突变)ilvBN操纵子的核苷酸序列，分离支链氨基酸合成营养缺陷型或营养徐缓型的经诱变变体，并选择能够以比亲本菌株更高的效率将葡萄糖转变成除L-异亮氨酸、L-亮氨酸、和L-缬氨酸以外的其它氨基酸的变体。
应当领会，上文一般描述和下文详细描述只是例示性和解释性的，意欲提供对所申请发明的进一步解释。
图的简述
图1.(A)棒杆菌中L-赖氨酸生成的生化途径的示意图；(B)棒杆菌中L-异亮氨酸生成的生化途径的示意图。
图2.(A-B)棒杆菌的ilvBN操纵子核苷酸序列的示意图(SEQ ID NO1)；(C)棒杆菌的ilvBN操纵子氨基酸序列的示意图(SEQ ID NO2)。
图3.(A-B)质粒pAL203Δ中的ilvBN缺失突变体核苷酸序列的示意图(SEQ ID NO3)；(C)质粒pAL203Δ中的ilvBN缺失突变体氨基酸序列的示意图(SEQ ID NO4)。
图4.(A-C)pRV1B5等位基因的核苷酸序列的示意图(SEQ ID NO5)；(D)pRV1B5等位基因的氨基酸序列的示意图(SEQ ID NO6)。
优选实施方案的详述1.定义为了清楚且一致的理解说明书和权利要求书，包括这些术语的范围，本文提供了下列定义。
营养缺陷型当用于本文时，该术语指由于获得性遗传缺陷而不能合成特定代谢物，因而其生长需要该代谢物的外部来源的微生物菌株。
氨基酸补充当用于本文时，该术语指生长所需并添加到基本培养基中以支持营养缺陷型生长的氨基酸。
营养徐缓型当用于本文时，该术语指在不存在特定代谢物的外部来源时展示延缓生长的微生物菌株。营养徐缓型能够合成代谢物，但是由于获得性遗传缺陷，合成速率低于亲本菌株合成相同代谢物的速率。
支链氨基酸当用于本文时，该术语指其中R基团具有支链碳结构的氨基酸，诸如亮氨酸、异亮氨酸、和缬氨酸。
碳流当用于本文时，该术语指碳在生物体两用、分解、和/或合成生化途径之间的运动。
染色体整合当用于本文时，该术语指外源DNA片段插入宿主生物体的染色体；更具体的说，该术语用于指外源DNA片段与宿主细胞染色体适当区域之间的同源重组。
高产量衍生物当用于本文时，该术语指与进行衍生的亲本菌株相比，以更高产量由右旋糖生成特定氨基酸的微生物菌株。
突变当用于本文时，该术语指感兴趣的核苷酸序列中单个碱基对的变化、插入、或缺失。
操纵子当用于本文时，该术语指细菌基因表达和调控的DNA单位，包括结构基因和调控元件。操纵子内包含的调控元件的范例包括但不限于启动子和操纵基因。
亲本菌株当用于本文时，该术语指进行某些形式的诱变以产生本发明微生物的微生物菌株。
由右旋糖生成的百分比产量当用于本文时，该术语指由公式[(生成的氨基酸克数/消耗的右旋糖克数)*100]＝％产量定义的由右旋糖生成氨基酸的产量。
表型当用于本文时，该术语指依赖微生物遗传结构的看得见的物理特征。
相对生长当用于本文时，该术语指在已知成分培养基上培养确定的时间后，通过直接比较亲本菌株与后代菌株的生长情况来提供生长评价的测量。
诱变当用于本文时，该术语指在DNA中产生突变的工艺。对于“随机”诱变，突变的准确位置是不可预测的，即可发生于微生物基因组中的任何位置，而且突变是由诸如照射或化学处理等因素引起的物理损伤的结果。rDNA诱变针对的是感兴趣的克隆DNA，可以是随机的或定点的。2.基于降低流向支链氨基酸合成的碳流和提高生成非支链氨基酸的产量的本发明微生物一般而言，本发明提供了因支链氨基酸合成为营养缺陷型而将碳流指向非支链氨基酸合成的微生物。更具体的说，通过选择需要一种或多种支链氨基酸亮氨酸、异亮氨酸、或缬氨酸(如异亮氨酸和缬氨酸)的特定营养缺陷型表型，或设计ilvBN操纵子中的突变以降低流向异亮氨酸、亮氨酸、和缬氨酸合成的碳流，从而该系统的碳流可用于其它代谢途径(如L-赖氨酸合成)。
在一个具体的实施方案中，本发明提供了生成氨基酸X的微生物C，其中所述微生物C是由下列方法获得的(a)选择以百分比产量Y由右旋糖生成所述氨基酸的亲本微生物A；(b)通过选自下组的方法诱变所述亲本微生物A以产生微生物B(i)随机化学诱变；和(ii)ilvBN操纵子的rDNA诱变；(c)由步骤(b)选择一种或多种支链氨基酸亮氨酸、异亮氨酸、和缬氨酸营养缺陷型或营养徐缓型的至少一种经诱变微生物B；并(d)由步骤(c)选择以百分比产量Z由右旋糖生成所述氨基酸X的至少一种微生物C，其中所述百分比产量Z比所述百分比产量Y更高。
由右旋糖生成的百分比产量优选使用下面的公式计算[(生成的赖氨酸克数/L)/(消耗的右旋糖克数/L)]*100。
亲本微生物可选自本领域已知能够生成氨基酸X的任何微生物。特别优选的亲本微生物是棒杆菌和短杆菌。
可通过本领域熟练技术人员知道和可用的任何方法和技术来制备本发明的菌株。适用于构建本发明细菌菌株的方法的例示性范例包括但不限于使用合适试剂(诸如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝酸胍，即NTG)进行的诱变；由转化线性DNA或同源重组介导的基因整合技术；以及由噬菌体介导的转导。这些方法在本领域是众所周知的，且描述于例如，J.H.Miller，《分子遗传学实验》(Experiments in MolecularGenetics)，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1972；J.H.Miller，《细菌遗传学短期课程》(A Short Course in Bacterial Genetics)，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1992；M.Singer和P.Berg，《基因和基因组》(Gene & Genomes)，大学科学丛书，Mill Valley，加利福尼亚，1991；J.Sambrook、E.F.Fritsch、和T.Maniatis，《分子克隆实验室手册》(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989；P.B.Kaufman等人，《生物学和医学中的分子和细胞方法手册》(Handbook of Molecularand Cellular Methods in Biology and Medicine)，CRC出版社，Boca Raton，佛罗里达，1995；《植物分子生物学和生物技术中的方法》(Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology)，B.R.Glick和J.E.Thompson编，CRC出版社，Boca Raton，佛罗里达，1993；和P.F.Smith-Keary，《大肠杆菌的分子遗传学》(MolecularGenetics of Escherichia coli)，Guilford出版社，纽约，NY，1989。A.通过随机诱变来构建支链氨基酸营养缺陷型在一个具体的优选实施方案中，本发明假定修饰L-异亮氨酸、L-亮氨酸、和L-缬氨酸生物合成中共有的酶促步骤可提高由右旋糖生成L-赖氨酸的百分比产量。
在最优选的实施方案中，本发明通过随机诱变亲本菌株随后选择特定表型而提供了支链氨基酸合成营养缺陷型的微生物。选择用于诱变的亲本菌株可以是已知生成感兴趣氨基酸的任何菌株。优选的生物体包括棒杆菌菌株和短杆菌菌株，最优选的生物体包括生成L-赖氨酸的棒杆菌菌株和短杆菌菌株。
可使用本领域已知的任何随机诱变技术来诱变亲本菌株，包括但不限于照射和化学操作。特别优选的是随机化学诱变，最优选的是由J.H.Miller描述的烷化剂法(J.H.Miller，《分子遗传学实验》(Experiments in Molecular Genetics)，冷泉港实验室，1972)。
作为范例，如下进行化学诱变。在丰富培养基中于30℃培养生成赖氨酸的棒杆菌菌株的培养物至光密度达到6.0。用基本培养基清洗细胞，并重悬于含100μg/mL NTG的基本培养基。将细胞于30℃暴露于诱变剂达30分钟。用基本培养基清洗细胞，并涂布在丰富培养基平板上。将丰富培养基平板上的菌落复制到丰富培养基和基本培养基的平板上。在丰富培养基上生长但在基本培养基上不生长的菌落归类为营养缺陷型。将营养缺陷型突变体复制到基本培养基和含10mM L-异亮氨酸和10mM L-缬氨酸的基本培养基的平板上。由异亮氨酸和缬氨酸挽救的菌落归类为缬氨酸营养缺陷型。菌株B4B是通过化学诱变产生的缬氨酸营养缺陷型。B.通过经rDNA方法学的诱变来构建支链氨基酸营养缺陷型在另一个具体的优选实施方案中，本发明利用重组DNA技术对编码支链氨基酸生物合成中重要蛋白质的克隆DNA序列进行体外和体内诱变。突变后的DNA可用于修饰亲本菌株，以产生支链氨基酸合成营养缺陷型且以比亲本菌株更高的产量由右旋糖生成非支链氨基酸的突变菌株。
在一个具体的优选实施方案中，可通过重组DNA技术通过本领域已知的任何方法突变感兴趣的克隆DNA。正如本领域熟练技术人员所知道的，克隆DNA中的突变可包括单个核苷酸的变化(点突变)、多个核苷酸的变化、核苷酸缺失或插入。重组DNA技术的一般方法对于本领域熟练技术人员是知道的，而且可在描述基本技术(诸如核酸纯化、限制酶消化、连接、基因克隆、基因测序、基因序列的聚合酶链式反应即PCR、诸如此类)的许多常见实验室手册中找到。参阅如Sambrook等人，《分子克隆实验室手册》(Molecular CloningA LaboratoryManual)，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989；《分子生物学现行方案》(Current Protocols in Molecular Biology)，Ausubel等人编，John Wiley & Sons，纽约，1994；《PCR方案》(PCRProtocols)，Innis等人编，Academic出版公司，纽约，第407-415页，1990)。
另外，具体传授体外诱变克隆DNA的参考文献对于本领域熟练技术人员是知道的。例如，诸如定点诱变、由寡核苷酸介导的诱变、接头扫描诱变、体外随机化学诱变、盒式诱变、PCR诱变、和其它策略详细描述于《定向诱变实践方法》(Directed MutagenesisA PracticalApproach)，M.J.McPherson编，牛津大学出版社，纽约，1991。
在另一个具体的优选实施方案中，可在宿主细胞体内突变感兴趣的克隆DNA。这种“体内诱变”包括通过在DNA修复途径之一或多个中携有突变的大肠杆菌菌株中增殖DNA，从而在感兴趣的任何克隆DNA中产生随机突变的工艺。这些“增变”菌株的随机突变率高于野生型亲本。DNA在这些菌株中的增殖将在DNA中产生随机突变。设计用于实现该目的的系统对于本领域熟练技术人员是知道的，而且可通过商业途径获得。例如，Stratagene公司提供了利用大肠杆菌XLl Red菌株的系统，该菌株缺失了DNA修复基因(MutH、MutL、和MutS)，从而在短时间内得以发生许多不同突变。在30小时的时间跨度里可发生多达10,000处突变，从而得以通过本领域已知流程由突变DNA制备完整的突变DNA文库。
选择用于突变的克隆DNA可以是本领域已知对于支链氨基酸合成重要的任何序列，包括但不限于，对于合成重要的一种或多种酶或者对于转运和分泌重要的一种或多种蛋白质产物的编码序列。最优选的是棒杆菌或短杆菌ilvBN操纵子的克隆序列。已经克隆了涉及支链氨基酸合成的棒杆菌基因；例如可获得异亮氨酸途径的基因序列(ilvA、ilvB、ilvC、ilvD、和ilvE)(C.Cordes等人，基因(Gene)112113-116，1992；B.Mckel等人，细菌学杂志(J.Bacteriology)1748065-8072，1992；和C.Keilhauer等人，细菌学杂志(J.Bacteriology)1755595-5603，1993)。
L-异亮氨酸是由L-苏氨酸经5个反应生成的；催化这些反应的酶包括(1)苏氨酸脱水酶(ilvA)；(2)乙酰羟酸合酶(ilvBN)；(3)异构还原酶(ilvC)；(4)二羟酸脱水酶(ilvD)；和(5)转氨酶(ilvE)。苏氨酸脱水酶是该途径中异亮氨酸合成唯一独有的酶；其它4种酶还用于生成其它支链氨基酸，缬氨酸和亮氨酸。图2显示了棒杆菌菌株中涉及异亮氨酸生物合成的酶促途径。
乙酰羟酸合酶(AHAS)和异构还原酶(IR)催化代谢物流向异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、和泛酸的后续反应。正如在其它细菌中，棒杆菌菌株的AHAS是由两个基因(ilvB和ilvN)编码的。基因破坏确认了这两个基因在谷氨酸棒杆菌中编码单一AHAS活性(C.Keilhauer等人，细菌学杂志(J.Bacteriology)1755595-5603，1973)。通过Northern印迹分析在体内鉴定了3.9、2.3、和1.1kb的3种转录本，分别对应于ilvBNC、ilvNC、和ilvC信息。ilvC转录本(编码IR)是来自谷氨酸棒杆菌ilv操纵子的最丰富的转录本。其它分析指出，在这个操纵子中有3个有活性的启动子；ilvBNC和ilvNC信息的稳态水平显著有助于单一AHAS的总活性。
在本发明最优选的实施方案中，可通过限制酶消化在克隆ilvBN操纵子DNA序列中产生缺失，从而产生突变。然后可通过同源重组用突变后的ilvBN序列替代野生型序列，并筛选支链氨基酸营养缺陷型。
本发明的另一个实施方案致力于具有下列特征的微生物棒杆菌一种或多种支链氨基酸异亮氨酸、亮氨酸、和缬氨酸营养缺陷型，而且以比亲本菌株百分比产量更高的百分比产量由右旋糖生成感兴趣氨基酸。在特别优选的实施方案中，生成的氨基酸是L-赖氨酸。
本发明其它高度优选的实施方案致力于基本上具有NRRL保藏物编号B-30149或NRRL保藏物编号N-30150的所有特征的微生物。3.用于提高氨基酸产量的方法本发明的另一个目的是提供用于提高氨基酸产量的方法。一般而言，本发明提供了用于提高氨基酸X产量的方法，包括
(a)选择以百分比产量Y由右旋糖生成所述氨基酸的亲本微生物A；(b)通过选自下组的方法诱变所述亲本微生物A以产生微生物B(i)随机化学诱变；和(ii)ilvBN操纵子的rDNA诱变；(c)由步骤(b)选择一种或多种支链氨基酸亮氨酸、异亮氨酸、和缬氨酸营养缺陷型的至少一种经诱变微生物B；并(d)由步骤(c)选择以百分比产量Z由右旋糖生成所述氨基酸X的至少一种微生物C，其中所述百分比产量Z比所述百分比产量Y更高。
在一个特别优选的实施方案中，可选择本领域已知的任何菌株作为以确定百分比产量由右旋糖生成感兴趣氨基酸的亲本菌株。可使用下面的公式容易的计算由右旋糖生成的百分比产量[(生成的氨基酸克数/L)/(消耗的右旋糖克数/L)]*100。
在选择微生物并测定由右旋糖生成氨基酸的百分比产量后，优选通过针对该生物体完整基因组的随机诱变技术或者通过针对感兴趣克隆DNA的rDNA技术对微生物进行诱变。不管诱变采用哪种具体方法，均对突变后的生物体进行筛选并依据支链氨基酸合成营养缺陷型进行选择。然后筛选所选择的营养缺陷型，以确定哪些菌株由右旋糖生成所需氨基酸的百分比产量高于亲本菌株。
在多个实施方案，本发明提供了用于提高生物体棒杆菌、短杆菌、和大肠杆菌的感兴趣氨基酸产量的方法。另外，根据具体的实施方案，本发明提供了用于提高非支链氨基酸产量的方法，诸如甘氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、和组氨酸。
在优选的实施方案中，本发明提供了通过产生支链氨基酸合成营养缺陷型并使亮氨酸、异亮氨酸、和缬氨酸合成的碳流转向来提高非支链氨基酸产量的方法。在特别优选的实施方案中，本发明提供了通过由诱变后的亲本菌株选择缬氨酸和异亮氨酸合成营养缺陷型菌株来提高氨基酸产量的方法。
在多种优选实施方案中，本发明还提供了通过随机诱变技术(即照射或化学诱变)或者通过ilvBN操纵子的rDNA诱变技术诱变亲本菌株来提高氨基酸产量的方法。在一个特别优选的实施方案中，可通过随机化学诱变来诱变亲本菌株。在另一个特别优选的实施方案中，通过针对克隆ilvBN操纵子核苷酸序列的rDNA技术来诱变亲本菌株。4.用于生产氨基酸的工艺本发明的另一个目的是提供生产氨基酸的工艺。一般而言，本发明提供了用于生产氨基酸X的工艺，包括(a)在培养基中培养微生物C，其中所述微生物C是由下列方法获得的(i)选择以百分比产量Y由右旋糖生成所述氨基酸的亲本微生物A；(ii)通过选自下组的方法诱变所述亲本微生物A以产生微生物B(1)随机化学诱变；和(2)ilvBN操纵子的rDNA诱变；(iii)由步骤(ii)选择一种或多种支链氨基酸亮氨酸、异亮氨酸、和缬氨酸营养缺陷型的至少一种经诱变微生物B；并(iv)由步骤(iii)选择以百分比产量Z由右旋糖生成所述氨基酸X的至少一种微生物C，其中所述百分比产量Z比所述百分比产量Y更高；并(b)回收由所述微生物C生成的所述氨基酸X。
本发明优选的实施方案是其中培养的微生物选自棒杆菌、短杆菌、和大肠杆菌的方法。特别优选的是涉及棒杆菌属生物体的方法。为本发明工艺选择的微生物是那些生成感兴趣氨基酸(特别是非支链氨基酸)的微生物。更特别优选的微生物是生成甘氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、和组氨酸的微生物。可通过下面计算由右旋糖生成的百分比产量的公式方便的测定选定氨基酸的产量水平[(生成的氨基酸克数/L)/(消耗的右旋糖克数/L)]*100。
用于本发明工艺的微生物优选通过诱变选定的亲本菌株而获得。本发明优选实施方案包括其中对选定亲本菌株进行针对整个基因组的随机诱变或者感兴趣的克隆DNA的rDNA诱变的方法。
在本发明一个特别优选的实施方案中，对亲本菌株进行的随机诱变包括但不限于通过照射处理或化学处理的诱变。在更特别优选的实施方案中，对亲本菌株进行随机化学诱变。
在本发明另一个特别优选的实施方案中，对亲本菌株进行rDNA诱变。在更特别优选的实施方案中，进行ilvBN操纵子的体外或体内rDNA诱变。然后通过本领域熟练技术人员众所周知的同源重组技术，可用ilvBN操纵子或其片段的突变形式替代野生型ilvBN操纵子序列(见实施例6)。
无论诱变的是选择的亲本菌株还是克隆的DNA序列，均对产生的后代进行筛选，并选择支链氨基酸合成(即亮氨酸、异亮氨酸、或缬氨酸)营养缺陷型。这种突变体的选择完全属于本领域从业人员的技术范围之内。一个特别优选的实施方案是缬氨酸和异亮氨酸生物合成营养缺陷型菌株。
最后，根据选定氨基酸的产量选择本发明工艺的微生物。利用公式[(氨基酸克数/L)/(消耗的右旋糖克数/L)]*100来测定由右旋糖生成的百分比产量，根据具有比亲本菌株更高的百分比产量由右旋糖生成选定氨基酸来选择所需微生物。
本发明的其它实施方案是在培养本发明微生物的具体方法方面有所不同的方法。因此，本领域已知的多种发酵技术可应用于本发明生产氨基酸的方法中。
合适碳源的例示性范例包括但不限于碳水化合物，诸如葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉水解产物、纤维素水解产物、和糖蜜；有机酸，诸如乙酸、丙酸、甲酸、苹果酸、柠檬酸、和延胡索酸；以及醇类，诸如甘油。
合适氮源的例示性范例包括但不限于氨，诸如氨气和氨水；无机酸或有机酸的铵盐，诸如氯化铵、磷酸铵、硫酸铵、和乙酸铵；以及其它含氮物质，包括肉膏、蛋白胨、玉米浆、酪蛋白水解产物、豆饼水解产物、和酵母提取物。
一般而言，可根据本发明通过发酵工艺(诸如分批发酵或补料分批发酵)商业性生产氨基酸。在分批发酵中，在发酵开始时加入所有养分。在补料分批发酵或持续补料分批发酵中，由发酵开始时或在培养达到某一时间时，或者在培养液中补加的养分耗尽时，向培养物中持续供应一种或多种养分。持续分批发酵或补料分批发酵的变化形式是重复补料分批发酵或流入-流出发酵，其中在某些时刻由发酵罐取出部分内含物，例如当发酵罐充满时，而养分的补充持续进行。在这种方式中，发酵可持续较长时间。
另一类发酵，即连续发酵或恒化培养，连续补加完全培养基，同时连续或半连续取出培养物，使得发酵罐中培养液的体积保持大致恒定。连续发酵在原理上可持续无限时间。
在分批发酵中，生物体生长直至培养基中的一种必需养分耗尽，或者发酵条件变得不适宜(如pH降至抑制微生物生长的数值)。在补料分批发酵中，通常进行测量(如使用pH控制)以维持适宜的生长条件，并向培养物中添加一种或多种必需养分以预防这些养分的耗尽。微生物将以养分补料速率规定的生长速率继续生长。通常，一种养分，非常常见的是碳源，将限制生长。相同原理也适用于连续发酵，通常培养基补料中的一种养分是限制性的，所有其它养分是过量的。限制性养分将以非常低的浓度存在于培养液中，常常低得测量不到。可采用不同类型的养分限制。碳源限制是最常用的。其它范例是氮源限制、氧限制、特定养分限制诸如维生素或氨基酸(在这种化合物的营养缺陷型微生物的情况中)、硫限制、和磷限制。
可通过本领域已知的任何方法回收氨基酸。例示性流程提供于H.J.Van Walsem和M.C.Thompson，细菌学杂志(J.Bacteriology)59127-132，1997；和美国专利号3,565,951(收入本文作为参考)。
本文明确收入文中提及的所有专利和发表物作为参考。
实施例实施例1化学诱变和缬氨酸营养缺陷型的选择如J.H.Miller所述(J.H.Miller，1972，《分子遗传学实验》(Experiments in Molecular Genetics)，冷泉港实验室)，用烷化剂诱变生成赖氨酸的棒杆菌菌株BF100。将菌落复制到基本培养基(MM)平板上。在MM上不生长但在完全培养基(CM)上生长的菌落鉴定为营养缺陷型。选择在补充L-缬氨酸和L-异亮氨酸的MM上能够生长的营养缺陷型菌株用于赖氨酸产量分析。
MM每升含20g D-葡萄糖、10g硫酸铵、2.5g尿素、1g KH2PO4、0.4gMgSO47H2O、1g NaCl、0.01g MnSO4·H2O、0.01g FeSO47H2O、10mg泛酸、50mg生物素、200mg硫胺素、和50mg烟酰胺，pH7.2。当在MM中补充L-氨基酸时，每种用量是50mg/L。MMIV指添加异亮氨酸和缬氨酸的MM。
表1显示了亲本菌株及其通过化学诱变产生的高产量衍生物在补充3种氨基酸的基本培养基琼脂平板上的生长模式。补充的是50mg/LL-氨基酸。以30℃培养3天后的相对菌落大小表示生长情况。实施例2使用rDNA技术产生支链营养缺陷型1.缺失型ilvB基因的制备通过PCR扩增乳发酵棒杆菌(ATCC 21799)的ilvBN操纵子，并克隆到pCR-Script中产生pAL203。ilvB基因包含由2个EcoNI限制性位点分隔的390bp区域。EcoNI不切割质粒pCR-Script。通过用EcoNI切割质粒pAL203随后自身连接产生pAL203Δ，由此设计了ilvB缺失型等位基因。2.经修饰ilvBN等位基因进入棒杆菌染色体的同源重组如Maloy等人所述(S.R.Maloy、V.J.Stewart、和R.K.Taylor，1996，《致病细菌的遗传分析实验室手册》(Genetic Analysis ofPathogenic BacteriaA Laboratory Manual)，冷泉港出版社)，构建了用于通过双交换进行等位基因交换的载体。ATCC 37766是在大肠杆菌中复制但在棒杆菌中不复制的质粒pK184的来源。将sacB基因亚克隆到该质粒的SspI位点中产生pJC3。pJC3不能在棒杆菌中复制。在任何卡那霉素抗性菌落中，载体已通过克隆基因内位点处的同源重组整合到染色体中。整合载体上sacB基因的致死表达防止了在存在蔗糖时的生长。在存在蔗糖时的生长要求沿克隆的插入片段的同源区发生第二次交换。若第一次和第二次交换位于修饰(缺失、点突变)的两侧，则ilvBN的经修饰等位基因将换下宿主菌株染色体上存在的等位基因。
将来自pAL203Δ的ilvBN操纵子的经修饰等位基因亚克隆到整合载体pJC3中，并电穿孔转化到棒杆菌的BF100菌株中，然后涂布在不含蔗糖但含卡那霉素的丰富培养基(DMK)平板上。挑取菌落，并在不含蔗糖和卡那霉素的丰富肉汤培养基中培养48小时。将培养物在不含卡那霉素但含蔗糖的丰富培养基平板上划线。由蔗糖平板挑取单菌落，并复制到DMK、SM1、MM、和MMIV平板上。选择不具有卡那霉素抗性、能在蔗糖上生长、不能在MM上生长、能在MMIV上生长的菌株用于摇瓶实验。LC10是BF100衍生的营养缺陷型。
表2显示了亲本菌株及其使用重组DNA方法产生的高产量衍生物在补充3种氨基酸的一系列基本培养基琼脂平板上的生长模式。补充的是50mg/L L-氨基酸。以30℃培养3天后的相对菌落大小表示生长情况。实施例3通过随机化学诱变产生的缬氨酸营养缺陷型菌株的L-赖氨酸产量的摇瓶测定由SM1平板挑取单菌落并转移至SM1肉汤培养基，由此制备B4B种子培养物。SM1是由每升水混合50g蔗糖、3g K2HPO4、3g尿素、0.5gMgSO47H2O、20g聚蛋白胨、5g牛肉浸膏、0.9mg D-生物素、3mg硫胺素、125mg烟酰胺、0.5g L-甲硫氨酸、0.25g L-苏氨酸、和0.5g L-丙氨酸并调pH7.3而制备的。平板含20g/L琼脂。在SM1肉汤培养基中培养16小时后，加入等体积的30％甘油，并将培养物冻存于-80℃。
在装有20mL SFM的带挡板250mL种子摇瓶中接种0.1mL融化的种子培养物。种子培养基(SFM)每升水含60g D-葡萄糖、3g K2HPO4、3g尿素、0.5g MgSO47H2O、20g聚蛋白胨、5g牛肉浸膏、3mg D-生物素、125mg烟酰胺、0.5g L-甲硫氨酸、0.25g L-苏氨酸、和0.5g L-丙氨酸，pH7.3。将培养物于30℃培养16小时，搅拌设为240pm，位移2英寸。取2mL种子培养物用于接种21mL发酵培养基(FM4)。FM4培养基是通过混合16mL主要培养基与5mL右旋糖原液产生的。右旋糖原液是180gD-葡萄糖加500mL水。主要培养基每升含0.083g MnSO4、0.4mg D-生物素、玉米浆、萃余液(raffinate)、和50g CaCO3。加入玉米浆使FM4终体积为4％干固体。加入萃余液使FM4终体积中有5％硫酸铵。将培养物在250mL带挡板的摇瓶中于30℃培养48小时，通气设为240rpm，位移2英寸。
表3显示了通过选择缬氨酸和异亮氨酸要求而得到改进的棒杆菌菌株在摇瓶中的L-赖氨酸产量的数据。实施例4通过rDNA方法学产生的缬氨酸营养缺陷型菌株的L-赖氨酸产量的摇瓶测定表4显示了通过由ilvBN操纵子染色体拷贝缺失390个碱基的DNA序列而得到改进的棒杆菌菌株在摇瓶中的L-赖氨酸产量的数据(见实施例2)。如实施例3所述培养并分析培养物。实施例5缬氨酸营养缺陷型的赖氨酸产量的微量发酵测定在装有500mL SM1的2升带挡板摇瓶中培养种子培养物18小时。将3.1L FM4培养基用于4L微量发酵罐。将温度和pH分别维持于32℃和7.2。在20小时将搅拌由700rpm提高至950rpm。通气为4.5LPM。将右旋糖维持于3g/L。发酵时间为48小时。
表5显示了不能合成L-异亮氨酸和L-缬氨酸的棒杆菌菌株在4升发酵罐中的L-赖氨酸产量的数据。实施例6通过克隆的ilvBN的体内诱变产生的营养徐缓型的L-赖氨酸生产1.产生功能性AHAS酶的缺陷型ilvBN操纵子的制备将pAL203上的i lvBN操纵子亚克隆到穿梭载体pM2中产生pVAL1。pM2在大肠杆菌和棒杆菌中都能复制。将pVAL1转化到增变菌株XL1RED(Stratagene公司)中。参照XL1RED试剂盒的指示制备诱变质粒，并电穿孔到缬氨酸营养缺陷型棒杆菌中。缬氨酸营养缺陷型在没有功能性ilvBN操纵子的遗传互补的情况下，在没有补充异亮氨酸和缬氨酸的MM平板上不能生长。
由SM1平板选择卡那霉素抗性转化体，并复制到MM平板上。那些在MM平板上生长的菌落显示存在ilvB缺失的功能互补。选择比含亲本质粒(pVAL1)的缬氨酸营养缺陷型菌落小的菌落用于缬氨酸营养缺陷型活性测定分析。pRV1B5是由在大肠杆菌和棒杆菌中都能复制的pVAL1衍生的质粒。缬氨酸营养缺陷型菌株产生的AHAS活性比由pVAL1产生的AHAS比活性的1％还要低。ilvBN操纵子的这种构建物具有渗漏AHAS活性。2.同源重组进入棒杆菌染色体DNA将ilvBN操纵子的RV1B5渗漏型等位基因亚克隆到整合载体pJC3中，并用于通过同源重组用渗漏型等位基因换下缬氨酸营养缺陷型的缺失型等位基因，正如实施例2中进行的。BF100-1030是用RV1B5等位基因构建的缬氨酸营养徐缓型。表6的数据显示BF100-1030在摇瓶中生成的缬氨酸比它的亲本菌株少。表7显示BF100-1030营养徐缓型的生长相对于表5中的营养缺陷型得到了改善。表7还显示营养徐缓型在微量发酵罐中生成的缬氨酸比亲本菌株少。
表在实施例部分中讨论了下面这些表格显示的数据。注意，术语“生长”指于660nm测量的光密度；术语“滴度”指氨基酸克数/升；术语“产量”由下列公式定义[(生成的赖氨酸克数/L)/(消耗的右旋糖克数/L)]*100；B4B＝通过化学诱变构建的缬氨酸营养缺陷型；LC10＝通过用pAL203Δ的i1vB缺失型等位基因取代染色体ilvB基因构建的缬氨酸营养缺陷型；BF100-1030＝通过用RV1B5渗漏型等位基因取代染色体ilvB基因构建的缬氨酸营养徐缓型。
序列表<110>Archer-Daniels-Midland公司Rayapati，P，JohnCrafton，Corey M.<120>氨基酸生产的代谢工程<130>1503.074PC01<140><141><150>US 60/146,379<151>1999-08-02<160>6<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1895<212>DNA<213>棒杆菌属之种<400>1ggagccagaa agtcgtgaat gtggcagctt ctcaacagcc cactcccgcc acggttgcaa 60gccgtggtcg atccgccgcc cctgagcgga tgacaggtgc aaaggcaatt gttcgatcgc 120tcgaggagct taacgccgac atcgtgttcg gtattcctgg tggtgcggtg ctaccggtgt 180atgacccgct ctattcctcc acaaaggtgc gccacgtctt ggtgcgccac gagcagggcg 240caggccacgc agcaaccggc tacgcgcagg ttactggacg cgttggcgtc tgcattgcaa 300cctctggccc aggagcaacc aacttggtta ccccaatcgc tgatgcaaac ttggactccg 360ttcccatggt tgccatcacc ggccaggtcg gaagtggcct gctgggtacc gacgctttcc 420aggaagccga tatccgcggc atcaccatgc cagtgaccaa gcacaacttc atggtcacca 480accctaacga cattccacag gcattggctg aggcattcca cctcgcgatt actggtcgcc 540ctggccctgt tctggtggat attcctaagg atgtccagaa cgctgaattg gatttcgtct 600ggccaccaaa gatcgacctg ccaggctacc gcccagtttc aacaccacat gctcgccaga 660tcgagcaggc agtcaagctg atcggtgagg 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权利要求
1.生产氨基酸X的微生物C，其中所述微生物C是由下列方法获得的(a)选择以百分比产量Y由右旋糖生成所述氨基酸的亲本微生物A；(b)通过选自下组的方法诱变所述亲本微生物A以产生微生物B(i)随机化学诱变；和(ii)ilvBN操纵子的rDNA诱变；(c)由步骤(b)选择一种或多种支链氨基酸亮氨酸、异亮氨酸、和缬氨酸营养缺陷型或营养徐缓型的至少一种经诱变微生物B；并(d)由步骤(c)选择以百分比产量Z由右旋糖生成所述氨基酸X的至少一种微生物C，其中所述百分比产量Z比所述百分比产量Y更高。
2.权利要求1的微生物C，其中氨基酸X选自下组(a)甘氨酸；(b)丙氨酸；(c)甲硫氨酸；(d)苯丙氨酸；(e)色氨酸；(f)脯氨酸；(g)丝氨酸；(h)苏氨酸；(i)半胱氨酸；(j)酪氨酸；(k)天冬酰胺；(l)谷氨酰胺；(m)天冬氨酸；(n)谷氨酸；(o)赖氨酸；(p)精氨酸；和(q)组氨酸。
3.权利要求2的微生物C，其中微生物A选自下组(a)棒杆菌属；(b)短杆菌属；和(c)大肠杆菌。
4.权利要求3的微生物C，其中微生物B是缬氨酸和异亮氨酸营养缺陷型或营养徐缓型。
5.权利要求3的微生物C，其中步骤(b)诱变是随机化学诱变。
6.权利要求3的微生物C，其中步骤(b)诱变是ilvBN操纵子的定点诱变。
7.具有下列特征的微生物棒杆菌属菌株(a)一种或多种支链氨基酸异亮氨酸、亮氨酸、和缬氨酸营养缺陷型或营养徐缓型；(b)在培养基中培养时生成选自下组的氨基酸(i)甘氨酸；(ii)丙氨酸；(iii)甲硫氨酸；(iv)苯丙氨酸；(v)色氨酸；(vi)脯氨酸；(vii)丝氨酸；(viii)苏氨酸；(ix)半胱氨酸；(x)酪氨酸；(xi)天冬酰胺；(xii)谷氨酰胺；(xiii)天冬氨酸；(xiv)谷氨酸；(xv)赖氨酸；(xvi)精氨酸；和(xvii)组氨酸；且(c)由右旋糖生成步骤(b)氨基酸的百分比产量为至少大约30％。
8.权利要求7的微生物，其特征还包括ilvBN操纵子中的突变。
9.权利要求8的微生物，其中ilvBN操纵子中的突变是缺失、插入、或点突变。
10.权利要求9的微生物，其中ilvBN操纵子中的突变特征为序列SEQ ID NO3或SEQ ID NO5。
11.具有NRRL保藏物编号B-30149的鉴定特征的微生物棒杆菌菌株。
12.具有NRRL保藏物编号B-30150的鉴定特征的微生物棒杆菌菌株。
13.提高氨基酸X产量的方法，包括(a)选择以百分比产量Y由右旋糖生成所述氨基酸的亲本微生物A；(b)通过选自下组的方法诱变所述亲本微生物A以产生微生物B(i) 随机化学诱变；和(ii)ilvBN操纵子的rDNA诱变；(c)由步骤(b)选择一种或多种支链氨基酸亮氨酸、异亮氨酸、和缬氨酸营养缺陷型或营养徐缓型的至少一种经诱变微生物B；并(d)由步骤(c)选择以百分比产量Z由右旋糖生成所述氨基酸X的至少一种微生物C，其中所述百分比产量Z比所述百分比产量Y更高。
14.权利要求13的方法，其中氨基酸X选自下组(a)甘氨酸；(b)丙氨酸；(c)甲硫氨酸；(d)苯丙氨酸；(e)色氨酸；(f)脯氨酸；(g)丝氨酸；(h)苏氨酸；(i)半胱氨酸；(j)酪氨酸；(k)天冬酰胺；(l)谷氨酰胺；(m)天冬氨酸；(n)谷氨酸；(o)赖氨酸；(p)精氨酸；和(q)组氨酸。
15.权利要求14的方法，其中微生物A选自下组(a)棒杆菌属；(b)短杆菌属；和(c)大肠杆菌。
16.权利要求15的方法，其中微生物B是缬氨酸和异亮氨酸营养缺陷型或营养徐缓型。
17.权利要求15的方法，其中步骤(b)诱变是随机化学诱变。
18.权利要求15的方法，其中步骤(b)诱变是ilvBN操纵子的定点诱变。
19.用于生产氨基酸X的工艺，包括(a)在培养基中培养微生物C，其中所述微生物C是由下列方法获得的(i)选择以百分比产量Y由右旋糖生成所述氨基酸的亲本微生物A；(ii)通过选自下组的方法诱变所述亲本微生物A以产生微生物B(1)随机化学诱变；和(2)ilvBN操纵子的rDNA诱变；(iii)由步骤(ii)选择一种或多种支链氨基酸亮氨酸、异亮氨酸、和缬氨酸营养缺陷型的至少一种经诱变微生物B；并(iv)由步骤(iii)选择以百分比产量Z由右旋糖生成所述氨基酸X的营养缺陷型的至少一种微生物C，其中所述百分比产量Z比所述百分比产量Y更高；并(b)回收由所述微生物C生成的所述氨基酸X。
20.权利要求19的工艺，其中氨基酸X选自下组(a)甘氨酸；(b)丙氨酸；(c)甲硫氨酸；(d)苯丙氨酸；(e)色氨酸；(f)脯氨酸；(g)丝氨酸；(h)苏氨酸；(i)半胱氨酸；(j)酪氨酸；(k)天冬酰胺；(l)谷氨酰胺；(m)天冬氨酸；(n)谷氨酸；(o)赖氨酸；(p)精氨酸；和(q)组氨酸。
21.权利要求20的工艺，其中所述微生物A选自下组(a)棒杆菌属；(b)短杆菌属；和(c)大肠杆菌。
22.权利要求21的工艺，其中所述微生物B是缬氨酸和异亮氨酸营养缺陷型或营养徐缓型。
23.权利要求21的工艺，其中步骤(ii)诱变是随机化学诱变。
24.权利要求21的工艺，其中步骤(ii)诱变是ilvBN操纵子的定点诱变。
全文摘要
本发明涉及氨基酸的发酵生产,并提供其中有用的微生物、方法和工艺。本发明的微生物能够以比亲本菌株更高的效率将葡萄糖转变成除L－异亮氨酸、L－亮氨酸、和L－缬氨酸以外的其它氨基酸。本发明提供了经诱变而成为一种或多种支链氨基酸的合成营养缺陷型或营养徐缓型且经选择以比亲本菌株更高的百分比产量生成预期氨基酸的微生物。优选的微生物是生成L－赖氨酸的棒杆菌、短杆菌、或大肠杆菌。诱变是通过经典技术或rDNA方法学进行的。本发明的方法设计用于提高氨基酸产量,包括诱变亲本菌株,选择一种或多种支链氨基酸合成的营养缺陷型或营养徐缓型细胞,并选择以比亲本菌株更高的百分比产量由右旋糖生成预期氨基酸的支链氨基酸营养缺陷型或营养徐缓型。本发明的工艺设计用于生产氨基酸,包括在培养基中培养通过诱变亲本菌株并选择能够以比亲本菌株更高的效率将葡萄糖转变成除L－异亮氨酸、L－亮氨酸、和L－缬氨酸以外的其它氨基酸的变体获得的微生物。
文档编号C12N15/01GK1367823SQ00811165
公开日2002年9月4日 申请日期2000年8月2日 优先权日1999年8月2日
发明者P·J·拉雅帕蒂, C·M·卡拉夫顿 申请人:阿彻·丹尼尔斯－米德兰公司