专利名称：修饰α1,2－岩藻糖转移酶基因及α1,2－岩藻糖转移酶和含岩藻糖糖类的制造方法
技术领域：
本发明是关于修饰α1，2-岩藻糖转移酶基因、使用该基因的α1，2-岩藻糖转移酶的制造方法及含岩藻糖糖类的制造方法。
背景技术：
α1，2-岩藻糖转移酶基因，已经得到了来自动物的〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，6674(1990)、Immunogenetics，44，76(1996)、J.Biol.Chem.，264，3436(1989)、J.Biol.Chem.，264，11158(1989)、J.Biol.Chem.，267，2737(1992)、J.Biol.Chem.，270，8844(1995)、J.Biol.Chem.，270，4640(1995)、J.Biol.Biochem.，118，541(1995)、J.Biol.Chem.，271，16975(1996)〕，但没有大肠杆菌等微生物使该基团作为有活性的蛋白质表达的实例。
另一方面，在微生物中，从幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)得到了α1，2-岩藻糖转移酶基因，有关于使用该基因在大肠杆菌中表达α1，2-岩藻糖转移酶的报告，但即使该基因在强启动子支配下，该酶活性也是非常弱的〔Microbiology，145，3245(1999)〕。
含岩藻糖的糖链作为血型抗原糖链是已知的，近年来，已经明确其结构伴随细胞的化癌变化〔Anal.Bichem.，251，89(1997)〕。因此预期其可以作为肿瘤标记物或药品应用。另外，在人乳中含有丰富的寡糖，含岩藻糖的糖链(岩藻糖基乳糖是主要成分之一)在总寡糖中占70％以上〔Glycobiology，8，615(1998)〕。已经知道，具有也包括在该寡糖中的Fucα1-2Gal结构的糖链，抑制白色假丝酵母(Candida albicans)的感染〔Infect.Immun.，59，1650(1991)〕，因此认为含岩藻糖的糖链是安全的感染预防药的有前途的候补。
但是，关于岩藻糖基乳糖等含岩藻糖的糖链的制造，已报道有从人乳的提取法(J.Chromatogr.，211，170(1981)、使用转基因动物的生产法〔J.Biol.Chem.，270，29515(1995)、USP 5700671〕和使用酶的方法〔USP 5583042〕，但是在成本上或生产率上都有问题，还没有确立工业的制造方法。
发明的公开本发明的目的是提供含岩藻糖的糖类的工业制造方法。
本发明人为了实现上述目的进行了深入研究。结果是通过修饰编码该α1，2-岩藻糖转移酶的DNA的碱基序列，使用微生物，成功地大量生产了到目前为止在难以大肠杆菌等微生物中作为有活性的蛋白质进行大量表达的α1，2-岩藻糖转移酶，并确立了使用该酶的含岩藻糖糖类的工业制造方法。进而，通过对该酶的性质进行种种研究发现，该酶不仅使用Lewis X和N-乙酰乳糖胺作为接纳体糖链，而且也使用乳糖作为受体。基于该发现完成了本发明。
即，本发明是关于以下的(1)～(29)。
(1)一种DNA，具有下述碱基序列，即在编码来自幽门螺旋杆菌的具有α1，2-岩藻糖转移酶活性的蛋白质的DNA中，从存在于该DNA中的〔a〕Poly-C序列、〔b〕类似TAA的重复序列、〔c〕AAAAAAG序列中选择的碱基序列中，有1个以上碱基序列中的1个以上碱基缺失、取代或者添加得到的碱基序列，而且该DNA编码具有α1，2-岩藻糖转移酶活性的蛋白质。
(2)如(1)中记载的DNA，其中取代是修饰成在表达权利要求1所述的DNA的宿主细胞中使用频率高的密码子的取代。
(3)一种DNA，具有下述碱基序列，即在编码来自幽门螺旋杆菌的具α1，2-岩藻糖转移酶活性的蛋白质的DNA中，将1个以上的密码子修饰成在表达该DNA的宿主细胞中使用频率高的密码子而得到的碱基序列。
(4)如(3)中记载的DNA，其中修饰是从存在于编码来自幽门螺旋杆菌的具有α1，2-岩藻糖转移酶活性的蛋白质的DNA中的〔a〕Poly-C序列、〔b〕类似TAA的重复序列、〔c〕AAAAAAG序列中选择的碱基序列中，1个以上碱基序列中的修饰。
(5)如(3)中记载的DNA，该DNA具有在编码来自幽门螺旋杆菌的具有α1，2-岩藻糖转移酶活性的蛋白质的DNA中，全部密码子被修饰成在表达该DNA的宿主细胞中使用频率高的密码子而得到的碱基序列。
(6)序列号1记载的碱基序列表示的DNA。
(7)一种DNA，是由序列号1记载的碱基序列表示的DNA中，1个以上碱基缺失、取代或者添加得到的碱基序列构成、而且编码具有α1，2-岩藻糖转移酶活性的蛋白质。
(8)一种重组DNA，通过将从(1)～(7)中的任一项记载的DNA中选择的DNA连接在载体上得到。
(9)一种转化体，通过将(8)中记载的重组DNA导入宿主细胞中得到。
(10)如(9)中记载的转化体，其特征是，宿主细胞是微生物。
(11)如(10)中记载的转化体，其特征是，微生物是属于埃希氏杆菌属的微生物。
(12)如(11)中记载的转化体，其特征是，属于埃希氏杆菌属的微生物是大肠埃希氏杆菌(大肠杆菌Escherichia coli)。
(13)具有α1，2-岩藻糖转移酶活性的蛋白质的制造方法，其特征是，在培养基中培养从(9)～(12)中的任一项记载的转化体中选择的转化体，在该培养物中生成具有α1，2-岩藻糖转移酶活性的蛋白质并积累，从该培养物中采集该蛋白质。
(14)含岩藻糖的糖类的制造方法，其特征是，使用从(9)～(12)中的任一项记载的转化体中选择的转化体的培养液或者该培养液的处理物作为酶源，使该酶源、接纳体糖类和鸟苷二磷酸岩藻糖(以下，简称为GDP-岩藻糖)存在于水性介质中，在该水性介质中通过α1，2键使岩藻糖转移到接纳体糖类上，生成含岩藻糖的糖类并积累，从该水性介质中采集含岩藻糖的糖类。
(15)如(14)中记载的含岩藻糖的糖类的制造方法，其特征是，包括以具有从鸟苷-5’-三磷酸(以下，简称为GTP)的前体物质生成GTP能力的微生物的培养液或者该培养液的处理物、具有从糖和GTP生成GDP-岩藻糖能力的微生物的培养液或者该培养液的处理物、以及从(9)～(12)中的任一项记载的转化体中选择的转化体的培养液或者该培养液的处理物作为酶源使用，使这些酶源、上述前体物质、糖和接纳体糖类存在于水性介质中，在该水性介质中生成含岩藻糖的糖类并积累，从该水性介质中采集含岩藻糖的糖类。
(16)如(14)或(15)中记载的含岩藻糖的糖类的制造方法，其中，接纳体糖类是在非还原末端具有半乳糖的包含10个糖以下的寡糖的糖类。
(17)如(16)中记载的含岩藻糖的糖类的制造方法，其特征是，寡糖是乳糖、N-乙酰乳糖胺、Lewis X、或者Lewis a。
(18)如(15)中记载的含岩藻糖的糖类的制造方法，其特征是，含岩藻糖的糖类是岩藻糖基乳糖、岩藻糖基N-乙酰乳糖胺、Lewis Y、或者Lewis b。
(19)如(14)或者(15)中记载的含岩藻糖的糖类的制造方法，其中，培养液的处理物是从培养液的浓缩物、培养液的干燥物、离心分离培养液得到的菌体、该菌体的干燥物、该菌体的冷冻干燥物、该菌体的表面活性剂处理物、该菌体的超声波处理物、该菌体的机械磨碎物、该菌体的溶剂处理物、该菌体的酶处理物、该菌体的蛋白质级分物、该菌体的固定化物或者从该菌体中提取而得到的酶标准品。
(20)如(15)中记载的含岩藻糖的糖类的制造方法，其中，前体物质是鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤、鸟苷、黄苷、肌苷、鸟苷-5’-一磷酸、黄苷-5’-一磷酸、或者肌苷-5’-一磷酸。
(21)如(15)中记载的含岩藻糖的糖类的制造方法，其中，糖是从葡萄糖、果糖和甘露糖中选择的糖。
(22)如(15)中记载的含岩藻糖的糖类的制造方法，其中，具有从GTP的前体物质生成GTP能力的微生物是从属于棒状杆菌属的微生物中选择的微生物。
(23)如(22)中记载的含岩藻糖的糖类的制造方法，其中，属于棒状杆菌属的微生物是产氨棒状杆菌。
(24)如(15)中记载的含岩藻糖的糖类的制造方法，其中，具有从糖和GTP生成GDP-岩藻糖能力的微生物是由1种以上的微生物构成的。
(25)如(24)中记载的含岩藻糖的糖类的制造方法，其中，微生物是从属于埃希氏杆菌属或者棒状杆菌属的微生物中选择的微生物。
(26)如(25)中记载的含岩藻糖的糖类的制造方法，其中，属于埃希氏杆菌属的微生物是大肠埃希氏杆菌。
(27)如(25)中记载的含岩藻糖的糖类的制造方法，其中，属于棒状杆菌属的微生物是产氨棒状杆菌。
(28)如(15)中记载的含岩藻糖的糖类的制造方法，其中，具有从糖和GTP生成GDT-岩藻糖能力的微生物是从葡糖激酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷酸转移酶、葡萄糖磷酸变位酶、果糖磷酸激酶、GDP-甘露糖4，6-脱水酶以及GKDM差向异构酶/还原酶中选择的1种以上的酶活性强的微生物。
(29)如(28)中记载的含岩藻糖的糖类的制造方法，其中，微生物由1种以上的微生物构成，该微生物含有DNA片段和载体构成的重组DNA，该DNA片段含有从编码葡糖激酶的基因(以下，简称为glk基因)、编码磷酸甘露糖变位酶的基因(以下，简称为manB基因)、编码甘露糖-1-磷酸鸟苷酸转移酶的基因(以下，简称为manC基因)、编码葡萄糖磷酸变位酶的基因(以下，简称为pgm基因)、编码果糖磷酸激酶的基因(以下，简称为pfk基因)、编码GDP-甘露糖4，6-脱水酶的基因(以下，简称为gmd基因)以及编码GKDM差向异构酶和/或还原酶的基因(以下，简称为wcaG基因)中选择的1种以上的基因。
(30)如(29)中记载的含岩藻糖的糖类的制造方法，其中，glk基因、manB基因、manC基因、pgm基因、pfk基因、gmd基因和wcaG基因是来自大肠埃希氏杆菌的基因。
本发明DNA，是对编码来自幽门螺旋杆菌的具有α1，2-岩藻糖转移酶活性的蛋白质的DNA进行修饰得到的DNA，例如，可举出以下的DNA等(1)具有下述碱基序列的DNA，即在编码来自幽门螺旋杆菌的具α1，2-岩藻糖转移酶活性的蛋白质的DNA中，从存在于该DNA的〔a〕被看作超易变区域的Poly-C序列、〔b〕被看作突变热点的类似TAA的重复序列、〔c〕被看作容易发生移码的AAAAAAG序列中选择的碱基序列中，1个以上碱基序列中的1个以上碱基缺失、取代或者添加碱基序列，而且该DNA编码具有αl，2-岩藻糖转移酶活性的蛋白质。
(2)如上述(1)中记载的DNA，其中取代是修饰成在表达(1)中记载的DNA的宿主细胞中使用频率高的密码子的取代。
(3)具有下述碱基序列的DNA，即在编码来自幽门螺旋杆菌的具有α1，2-岩藻糖转移酶活性的蛋白质的DNA中，将1个以上的密码子修饰成在表达该DNA的宿主细胞中使用频率高的密码子而得到的碱基序列。
(4)如上述(3)中记载的DNA，其中修饰是从存在于编码来自幽门螺旋杆菌的具有α1， 2-岩藻糖转移酶活性的蛋白质的DNA中的〔a〕被看作超易变区域的Poly-C序列、〔b〕被看作突变热点的类似TAA的重复序列、〔c〕被看作容易发生移码的AAAAAAG序列中选择的碱基序列中，在1个以上碱基序列中的修饰。
(5)如上述(3)中记载的DNA，该DNA具有下述碱基序列，即在编码来自幽门螺旋杆菌的具有α1，2-岩藻糖转移酶活性的蛋白码的DNA中，全部密码子被修饰成在表达该DNA的宿主细胞中使用频率高的密码子而得到的碱基序列。
(6)由上述(1)～(5)中的任一项记载的碱基序列构成的DNA的碱基中1个以上碱基缺失、取代或者添加得到的碱基序列构成，而且编码α1，2-岩藻糖转移酶活性的蛋白质的DNA，具有和来自幽门螺旋杆菌的α1，2-岩藻糖转移酶基因的碱基序列不同的碱基序列的DNA。
所谓在(a)中记载的Poly-C序列是至少8个以上的C连续连接的碱基序列，所谓在(b)中记载的类似TAA的重复序列是从TAA、GAA、AAA、TAG或者TGA序列中选择的序列以任意的顺序至少3次以上连续存在的破基序列。
作为在上述(2)～(5)中记载的宿主细胞，细菌，酵母，动物、昆虫细胞、植物细胞等，只要能够表达本发明的DNA，都可以使用。所谓使用频率高的密码子，是在该宿主细胞中对应于各氨基酸的密码子的使用频率至少是10％以上的密码子，优选可举出使用频率是20％以上的密码子。
上述的1个以上碱基缺失、取代或者添加得到的DNA，能够使用在《分子克隆实验手册》Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版(1989)(以下，简称为Molecular Cloning第2版)或者《最新分子生物学实验方法汇编》CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons(1987-1997)等中记载的定向位点变异。在该变异导入DNA中，在编码的蛋白质中产生的氨基酸的缺失、取代或者添加数没有特别的限制，是利用上述定向位点变异等公知的方法能够缺失、取代或者添加程度的数，例如可举出1个至20个，更好是1个至15个，最好是1个至5个。
另外，为了使本发明的DNA编码具有α1，2-岩藻糖转移酶活性的蛋白质，优选在使用BLAST〔J.Mol.Biol.，215，403(1990)〕或FASTA(Method inEnzymology，183，63-69)等解析软件进行计算时，该变异导入DNA是编码具有和序列号1记载的氨基酸序列至少60％以上、通常是80％以上的同源性的蛋白质的DNA。
作为本发明的DNA的制备方法，可举出使用编码来自幽门螺旋杆菌的具有α1，2-岩藻糖转移酶活性的蛋白质的DNA，采用例如Molecular Cloning第2版、Current Protocols in Molecular Biology、Nucl.Acids Res.，10，6487(1982)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6409(1982)、Gene，34，315(1985)、Nucl.Acids Res.，13，4431(1985)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)等中记载的定向位点变异，进行制备的方法。另外，作为使用合成DNA的方法，例如可举出(1)按照常规方法〔PCR Protocols，Humana Press，(1993)等〕，使用PCR法，人工地合成DNA的方法，(2)制备100bp左右的合成DNA的有义链和反义链，在退火后，用DNA连接酶连接以便履盖作为目的的DNA全长的方法。
作为使用本发明的DNA制造具有α1，2-岩藻糖转移酶活性的蛋白质的方法，例如可举出按照Molecular Cloning第2版记载的方法，将使用上述方法制备的编码该蛋白质的DNA与载体DNA连接制备重组DNA，使用该重组DNA，按照Molecular Cloning第2版己载的方法转化细胞，在该转化细胞能够生长的适当培养基中培养该转化细胞，在该培养液中使该蛋白质积累，从该培养基中得到该蛋白质的方法。为了从该培养液采集该蛋白质，在使该蛋白质可溶化后，有利用离子交换、凝胶过滤或者疏水层析法等，或者将该层析法组合，进行分离纯化的方法。
使用生产该蛋白质的转化体的培养液或培养液的处理物、或者已纯化的该蛋白质作为酶源，使接纳体糖类、GDP-岩藻糖在水性介质中共存，就能够得到本发明的含岩藻糖的糖类。
另外，也可以使具有从前体生产GTP能力的微生物的培养液或者培养液处理物、和具有从糖和GTP生产GDT-岩藻糖能力的1种以上的微生物构成的微生物的培养液或者培养液处理物在水性介质中共存而得到GDP-岩藻糖，使用该GDP-岩藻糖也能够得到本发明的含岩藻糖的糖类。在此所说的前体，只要能通过微生物转换成GTP，就没有特别的限制，但优选的可举出鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤、鸟苷、黄苷、肌苷、鸟苷-5’-一磷酸、黄苷-5’-一磷酸、肌苷-5’-一磷酸。糖只要是能够转变为GDP-岩藻糖的糖，就没有特别的限制，但优选的可举出从葡萄糖、果糖和甘露糖中选择的糖。接纳体糖类，只要是能成为本发明DNA编码的具有α1，2-岩藻糖转移酶活性的蛋白质的底物的接纳体糖类，就没有特别的限制，但优选的可举出在非还原末端具有半乳糖的糖，作为更优选的底物，可举出乳糖、N-乙酰乳糖胺、LewisX或者Lewisa。
作为具有从前体生产GTP能力的微生物，只要是具有该能力的微生物，就没有特别的限制，但优选的可举出属于棒状杆菌属的微生物，最优选的可举出产氨棒状杆菌。作为具有从糖和GTP生产GDP-岩藻糖能力的微生物，可举出从葡糖激酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷酸转移酶、葡萄糖磷酸变位酶、果糖磷酸激酶、GDP-甘露糖4，6-脱水酶以及GKDM差向异构酶/还原酶中选择的1种以上酶的活性强的微生物，优选的是由保有以下DNA片段和载体构成的重组DNA的1种以上的微生物构成的微生物，该DNA片段和载体构成的重组DNA含有从葡糖激酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷酸转移酶、葡萄糖磷酸变位酶、果糖磷酸激酶、GDP-甘露糖4，6-脱水酶以及GKDM差向异构酶/还原酶中选择的1种以上酶的基因，更优选具有来自大肠埃希氏杆菌的glk基因、manB基因、manC基因、pgm基因、pfk基因、gmd基因和wcaG基因的1种以上的重组大肠杆菌。
可以按照使用活性炭或离子交换树脂的普通的层析法获得生成的含岩藻糖的糖类。
以下，详细地说明本发明。
〔1〕表达具有α1，2-岩藻糖转移酶活性的蛋白质的转化株的制备(1)本发明的DNA的制备本发明的DNA可以使用以下所示的方法制备。首先，选择α1，2-岩藻糖转移酶的氨基酸序列。作为该酶的氨基酸序列，只要是具有该酶活性的氨基酸序列，无论什么的氨基酸序列都可以使用，例如，可举出在以序列号2表示的GenBank等数据库登记的来自大肠埃希氏杆菌的α1，2-岩藻糖转移酶的氨基酸序列等。接着，使用在表达该酶活性的宿主细胞中使用频率高的密码子，设计编码具有该酶活性的蛋白质的DNA。例如在大肠杆菌用作宿主细胞时，考虑在大肠杆菌的基因的碱基序列中可见的密码子的使用频率〔Kazusa密码子用途数据库Codon Usage database at kazusa(http//www.kazusa.or.jp/codon)〕，通过使所选择的该酶的氨基酸序列转换成DNA序列，以便具有使用频率最高的密码子，就能够设计本发明的DNA。
另外，可以设计下述DNA，即在所选择的α1，2-岩藻糖转移酶的氨基酸序列是来自幽门螺旋杆菌时，从编码该氨基酸序列的DNA中可见的(i)Poly-C序列、(ii)类似TAA重复序列、(iii)AAAAAAG序列中选择的碱基序列中，在1个以上碱基序列中1个以上碱基缺失、取代或者添加而得到的DNA，而且编码具有该酶活性的蛋白质。例如，在上述的幽门螺旋杆菌是幽门螺旋杆菌UA802时，作为对应于上述的(i)、(ii)和(iii)的序列，可举出在序列号27记载的碱基序列中，碱基号397～408、411～434和430～436及552～558表示的碱基序列。
通过将从(i)、(ii)和(iii)选择的碱基序列中的密码子转换成在表达本发明的DNA的宿主细胞中使用频率最高的密码子，也可进行上述取代，例如，对序列号1记载的碱基序列中碱基号397～408和411～434表示的碱基序列的取代。
作为如上所述设计成的DNA，例如可举出具有序列号1记载的碱基序列的DNA，该碱基序列是以来自幽门螺旋杆菌UA802的α1，2-岩藻糖转移酶基因为基础设计的。
接着，基于设计成的碱基序列，使用自动DNA合成仪(PerSeptive Biosystem公司制8905型DNA合成装置)，合成从5’末端侧起由40～150碱基长组成的合成DNA，以便相邻的合成DNA相互具有10～100碱基的重复序列，而且这些重复序列用有义链、反义链形成交互。作为这样的合成DNA，例如可举出具有序列号3～16记载的碱基序列的DNA，该碱基序列是以在序列号1记载的碱基序列构成的DNA为基础设计的。使用上述的合成DNA，按照常规方〔法例如PCR Protocols，HumanaPress，(1993)等〕以PCR法，人工地合成本发明的DNA。PCR的条件，当使用该合成DNA进行PCR反应时，只要是能提供和成为该合成DNA的设计基础的本发明DNA的相同长度扩增片段的条件，就没有特别的限制，例如在使用具有序列号3～16记载的破基序列的DNA时，可举出将94℃30秒、50℃30秒、74℃60秒的循环进行30个循环的条件。
通过在位于两端的合成DNA的5’末端导入适当的限制酶的识别序列，也能够容易地将本发明的DNA克隆在载体上。作为这样的合成DNA，例如可举出在使用具有上述序列号3～16记载的碱基序列的DNA进行PCR时能够使用的、具有序列号17和序列号18记载的碱基序列的DNA组(set)。
(2)本发明的DNA的克隆化及碱基序列的确认将以上述(1)制备的本发明DNA直接或者用适当的限制酶等切断后，利用常规方法与载体连接。
作为连接该DNA的载体，只要是在大肠杆菌K12株中能够自主复制的载体，噬菌体载体、质粒载体等都可以使用，具体地可举出ZAP Express〔Stratagene公司制，Stratagies，5，58(1992)〕、pBluescript II SK(+)〔Nucleic AcidsResearch，17，9494(1989)〕、λzap II(Stratagene公司制)、λgt10、λgt11〔DNA Cloning，A practical Approach，1，49(1985)〕、λTriplEx(ClontechLaboratories公司制)、λBlueMid(Clontech Laboratories公司制)、λExCell(Pharmacia公司制)、pT7T318U(Pharmacia公司制)、pcD2〔Mol.Cell，Boil.，3，280(1983)〕、pUCl8〔Gene，33，103(1985)〕等。
作为将(1)中获得的本发明DNA与该载体连接而得到的重组DNA的宿主中使用的大肠杆菌，只要是属于大肠杆菌的微生物，都可以使用，具体地可举出大肠埃希氏杆菌(Escherichia Coli)XLl-BlueMRF’〔Stratagene公司制。Strategies，5，81(1992)〕、大肠埃希氏杆菌C600〔Genetics，39，440(1994)〕、大肠埃希氏杆菌Y1088〔Science，222，778(1983)〕、大肠埃希氏杆菌Y1090〔Science，222，778(1983)〕、大肠埃希氏杆菌NM522〔J.Mol.Biol.，166，1(1983)〕、大肠埃希氏杆菌K802〔J.Mol.Biol.，16，118(1966)〕、大肠埃希氏杆菌JM105〔Gene，38，275(1985)〕等。
作为重组DNA的导入方法，只要是向上述宿主细胞中导入DNA的方法，都可以使用，例如，可举出使用钙离子的方法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，69，2110(1972)〕、原生质体法(特开昭63-248394)、电穿孔法〔Nucleic AcidsResearch，16，6127(1988)〕等。
从像上述那样得到的转化体中提取重组DNA，可以确定包含在该重组DNA中的本发明DNA的碱基序列。为了确定碱基序列，可以使用通常使用的碱基序列解析方法，例如使用双脱氧法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74，5463(1977)〕或者373A·DNA测序仪(Parkin-Elmer公司制)等碱基序列分析装置。可以确认，像这样在(1)中获得的本发明的DNA和作为合成该DNA的基础而设计的DNA是相同的。
作为具有像上述那样获得的重组DNA的转化体，例如可举出保持质粒DNA的大肠杆菌，该质粒DNA具有以序列号1表示的碱基序列，以及大肠埃希氏杆菌NM522/pGT35。
〔2〕使用本发明的DNA制备具有α1，2-岩藻糖转移酶活性的蛋白质。
使用Molecular Cloning第2版或Current Protocols in MolecularBiology等中记载的方法等，例如采用以下的方法，使本发明的DNA在宿主细胞中表达，就能够制造本发明的DNA编码的具有α1，2-岩藻糖转移酶活性的蛋白质。
即，以本发明的DNA为基础，根据需要，制备包含编码该蛋白质的部分的适当长度的DNA片段，制备将该DNA片段插入适当表达载体的启动子下游的重组DNA。通过将该重组DNA导入适合于该表达载体的宿主细胞中而获得转化体，在培养基中培养该转化株，使之在该培养液中积累具有α1，2-岩藻糖转移酶活性的蛋白质，可以制造该蛋白质。
作为宿主细胞，可以是细菌、酵母、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等，只要能够表达作为目的的基因，都可以使用。
作为表达载体，使用在宿主细胞中能够自主复制或者能够整合到染色体DNA中，在能够转录编码本发明蛋白质的DNA的位置含有启动子的表达载体。
在以细菌等原核生物作为宿主细胞使用时，优选含有编码本发明的蛋白质的DNA构成的重组DNA，在原核生物中能够自主复制，同时是由启动子、核糖体结合序列、本发明的DNA、转录终止序列构成的载体。也可以含有控制启动子的基因。
作为表达载体，例如可举出pBTrp2、pBtacl、pBtac2(都由BoehringerMannheim公司出售)、pKK233-2(Pharmacia公司制)、pSE280(Invitrogen公司制)、pGEMEX-1(Promega公司制)、pQE-8(QIAGEN公司制)、pKYP10(特开昭58-110600)、pKYP200〔Agric.Biol.Chem.，48，669(1984)〕、pLSAl〔Agric.Biol.Chem.，53，277(1989)〕、pGELl〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，4306(1985)〕、pBluescript II SK(-)(Stratagene公司制)、pTrS30〔由大肠埃希氏杆菌JM109/pTrS30(PERM BP-5407)制得〕、pTrS32〔由大肠埃希氏杆菌JM109/pTrS32(FERMBP-5408)制得〕、pGHA2〔由大肠埃希氏杆菌IGHA2(FERM BP-400)制得，特开昭60-221091〕、pGKA2〔由大肠埃希氏杆菌IGHA2(FERM BP-6798)制得，特开昭60-221091〕、pTerm2(US4686191、US4939094、US5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400〔J.Bacteriol.，172，2392(1990)〕、pGEX(Pharmacia公司制)、pET system(Novagen公司制)等。
作为启动子，只要是在宿主细胞中发挥功能的启动子，都可以使用。例如可举出trp启动子(Ptrp)、lac启动子、PL启动子、PR启动子、T7启动子等来自大肠杆菌或噬菌体等的启动子。另外，也可以使用人为地设计修饰的启动子，如2个Ptrp串连的启动子(Ptrp×2)、tac启动子、lacT7启动子、let I启动子等。
最好使用将是核糖体结合序列的SD(Shine-Dalgarno)序列和起始密码子之间调节至适当的距离(例如6～18碱基)的质粒。
在本发明的重组DNA中，对于本发明的DNA的表达来说，转录终止序列不一定是必要的，但最好在结构基因的紧下方配置转录终止序列。
作为宿主细胞，可举出属于埃希氏杆菌属(Escherichia)、沙雷氏菌属(Serratia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、微杆菌属(Microbacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)的微生物，例如大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)XLl-Blue、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)XL2-Blue、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)DHl、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)MC1000、大肠埃希氏杆菌(Escherichiacoli)KY3276、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)W1485、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)JM109、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)HB101、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)No.49、大肠埃希氏杆菌(Escherichiacoli)W3110、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)NY49、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)GI698、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)TB1、无花果沙雷氏菌(Serratia ficaris)、居泉沙雷氏菌(Serratia fonticola)、解凝沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)、粘质沙雷氏菌(Serratis marcescens)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefacienes)、产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammmoniagenes)、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、解糖短杆菌(Brevibacteriumsaccharolyticum)ATCC14066、黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)ATCC14067、乳发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)ATCC13869、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC13032、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC13869、嗜乙酰乙酸棒状杆菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)ATCC13870、产氨微杆菌(Microbacteriumammoniaphilum)ATCC15354、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、假单胞菌属(Pseudomonas)D-0110等。
作为重组DNA的导入方法，只要是向上述宿主细胞导入DNA的方法，都可以使用，例如可举出使用钙离子的方法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，69，2110(1972)〕、原生质体法(特开昭63-248394)，或者Gene，17，107(1982)或Mol.Gen.Genet.，168，111(1979)中记载的方法等。
在以酵母作为宿主细胞使用时，作为表达载体，例如可举出YEpl3(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)、pHSl9、pHSl5等。
作为启动子，只要是在酵母菌株中能够表达的启动子，都可以使用，例如可举出已糖激酶等糖酵解系统的的基因的启动子、PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子、gal 1启动子、gal 10启动子、热休克多肽启动子、MFα1启动子、CUP启动子等。
作为宿主细胞，可举出属于酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)、丝孢酵母属(Trichosporon)、许旺氏酵母属(Schwanniomyces)、毕赤氏酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)的微生物，例如，酿酒酵母(Saccharomyces cereivisae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)、茁芽丝孢酵母(Trichosporon pullulans)、河库许旺氏酵母(Schwanniomyces alluvius)、产朊假丝酵母(Candida utilis)等。
作为重组DNA的导入方法，只要是在酵母中导入DNA的方法，都可以使用，例如，电穿孔法〔Methods Enzymol.，194，182(1990)〕、原生质球法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1929(1978)〕、乙酸锂法〔J.Bacteriol.，153，163(1983)〕、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1929(1978)中记载的方法等。
在以动物细胞作为宿主使用时，作为表达载体，例如可举出pcDNAI、pcDM8(Funakoshi公司制)、pAGE107〔特开平3-22979，Cytotechnology，3，133(1990)〕、pAS3-3(特开平2-227075)、pCDM8〔Nature，329，840(1987)〕、pcDNAI/Amp(Invitrogen公司制)、pREP4(Invitrogen公司制)、pAGE103〔J.Biochem.，101，1307(1987)〕、pAGE210等。
作为启动子，只要是在动物细胞中发挥功能的，都可以使用，例如可举出巨细胞病毒(CMV)的IE(立即早期)基因的启动子、SV40的初期启动子、逆转录病毒的启动子、金属硫蛋白启动子、热休克启动子、SRα启动子等。也可以和启动子一起使用人CMV的IE基因的增强子。
作为宿主细胞，可举出人细胞Namalwa细胞、猴细胞COS细胞、中国仓鼠细胞CHO细胞、HBT5637(特开昭63-299)等。
作为将重组DNA导入动物细胞的方法，只要是向动物细胞中导入DNA的方法都可以使用，例如可举出电穿孔法〔Cytotechnology，3，133(1990)〕、磷酸钙法(特开平2-227075)、脂转染法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，7413(1987)〕、在Virology，52，456(1973)中描述的方法等。
以昆虫细胞作为宿主使用时，例如采用在Current Protocols in MolecularBiology、《杆状菌毒载体实验手册》(Baculovirus Expressicn Vectors，ALaboratory Mannual)，W.H.Freeman and Company，纽约(1992)、Bio/Technology，6，47(1988)等中记载的方法，能够表达多肽。
即，将重组基因导入载体和杆状病毒一起导入昆虫细胞，在昆虫细胞培养上清液中得到重组病毒后，再用重组病毒感染昆虫细胞，就能够表达蛋白质。
作为在该方法中使用的基因导入载体，例如可举出pVL1329、pVL1393、pBlueBacIII(都是Invitrogen公司制)等。
作为杆状病毒，例如可以使用在夜盗蛾科昆虫中感染的病毒-苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等。
作为昆虫细胞，可以使用是草地夜蛾(Spodoptera fruqiperda)的卵巢细胞Sf9、Sf21〔Baculovirus Expression Vectors，A Laboratory Manual，W.H.Freeman and Company，纽约(1992)〕、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)卵巢细胞的High 5(Invitrogen公司制)等。
为了制备重组病毒，作为向昆虫细胞同时导入上述重组基因导入载体和上述杆状病毒的方法，例如可举出磷酸钙法(特开平2-227075)、脂转染法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，7413(1987)〕等。
在以植物细胞作为宿主细胞使用时，作为表达载体，例如可举出Ti质粒、烟草花叶病毒等。
作为启动子，只要是在植物细胞中能够表达的启动子，都可以使用，例如可举出花椰菜花叶病毒(CaMV)的358启动子、水稻肌动蛋白1启动子等。
作为宿主细胞，可举出烟草、马铃薯、番茄、胡萝卜、大豆、油菜、苜蓿、水稻、小麦、大麦等植物细胞等。
作为重组DNA的导入方法，只要是向植物细胞中导入DNA的方法，都可以使用，例如可举出使用土壤杆菌(特开昭59-140885、特开昭60-70080、WO94/00977)、电穿孔法(特开昭60-251887)、基因枪的方法(特许第2606856、特许第2517813)等。
在培养基中培养像上述那样得到的本发明的转化体，在培养物中使本发明的蛋白质生成并积累，由该培养物中采集，可以制造本发明的蛋白质。
在培养基中培养本发明的转化体的方法，可以按照在宿主的培养中使用的普通方法进行。
在本发明的转化体是以大肠杆菌等原核生物或者酵母等真核生物作为宿主而得到的转化体时，作为培养该转化体的培养基，只要是含有该转化体能够同化的碳源、氮源、无机盐类等，能有效地进行该转化体的培养的培养基，可以使用天然培养基，合成培养基中的任一种。
作为碳源，只要是该转化体能够同化的就可以，可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖、含有这些糖的糖蜜、淀粉或者淀粉水解物等碳水化合物，乙酸、丙酸等有机酸，乙醇、丙醇等醇类等。
作为氮源，可以使用氨，氯化铵、硫酸铵、乙酸铵、磷酸铵等无机酸或者有机酸的铵盐，其他含氮化合物，以及蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、大豆粕和大豆粕水解物、各种发酵菌体及其消化物等。
作为无机盐，可以使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。
在振荡培养或者深度通气搅拌培养等的需氧条件下进行培养。培养温度可以是15～40℃，培养时间，通常是16小时～7天。培养中的pH最好保持在3.0～9.0。可以使用无机酸或者有机酸、碱液、尿素、碳酸钙、氨等进行pH的调整。
另外，在培养中根据需要，在培养基中也可以添加氨苄青霉素、四环素或氯霉素等抗生素。
在培养通过以诱导性的启动子作为启动子使用的重组DNA进行了转化的微生物时，根据需要在培养基中也可以添加诱导物。例如，在培养通过使用lac启动子的重组DNA进行了转化的微生物时，在培养基中可以添加异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷等，在培养通过使用trp启动子的重组DNA进行了转化的微生物时，在培养基中可以添加吲哚丙烯酸等。
作为培养以动物细胞作为宿主而得到的转化体的培养基，可以使用一般使用的RPMI1640培养基〔J.Am.Med.Assoc.，199，519(1967)〕、Eagle氏MEM培养基〔Science，122，501(1952)〕、Dulbecco改良MEM培养基〔Virology，8，396(1959)〕、199培养基〔Proc.Soc.Biol.Med.，73，1(1950)〕、或者在这些培养基中添加胎牛血清等的培养基等。
培养通常在pH6～8、30～40℃、存在5％的CO2等的条件下，进行1～7天。
另外，在培养中根据需要，在培养基中也可以添加卡那霉素、青霉素等抗生素。
作为培养以昆虫细胞作为宿主而得到的转化体的培养基，可以使用一般使用的TNM-FH培养基(Pharmingen公司制)、Sf-900 II SFM培养基(LifeTechnologies公司制)、ExCe11400、Exce11405(都是JRH Biosciences公司制)、Grace氏昆虫培养基〔Nature，195，788(1962)〕等。
培养通常在pH6～7、25～30℃等条件下，进行1～5天。
另外，在培养中根据需要，在培养基中也可以添加庆大霉素等抗生素。
以植物细胞作为宿主得到的转化体，可以以细胞或者分化成植物的细胞或器官进行培养。作为培养该转化体的培养基，可以使用一般使用的Murashige-Skoog(MS)培养基、White培养基、或者在这些培养基中添加生长素、细胞因子、植物激素的培养基等。
通常在pH5～9、20～40℃的条件下，进行3～60天培养。
另外，在培养中根据需要，在培养基中也可以添加卡那霉素、潮霉素等抗生素。
如上所述，按照通常的培养方法培养来自具有插入了编码本发明多肽的DNA的重组DNA的微生物、动物细胞、或者植物细胞的转化体，生成该蛋白质并积累，通过从该培养物采集该蛋白质，可以制造该蛋白质。
作为基因的表达方法，除直接表达以外，还可以按照Molecular Cioning第2版中记载的方法等，进行分泌生产、融合蛋白表达等。
作为本发明的蛋白质的生产方法，有在宿主细胞内生产的方法、在宿主细胞外分泌的方法、或者在宿主细胞外膜上生产的方法，通过改变所使用的宿主细胞或所生产的蛋白质的结构，可以选择该方法。
在本发明的蛋白质在宿主细胞内或者在宿主细胞外膜上生产时，使用Paulson等的方法〔J.Biol.Chem.，263，17619(1989)〕、Lowe等的方法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，8227(1989)、Genes Develop.，4，1288(1990)〕、或者使用特开平5-336963、特开平6-823021等中记载的方法，就能够在宿主细胞外积极地分泌蛋白质。
即，使用基因重组技术，通过使之以在包含本发明蛋白质的活性部位的多肽这边添加信号肽的形式进行表达，就能够在宿主细胞外积极地分泌本发明的蛋白质。
另外，按照特开平2-227075中记载的方法，利用使用二氢叶酸还原酶基因等的基因扩增系统，也能够使产量上升。
而且，通过使已导入基因的动物或者植物的细胞进行再分化，构建基因导入的动物个体(非人转基因动物)或者植物个体(转基因植物)，使用这些个体也能够制造本发明的蛋白质。
在转化体是动物个体或者植物个体时，按照通常的方法进行饲养或者栽培，使该蛋白质生成并积累，从该动物个体或者植物个体采集该蛋白质，就可以制造该蛋白质。
作为使用动物个体制造本发明的蛋白质的方法，例如可举出在按照公知的方法〔Am. J.Clin.Nutr.，63，639S(1996)、Am.J.Clin.Nutr.，63，627S(1996)、Bio/Technology，9，830(1991)〕，导入基因而构建的动物中生产本发明的蛋白质的方法。
在使用动物个体的情况下，例如饲养导入了编码本发明蛋白质的DNA的非人转基因动物，使该蛋白质在该动物中生成并积累，从该动物中采集该蛋白质，就可以制造该蛋白质。作为该动物中的生成、积累场所，例如可举出该动物的乳(特开昭63-309192)、卵等。作为此时使用的启动子，只要是在动物中能够表达的启动子，都可以使用，例如适合使用是乳腺细胞特异的启动子即α酪蛋白启动子、β酪蛋白启动子、β乳球蛋白启动子、乳清酸性蛋白启动子等。
作为使用植物个体来制造本发明的蛋白质的方法，例如可举出按照公知的方法〔组织培养(日文)，20(1994)，组织培养(日文)，21(1995)，TrendsBiotechnol.，15，45(1997)〕栽培导入了编码本发明蛋白质的DNA的转基因植物，在该植物中生成并积累该蛋白质，从该植物中采集该蛋白质，来生成该蛋白质的方法。
为了分离纯化由本发明的转化体制成的蛋白质，可以使用通常的酶的分离纯化法。例如本发明的蛋白质是在细胞内以溶解状态进行表达时，在培养结束后，利用离心分离来回收细胞，悬浮在水系缓冲液中后，利用超声波破碎机、法式压碎机、Monton Gaulin均化器、Dyno磨碎积将细胞破碎，得到无细胞提取液。从利用离心分离该无细胞提取液得到的上清液，使用通常的酶的离析纯化法，即单独使用或者组合使用溶剂萃取法、利用硫酸铵的盐析法、脱盐法、利用有机溶剂的沉淀法、使用二乙氨乙基(DEAE)琼脂糖(Sepharose)、DIAIONHPA-75(三菱化成公司制)等树脂的阴离子交换层析法、使用S-Sepharose FF(Pharmacia公司制)等树脂以阳离子交换层析法、使用丁基琼脂糖(Sepharose)、苯基琼脂糖(Sepharose)等树脂的疏水性层析法、使用分子筛的凝胶过滤法、亲和层析法、层析聚焦法、等电点电泳等电泳法等方法，可以得到纯化标准品。
在该蛋白质在细胞内形成不溶体进行表达时，同样将细胞回收后，进行破碎，通过离心分离，作为沉淀级分，回收蛋白质的不溶体。用蛋白质改性剂将回收的蛋白质的可不溶体可溶化。将该可溶化液稀释或者透析，通过使该溶化液中的蛋白质改性剂的浓度下降，使该蛋白质回到正常的立体结构。在该操作后，利用和上述相同的离析纯化法，可以得到该蛋白质的纯化标准品。
本发明的蛋白质、或者在该蛋白质上添加糖类的蛋白质等的衍生物，在细胞外分泌时，可以在培养上清液中回收该蛋白质或者该蛋白质的衍生物。即，通过利用和上述相同的离心分离等方法处理该培养物，获得培养上清液，使用和上述相同的离析纯化法，可以从该培养上清液得到纯化标准品。
作为这样获得的蛋白质，例如可举出具有序列号2记载的氨基酸序列的蛋白质。
另外，利用Fmoc法(芴基甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等化学合成法，也可以制造本发明的蛋白质。另外，使用Advanced ChemTech公司、Perkin-Elmer公司、Pharmacia公司、Protein Technology Instrument公司、Synthecell-Vega公司、PerSeptive公司、岛津制作所等的肽合成仪，也能够进行化学合成。
〔3〕含岩藻糖的糖类的调制以通过上述〔2〕记载的培养得到的转化体的培养液和对该培养液进行各种处理得到的培养液的处理物作为酶源使用，在水性介质中能够制造含岩藻糖的糖类。
作为培养液的处理物，可举出培养液的浓缩物、培养液的干燥物、离心分离培养液得到的菌体、该菌体的干燥物、该菌体的冷冻干燥物、该菌体的表面活性剂处理物、该菌体的超声波处理物、该菌体的机械磨碎处理物、该菌体的溶剂处理物、该菌体的酶处理物、该菌体的蛋白质级分物、该菌体的固定化物或者从该菌体提取而得到的酶标准品等。
以在37℃、1分钟能够生成1μmol含岩藻糖的糖类的活性作为1单位(U)，在含岩藻糖的糖类的生成中使用的酶源是0.1mU/L～10000U/L，最好以1mU/L～1000U/L的浓度使用。
作为在含岩藻糖的糖类的生成中使用的水性介质，可举出水，磷酸盐、碳酸盐、乙酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐、Tris等的缓冲液，甲醇、乙醇等醇类，乙酸乙酯等酯类，丙酮等酮类，乙酰胺等酰胺类等。另外，可以使用以作为酶源使用的微生物的培养液作为水性介质。
在含岩藻糖的糖类的生成中，根据需要，也可以添加表面活性剂或者有机溶剂。作为表面活性剂，聚氧化乙烯十八烷基胺(例如Nymeen S-25，日本油脂公司制)等非离子表面活性剂、十六烷基三甲基溴化铵或烷基二甲苄基氯化铵(例如CationF2-40E、日本油脂公司制)等阳离子表面活性剂、月桂酰肌氨酸盐等阴离子表面活性剂、烷基二甲基胺(例如叔胺FB，日本油脂公司制)等叔胺类等只要是促进含岩藻糖的糖类生成的表面活性剂都可以，可以使用1种，或者也可以混合数种使用。表面活性剂，通常以0.1～50g/L的浓度使用。作为有机溶剂，可举出二甲苯、甲苯、脂肪醇、丙酮、乙酸乙酯等，通常以0.1～50g/L的浓度使用。
作为在含岩藻糖的糖类的生成中使用的糖核苷酸底物即鸟苷二磷酸岩藻糖(GDP-Fuc)，除市售品以外，还可以使用利用微生物等的活性生成的反应液或者从该反应液进行纯化得到的物质。
该糖核苷酸底物以0.1～500mmol/L的浓度使用。
作为在该含岩藻糖的糖类的生成中使用的接纳体糖类，只要是成为糖转移酶的底物的接纳体糖类，都可以使用，例如除了乳糖、N-乙酰基乳糖胺、Lewis X、Lewis a、Galβ1-4〔Fucα1，3〕GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc(LNFPIII)以外，还可以例示出在非还原末端具有半乳糖或者N-乙酰基乳糖胺结构的10个单糖以下的寡糖等。
该接纳体糖类以0.1～500mmol/L的浓度使用。
在该生成反应中，根据需要，可以添加MnCl2等无机盐、β-巯基乙醇等。
含岩藻糖的糖类的生成反应，在水性介质中，在pH5～10、优选pH6～8，20～50℃的条件下进行1～96小时。
可以按照公知的方法〔化学和工业(日文)，43，953(1990)〕进行在水性介质中生成的含岩藻糖的糖类的定量。
在反应液中生成的含岩藻糖的糖类的采集，可以按照使用活性炭或离子交换树脂等的通常方法进行，例如，在2’-岩藻糖基乳糖的情况下可以按照J.Org.Chem.，47，5416(1982)中记载的方法进行。
作为这样得到的含岩藻糖的糖类，可例示出岩藻糖基乳糖、岩藻糖基N-乙酰基乳糖胺、Lewis Y、Lewis b等。
附图的简要说明
图1示出α1，2-岩藻糖转移酶基因表达质粒pGT35的结构。图中，Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Ptrp表示trp启动子，FTS表示α1，2-岩藻糖转移酶基因。
图2表示glk、manB、manC表达质粒pNk11的构建过程。图中，Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，PL表示PL启动子，cI857表示cI857阻抑物，glk表示葡糖激酶基因，manB表示磷酸甘露糖变位酶基因，manC表示甘露糖-1-磷酸鸟苷酸转移酶基因。
图3表示gmd表达质粒pGE19的构建过程。图中，Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Ptrp表示Trp启动子，Plac表示lac启动子，gmd表示GDP-甘露糖-4，6-脱水酶基因。
图4表示wcaG表达质粒pGE8的构建过程。图中，Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，PL表示PL启动子，cI857表示cI857阻抑物，wcaG表示GKDM差向异构酶/还原酶基因。
以下，说明本发明的实施例，但本发明不受这些实施例的限制。
实施发明的最佳方式实施例1 α1，2-岩藻糖转移酶表达株的构建作为α1，2-岩藻糖转移酶的氨基酸序列，选择序列号2记载的氨基酸序列表示的幽门螺旋杆菌(UA802)的α1，2-岩藻糖转移酶氨基酸序列(GenBankAF076779)，考虑大肠杆菌的密码子的使用频率〔Codon Usage databasa atkazusa(http/www.kazusa.or.jp/codon)〕，转换成以使用频率最高的密码子构成的DNA序列，设计成序列号1表示的DNA序列。基于已设计成的碱基序列，使用PerSeptive Biosystems公司制8905型DNA合成装置，合成序列号3至序列号16记载的DNA，以使相邻的合成DNA相互具有20个碱基的重复序列，而且这些序列有义链和反义链成为交错的。另外，也同样地合成在末端包含用于向载体克隆的限制酶识别序列的序列号17和18记载的DNA。
在由50μl的16mmol/L硫酸铵、10mmol/L氯化钾、1mmol/L氯化镁、20mmol/L Tris-盐酸(pH8.0)、0.1％Triton X-100、0.001％BSA、200μmol/LdNPSs、及2.5单位的KOD DNA聚合酶(东洋纺公司制)组成的缓冲液中添加各DNA，以使终浓度成为0.02μmol/L，用50μl的矿物油覆盖，放置在DNA循环变温加热仪(PJ480，PERKIN ELMER公司制)上，进行30次的94℃下30秒、50℃下30秒、74℃下60秒的循环，获得约0.9kb的PCR产物。
用限制酶Cla I和HindIII切断0.5μg的该PCR产物后，与用限制酶Cla I和Hin dIII切断的pBluescriptII SK(+)DNA0.2μg(Stratagene公司制)一起使用连接试剂盒(宝酒造公司制)，在16℃进行16小时的连接反应。
使用该连接反应液，按照上述的公知方法，对大肠埃希氏杆菌NM522株进行转化，在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基〔细菌胰蛋白胨(DifcoLaboratories公司制)10g/L、酵母提取物(Difco Laboratories公司制)5g/L、NaCl 5g/L(pH7.2)、琼脂15g/L〕上涂布该转化体，在30℃培养过夜。
从生长出的转化体的菌落，按照常规方法提取质粒，得到质粒pGT32。
接着，用限制酶Cla I和SacI切断0.5μg得到的质粒pGT32后，用琼脂糖凝胶电泳分离的约0.9kb的ClaI-SacI DNA片段与0.2μg用限制酶Cla I和SacI切断的pTrS30(宝酒造公司制)一起使用接试剂盒(宝酒造公司制)，在16℃，进行16小时的连反应。
使用该连接反应液，按照上述的公知方法，对大肠埃希氏杆菌NM522株进行转化，在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基〔细菌胰蛋白胨(DifcoLaboratories公司制)10g/L、酵母提取物(Difco Laboratories公司制)5g/L、NaCl 5g/L(pH7.2)、琼脂15g/L〕上涂布该转化体，在30℃培养一夜。
从生长出的转化体的菌落，按照常规方法提取质粒，得到质粒pGT35。分析该质粒的结构，具有在质粒pTrS30的Cla I和SacI位点插入了0.9kb的全合成的DNA片段的如
图1所示的结构。
在确定该0.9kb插入片段的DNA碱基序列时，看到像序列表的序列号1所示的可读框(ORF)。
使用上述得到的质粒pGT35，按照公知的方法，对大肠埃希氏杆菌NM522株进行转化，在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上涂布该转化体后，在30℃培养一夜。通过选择生长出的转化体，得到α1，2-岩藻糖转移酶基因表达株即大肠埃希氏杆菌NM522/pGT35。
实施例2 glk、manB、manC、pgm、pfkB基因表达株的构建使用PerSeptive Biosystems公司制8905型DNA合成仪，合成序列号9记载的DNA引物和序列号20记载的DNA。
以上述合成DNA作为引物组使用，以含有glk基因的质粒pNT46(WO98/12343)DNA作为模板进行PCR。使用含有pNT46 DNA 1ng、引物各0.5μmol/L、Pfu DNA聚合酶(Stratagene公司制)2.5单位、Pfu DNA聚合酶用×10缓冲液(Stratagene公司制)4μl、deoxy NTP各200μmol/L的反应液40μl，通过使94℃下1分钟、42℃下2分钟、72℃下3分钟的工序反复30次，来进行PCR。
将该反应液的1/10量进行琼脂糖凝胶电泳，确认目的的片段扩增后，添加和残留的反应液等量的TE〔10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、1mmol/L EDTA〕饱和苯酚/氯仿(1体积/1体积)，进行混合。
将该混合液离心分离后，在得到的上层中加入2倍容量的冷乙醇，进行混合，在-80℃放置30分钟。离心分离该放置液，得到DNA的沉淀。
在20μl的TE中溶解该DNA沉淀。使用该溶解5μl，用限制酶Bgl II和SalI切断DNA，利用琼脂糖凝胶电泳使DNA片段分离后，使用基因纯化II试剂盒(Gene Clean II Kit)回收含有glk基因的1.3kb的DNA片段。
用限制酶BamH I和SalI切断manB和manC表达质粒pNK7(WO98/12343)0.2μg后，利用琼脂糖凝胶电泳使DNA片段分离，同样地回收8.2kb的片段。
使用连接试剂盒，使该1.3kb和8.2kb的片段在16℃进行16小时的连接反应。使用该连接反应液，按照上述的公知方法，对大肠埃希氏杆菌NM522进行转化，在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上涂布该转化体后，在30℃培养过夜。
按照上述公知的方法，从生长出的转化体的菌落，提取质粒，得到glk、manB、manC基因表达质粒pNK11。利用限制酶消化确认该质粒的结构(图2)。
使用上述得到的质粒pNK11 DNA，按照公知的方法，对大肠埃希氏杆菌NM522/pNT55株(WO98/12343)进行转化，在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂培养基上涂布该转化体后，在30℃培养过夜。通过选择生长出的转化体，得到glk、manB、manC、pgm、pfkB基因同时表达株大肠埃希氏杆菌NM522/pNK11/pNT55。
实施例3 来自大肠埃希氏杆菌的gmd基因表达株的构建按照Current Protocois in Molecuiar Biology中记载的方法，将大肠埃希氏杆菌W3110(ATCC27325)株培养后，将该微生物的染色体DNA分离纯化。
以使用PerSeptive Biosystems公司制8905型DNA合成仪合成的序列号21和22记载的DNA作为引物组使用，以0.1μg大肠埃希氏杆菌W3110(ATCC27325)株的染色体DNA作为模板，按照实施例1记载的方法进行PCR反应。
将该反应液的1/10量进行琼脂糖凝胶电泳，在确认目的的片段扩增后，添加和残留的反应液等量的TE饱和苯酚/氯仿，进行混合。
离心分离该混合液后，在得到的上层中加入2倍容量的冷乙醇，进行混合，在-80℃放置30分钟。离心分离该放置液，得到DNA的沉淀。
使该DNA的沉淀溶解于20μl的TE中。使用5μl该溶解液，用限制酶Hin dIII和Xba I切断DNA，利用琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段后，利用Gene Clean II试剂盒回收含有gmd基因的1.1kb的DNA片段。
以使用PerSeptive Biosystems公司制8905型DNA合成仪合成的具有序列号23和24所示的碱基序列的DNA作为引物组使用，以含有trp启动子的质粒pTrS30(FERM BP-5407)作为模板，按照实施例1记载的方法进行PCR反应。
将该反应液的1/10量进行琼脂糖凝胶电泳，在确认目的的片段扩增后，添加和残留的反应液等量的TE饱和苯酚/氯仿，进行混合。
离心分离该混合液后，在得到的上层中加入2倍容量的冷乙醇，进行混合，在-80℃放置30分钟。离心分离该放置液，得到DNA的沉淀。
使该DNA的沉淀溶解于20μl的TE中。使用5μl该溶解液，用限制酶Eco RI和Xba I切断DNA，利用琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段后，同样地回收0.4kb的DNA片段。
用限制酶EcoRI和HindIII切断pBluescriptII SK+0.2μg后，利用琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，同样回收3.0kb的DNA片断。
使用连接试剂盒对该1.1kb、0.4kb和3.0kb的片段在16℃进行16小时的连接反应。
使用该连接反应液，按照上述的公知方法，对大肠埃希氏杆菌NM522株进行转化，在含有50μg/L氨苄青霉素的LB琼脂培养基上涂布该转化体后，在30℃培养过夜。
按照上述的公知方法，从生长出的转化体的菌落提取质粒，得到表达质粒pGE19。利用限制酶消化确认该质粒的结构(图3)。
实施例4 来自大肠埃希氏杆菌的wcaG基因表达株的构建以使用PerSeptive Biosystems公司制8905型DNA合成仪合成的序列号25和26记载的DNA作为引物组使用，以大肠埃希氏杆菌W3110(ATCC2735)株作为模板，按照实施例1记载的方法进行PCR反应。
将该反应液的1/10量进行琼脂糖凝胶电泳，在确认目的的片段扩增后，添加和残留的反应液等量的TE饱和苯酚/氯仿，进行混合。
离心分离该混合液后，在得到的上层中加入2倍容量的冷乙醇，进行混合，在-80℃放置30分钟。离心分离该放置液，得到DNA的沉淀。
使该DNA的沉淀溶解于20μl的TE中。使用5μl该溶解液，用限制酶Cla I和Xho I切断DNA，利用琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段后，使用基因纯化II试剂盒回收含有wcaG基因的1.0kb的DNA片段。
用限制酶Cla I和Sal I切断0.2μg的pPAC31后，利用琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，同样地回收5.2kb的DNA片段。
使用连接试剂盒，使该1.0kb和5.2kb的片段在16℃进行16小时的连接反应。
使用该连接反应液，按照上述的公知方法，对大肠埃希氏杆菌NM522株进行转化，在含有50μg/L氨苄青霉素的LB琼脂培养基上涂布该转化体后，在30℃培养一夜。
按照上述的公知方法，从生长出的转化体的菌落提取质粒，得到表达质粒pGE8。利用限制酶消化确认该质粒的结构(图4)。
实施例5 2’-岩藻糖基乳糖的生产(1)将实施例1得到的大肠埃希氏杆菌NM522/pGT35株接种在加入了含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基8ml的粗型试管中，在28℃培养17小时。将该培养液以1％接种在加入了含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基8ml的粗型试管中，在37℃培养5小时。离心分离该培养液，得到湿菌体。根据需要，该湿菌体可以在-20℃保存，在使用前可以解冻后使用。
在由该湿菌体(0.1ml左右)、50mM柠檬酸缓冲液(pH7.0)、10mmol/LMnCl2、10mmol/L乳糖、10mmol/LGDP-Fuc、0.4％Nymeen S-215组成的0.1ml反应液中。在37℃进行24小时反应。
反应结束后，使用Dionex公司制糖分析装置(DX-500)分析反应产物，证实在反应液中生成积累了0.82mmol/L(400mg/L)的2’-岩藻糖基乳糖。
实施例6 2’-岩藻糖基乳糖的生产(2)将实施例1得到的大肠埃希氏杆菌NM522/pGT35株接种在加入了含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基125ml的1L容积带隔板的锥形瓶中，在28℃、220rpm条件下培养17小时。将该培养液125ml接种在加入了含有50mg/L的氨苄青霉素的M9培养基2.5L的5L容积培养槽中，在37℃、600rpm、通气量2.5L/min的条件下培养6小时。在培养中，用28％氨水使培养液的pH维持在7.0，根据需要，添加葡萄糖。离心分离该培养液，得到湿菌体。根据需要，该湿菌体可以在-20℃保存，在使用前可以解冻后使用。
将实施例2得到的大肠埃希氏杆菌NM522/pNK11/pNT55株接种在加入了含有50μg/ml氨苄青霉素和10μg/ml氯霉素的LB培养基〔10g/L细菌胰蛋白胨(Difco Laboratories公司制)、5g/L酵母提取物(Difco Laboratories公司制)、5g/L NaCl(pH7.3)〕125ml的1L容积带隔板的锥形瓶中，在28℃、220rpm条件下培养17小时。将该培养液125ml接种在加入了含有50mg/L氨苄青霉素和10mg/L氯霉素的TB培养基〔10g/L葡萄糖、12g/L细菌胰蛋白胨(DifcoLaboratories公司制)、24g/L酵母提取物(Difco Laboratories公司制)、2.3g/LKH2PO4、12.5g/L K2HPO4(pH未调整)〕2.5L的5L容积培养槽中，在30℃、600rpm、通气量2.5L/min的条件下培养4小时后，再在40℃培养3小时。在培养中，用28％氨水使培养液的pH维持在7.0，根据需要，添加葡萄糖。离心分离该培养液，得到湿菌体。根据需要，该湿菌体可以在-20℃保存，在使用前可以解冻后使用。
将实施例3得到的大肠埃希氏杆菌NM522/pGE19株接种在加入了含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基125ml的1L容积带隔板的锥形瓶中，在28℃，在220rpm条件下培养17小时。将该培养液125ml接种在加入了含有50μg/ml氨苄青霉素的TB培养基2.5L的5L容积培养槽中，在37℃、600rpm、通气量2.5L/min的条件下培养6小时。在培养中，用28％氨水使培养液的pH维持在7.0，根据需要，添加葡萄糖。离心分离该培养液，得到湿菌体。根据需要，该湿菌体可以在-20℃保存，在使用前可以解冻后使用。
将实施例4得到的大肠埃希氏杆菌NM522/pGE8株接种在加入了含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基125ml的1L容积带隔板的锥形瓶中，在28℃，在220rpm条件下培养17小时。将该培养液125ml接种在加入了含有50μg/ml氨苄青霉素的TB培养基2.5L的5L容积培养槽中，600rpm、通气量2.5L/min的条件下，在30℃培养4小时后，再在40℃培养3小时。在培养中，用28％氨水使培养液的pH维持在7.0，根据需要，添加葡萄糖。离心分离该培养液，得到湿菌体。
将产氨棒状杆菌ATCC21170株接种在加入了25ml液体培养基的300ml容积带隔板的锥形瓶中，该培养基由50g/L葡萄糖、10g/L聚蛋白胨(polypeptone，日本制药公司制)、10g/L酵母提取物(Oriental酵母公司制)、5g/L尿素、5g/L (NH4)2SO4、1g/L KH2PO4、3g/L K2HPO4、1g/L MgSO4·7H2O、0.1g/L CaCl2·2H2O、10mg/L FeSO4·7H2O、10mg/L ZnSO4·7H2O、20mg/L MnSO4·4～6H2O、20mg/L L-半胱氨酸、10mg/L D-泛酸钙、5mg/L维生素B1、5mg/L烟酸和30μg/L生物素(用10mol/L NaOH调整成pH7.2)组成。在28℃、220rpm的条件下培养24小时。
将20ml该培养液接种在加入了和上述同一组成的250ml培养基的2L容积带隔板锥形瓶中，在28℃、220rpm的条件下培养24小时。以得到的培养液作为种培养液使用。
将250ml该种培养液接种在加入了2.25L液体培养基的5L容积培养槽中，该液体培养基由150g/L葡萄糖、5g/L肉膏(极东制药公司制)、10g/L KH2PO4、10g/L K2HPO4、10g/L MgSO4·7H2O、0.1g/L CaCl2·2H2O、20mg/L FeSO4·7H2O、10mg/LZnSO4·7H2O、20mg/L MnSO4·4～6H2O(另外灭菌)、15mg/L β丙氨酸(另外灭菌)、20mg/L L-半胱氨酸、100μg/L生物素、2g/L尿素和5mg/L维生素B1(另外灭菌)(用10mol/L NaOH调整成pH7.2)组成。在32℃、600rpm、通气量2.5L/min的条件下进行24小时培养。在培养中，用28％氨水使培养液的pH维持在6.8。
离心分离该培养液，得到湿菌体。根据需要，该湿菌体可以在-20℃保存，在使用前可以解冻后使用。
在200ml容积的烧瓶中加入由25g/L大肠埃希氏杆菌NM522/pNK11/pNT55株湿菌体、15g/L大肠埃希氏杆菌NM522/pGE19株湿菌体、15g/L大肠埃希氏杆菌NM522/pGE8株湿菌体、50g/L大肠埃希氏杆菌NM522/pGT35株湿菌体、150g/L产氨棒状杆菌ATCC21170、100g/L果糖、30g/L甘露糖、100g/L乳糖、30g/L GMP、25g/L KH2PO4、5g/L MgSO4·7H2O、5g/L植酸、4g/L Nymeen S-215、10ml/L二甲苯组成的反应液30ml，用电磁搅拌器搅拌(900rpm)该反应液，在32℃进行48小时反应。在反应中，用4mol/L NaOH，使该反应液的pH维持在7.2。根据需要，添加果糖、KH2PO4。
反应结束后，使用HPLC分析反应产物，证实了在反应液中生成并累积了13.4g/L的2’-岩藻糖基乳糖。
实施例7 乳-N-新二岩藻己糖I的生产将实施例1得到的大肠埃希氏杆菌NM522/pGT35株接种在加入了含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基8ml的粗型试管中，在28℃培养17小时。
将培养液接种在加入了含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基8ml的粗型试管中，在37℃培养5小时。
离心分离0.1ml该培养液，得到湿菌体。根据需要，该湿菌体可以在-20℃保存，在使用前可以解冻后使用。
在含有该湿菌体(0.1ml份)、50mmol/L柠檬酸缓冲液(pH7.0)、10mmol/LMnCl2、10mmol/L GDP-Fuc、0.4％Nymeen S-215和乳-N-新岩藻戊糖III(LNFPIII)10mmol/L的反应液中，在37℃下进行24小时反应反应结束后，使用Dionex公司制糖分析装置(DX-500)分析反应产物，证实了在反应液中生成并累积了2.9mmol/L(1.4g/L)的乳-N-新二岩藻己糖I。
产业上的应用可能性按照本发明，利用基因重组技术大量生产α1，2-岩藻糖转移酶基因成为可能。另外，由于使用该酶，能够高效率地制造α1，2-岩藻糖基乳糖等的含岩藻糖的糖类。
未列入正文的序列序列号1-人工序列的说明合成DNA序列号3-人工序列的说明合成DNA序列号4-人工序列的说明合成DNA序列号5-人工序列的说明合成DNA序列号6-人工序列的说明合成DNA序列号7-人工序列的说明合成DNA序列号8-人工序列的说明合成DNA序列号9-人工序列的说明合成DNA序列号10-人工序列的说明合成DNA序列号11-人工序列的说明合成DNA序列号12-人工序列的说明合成DNA序列号13-人工序列的说明合成DNA序列号14-人工序列的说明合成DNA序列号15-人工序列的说明合成DNA序列号16-人工序列的说明合成DNA序列号17-人工序列的说明合成DNA序列号18-人工序列的说明合成DNA序列号19-人工序列的说明合成DNA序列号20-人工序列的说明合成DNA序列号21-人工序列的说明合成DNA序列号22-人工序列的说明合成DNA序列号23-人工序列的说明合成DNA序列号24-人工序列的说明合成DNA序列号25-人工序列的说明合成DNA序列号26-人工序列的说明合成DNA
权利要求
1.一种DNA，具有下述碱基序列，即在编码来自幽门螺旋杆菌的具有α1，2-岩藻糖转移酶活性的蛋白质的DNA中，从存在于该DNA中的〔a〕Poly-C序列、〔b〕类似TAA的重复序列、〔c〕AAAAAAG序列中选择的碱基序列中，有1个以上碱基序列中的1个以上碱基缺失、取代或者添加得到的碱基序列，而且该DNA编码具有α1，2-岩藻糖转移酶活性的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的DNA，其中取代是修饰成在表达权利要求1所述的DNA的宿主细胞中使用频率高的密码子的取代。
3.一种DNA，具有下述碱基序列，即在编码来自幽门螺旋杆菌的具有α1，2-岩藻糖转移酶活性的蛋白质的DNA中，将1个以上的密码子修饰成在表达该DNA的宿主细胞中使用频率高的密码子而得到的碱基序列。
4.根据权利要求3所述的DNA，其中，修饰是从存在于编码来自幽门螺旋杆菌的具有α1，2-岩藻糖转移酶活性的蛋白质的DNA中的〔a〕Poly-C序列、〔b〕类似TAA的重复序列、〔c〕AAAAAAG序列中选择的碱基序列中，1个以上碱基序列中的修饰。
5.根据权利要求3所述的DNA，该DNA具有下述碱基序列，所述的碱基序列是在编码来自幽门螺旋杆菌的具有α1，2-岩藻糖转移酶活性的蛋白质的DNA中，全部密码子被修饰成在表达该DNA的宿主细胞中使用频率高的密码子而得到的碱基序列。
6.序列号1记载的碱基序列表示的DNA。
7.一种DNA，是由序列号1记载的碱基序列表示的DNA中，1个以上碱基缺失、取代或者添加得到的碱基序列构成，而且编码具有α1，2-岩藻糖转移酶活性的蛋白质。
8.一种重组DNA，通过将从权利要求1～7中的任一项所述的DNA中选择的DNA连接在载体上得到。
9.一种转化体，通过将权利要求8所述的重组DNA导入宿主细胞中得到。
10.根据权利要求9所述的转化体，其特征在于，宿主细胞是微生物。
11.根据权利要求10所述的转化体，其特征在于，微生物是属于埃希氏杆菌属的微生物。
12.根据权利要求11所述的转化体，其特征在于，属于埃希氏杆菌属的微生物是大肠埃希氏杆菌。
13.具有α1，2-岩藻糖转移酶活性的蛋白质的制造方法，其特征在于，在培养基中培养从权利要求9～12中的任一项所述的转化体中选择的转化体，在该培养物中生成具有α1，2-岩藻糖转移酶活性的蛋白质并积累，从该培养物中采集该蛋白质。
14.含岩藻糖的糖类的制造方法，其特征在于，使用从权利要求9～12中的任一项所述的转化体中选择的转化体的培养液或者该培养液的处理物作为酶源，使该酶源、接纳体糖类和鸟苷二磷酸岩藻糖(以下，简称为GDP一岩藻糖)存在于水性介质中，在该水性介质中通过α1，2键使岩藻糖转移到接纳体糖类上，生成含岩藻糖类的糖类并积累，从该水性介质中采集含岩藻糖的糖类。
15.根据权利要求14所述的含岩藻糖的糖类的制造方法，其特征在于，包括以具有从鸟苷-5’-三磷酸(以下，简称为GTP)的前体物质生成GTP能力的微生物的培养液或者该培养液的处理物、具有从糖和GTP生成GDP-岩藻糖能力的微生物的培养液或者该培养液的处理物、以及从权利要求9～12中的任一项所述的转化体中选择的转化体的培养液或者该培养液的处理物作为酶源使用，使这些酶源、上述前体物质、糖和接纳体糖类存在于水性介质中，在该水性介质中生成含岩藻糖的糖类并积累，从该水性介质中采集含岩藻糖的糖类。
16.根据权利要求14或者15所述的含岩藻糖的糖类的制造方法，其中，接纳体糖类是在非还原末端具有半乳糖的包含10个单糖以下的寡糖的糖类。
17.根据权利要求16所述的含岩藻糖的糖类的制造方法，其特征在于，寡糖是乳糖、N-乙酰乳糖胺、Lewis X、或者Lewis a。
18.根据权利要求15所述的含岩藻糖的糖类的制造方法，其特征在于，含岩藻糖的糖类是岩藻糖基乳糖、岩藻糖基N-乙酰乳糖胺、Lewis Y、或者Lewis b。
19.根据权利要求14或15所述的含岩藻糖的糖类的制造方法，其中，培养液的处理物是从培养液的浓缩物、培养液的干燥物、用离心分离培养液得到的菌体、该菌体的干燥物、该菌体的冷冻干燥物、该菌体的表面活性剂处理物、该菌体的超声波处理物、该菌体的机械磨碎物、该菌体的溶剂处理物、该菌体的酶处理物、该菌体的蛋白质级分物、该菌体的固定化物或者从该菌体中提取而得到的酶标标准品。
20.根据权利要求15所述的含岩藻糖的糖类的制造方法，其中，前体物质是鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤、鸟苷、黄苷、肌苷、鸟苷-5’-一磷酸、黄苷-5’-一磷酸、或者肌苷-5’-一磷酸。
21.根据权利要求15所述的含岩藻糖的糖类的制造方法，其中，糖是从葡萄糖、果糖和甘露糖中选择的糖。
22.根据权利要求15所述的含岩藻糖的糖类的制造方法，其中，具有从前体物质生成GTP能力的微生物是从属于棒状杆菌属的微生物中选择的微生物。
23.根据权利要求22所述的含岩藻糖的糖类的制造方法，其中，属于棒状杆菌属的微生物是产氨棒状杆菌。
24.根据权利要求15所述的含岩藻糖的糖类的制造方法，其中，具有从糖和GTP生成GDP-岩藻糖能力的微生物由1种以上的微生物构成。
25.根据权利要求24所述的含岩藻糖的糖类的制造方法，其中，微生物是从属于埃希氏杆菌属或者棒状杆菌属的微生物中选择的微生物。
26.根据权利要求25所述的含岩藻糖的糖类的制造方法，其中，属于埃希氏杆菌属的微生物是大肠埃希氏杆菌。
27.根据权利要求25所述的含岩藻糖的糖类的制造方法，其中，属于棒状杆菌属的微生物是产氨棒状杆菌。
28.根据权利要求15所述的含岩藻糖的糖类的制造方法，其中，具有从糖和GTP生成GDT-岩藻糖能力的微生物是从葡糖激酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷酸转移酶、葡萄糖磷酸变位酶、果糖磷酸激酶、GDP-甘露糖4，6-脱水酶以及GKDM差向异构酶/还原酶中选择的1种以上的酶活性强的微生物。
29.根据权利要求28所述的含岩藻糖的糖类的制造方法，其中，微生物由1种以上的微生物构成，该微生物含有DNA片段和载体构成的重组DNA，该DNA片段含有从编码葡糖激酶的基因-glk基因、编码磷酸甘露糖变位酶的基因-manB基因、编码甘露糖-1-磷酸鸟苷酸转移酶的基因-manC基因、编码磷酸葡萄糖变位酶的基因-pgm基因、编码果糖磷酸激酶的基因-pfk基因、编码GDP-甘露糖4，6-脱水酶的基因-gmd基因以及编码GKDM差向异构酶/还原酶的基因-wcaG基因中选择的1种以上的基因。
30.根据权利要求29所述的含岩藻糖的糖类的制造方法，其中，glk基因、manB基因、manC基因、pgm基因、pfk基因、gmd基因和wcaG基因是来自大肠埃希氏杆菌的基因。
全文摘要
本发明是关于修饰来自幽门螺旋杆菌的α1，2－岩藻糖转移酶基因的碱基序列得到的基因，使用该基因的α1，2－岩藻糖转移酶的制备方法，以及使用表达该酶的微生物制备含岩藻糖的糖类的方法。按照本发明，通过在水性介质中使保持具有从GTP前体物质生产GTP能力的微生物、具有从糖和GTP生产GDP－岩藻糖能力的微生物、以及接纳体糖类进行接触，能够廉价且大量生产含岩藻糖的糖类。
文档编号C12P19/00GK1433467SQ00817450
公开日2003年7月30日 申请日期2000年12月20日 优先权日1999年12月21日
发明者远藤徹夫, 小泉聪司, 田畑和彦, 尾崎明夫 申请人:协和发酵工业株式会社